吳 丹，劉 佳，陳 丹

(四川省廣安市人民醫(yī)院，四川 廣安 638500)

糖尿病性心肌病是糖尿病患者的主要并發(fā)癥，是患者長期高血糖所導(dǎo)致的特異性心肌病變[1]。其發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜和多因素的，包括氧化應(yīng)激增加、鈣處理受損、腎素-血管緊張素系統(tǒng)上調(diào)、底物代謝改變、線粒體功能障礙[2-3]。研究表明，咪達(dá)唑侖對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用[4]，可以改善大鼠心肌氧化應(yīng)激，保護(hù)心肌免受缺血再灌注損傷[5]。在大鼠心肌缺血再灌注損傷的模型中，咪達(dá)唑侖聯(lián)合右美托咪定可以提高蛋白激酶B(Protein kinase B，AKT)的磷酸化水平，起到心肌保護(hù)作用[6]。然而，咪達(dá)唑侖是否可以減輕糖尿病性心肌病中心肌細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激損傷尚不清楚。磷酸肌醇3激酶(Phospoinositide 3-kinase，PI3K)/AKT信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡中起關(guān)鍵作用[7]。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活已被證實(shí)參與了針對(duì)高血糖誘導(dǎo)的心臟損傷的保護(hù)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)探討咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2損傷的影響及PI3K/AKT信號(hào)通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 心肌細(xì)胞H9C2(中科院上海細(xì)胞庫)；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；咪達(dá)唑侖(江蘇恩華藥業(yè)有限公司)；PI3K/AKT特異性抑制劑LY294002(美國Sigma-Aldrich公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)(日本Dojindo公司)；辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(上?？党缮锕?；Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(ECL)(南京凱基公司)；SOD、MAD檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；PVDF膜(美國Bio-Rad公司)；兔抗PI3K單克隆抗體、兔抗磷酸化PI3K(p-PI3K)單克隆抗體、兔抗AKT單克隆抗體、兔抗磷酸化AKT(phospho-AKT，p-AKT)單克隆抗體、兔抗Caspase-3單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將心肌細(xì)胞H9C2在添加10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在5% CO2、95%空氣和37℃培養(yǎng)，每2天換液1次。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將細(xì)胞分為對(duì)照組(給予5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(給予35 mmol/L葡萄糖[10])、高糖+低劑量藥物組(給予5 ng/mL咪達(dá)唑侖和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+中劑量藥物組(給予10 ng/mL咪達(dá)唑侖和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+高劑量藥物組(給予20 ng/mL咪達(dá)唑侖和35 mmol/L葡萄糖)、高糖+LY294002組(給予35 mmol/L葡萄糖和10 μmol/L LY294002[11])、高糖+高劑量藥物+LY294002組(給予20 ng/mL咪達(dá)唑侖、LY294002和35 mmol/L葡萄糖)。各處理組孵育24 h后，收獲細(xì)胞以檢查細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和蛋白表達(dá)。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞活性 將心肌細(xì)胞H9C2以1×104個(gè)/mL的密度接種在96孔板中，在37℃下孵育，并使用CCK-8評(píng)估細(xì)胞活性。根據(jù)1.3中進(jìn)行指定的處理后，將10 μL CCK-8溶液添加到每孔中，然后將96孔板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(OD)值，其平均值用以表示細(xì)胞活性。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡 心肌細(xì)胞H9C2經(jīng)過指定的處理后，收集1×105個(gè)，遵循凋亡檢測試劑盒的步驟，加入500 μL Binding Buffer重懸，之后加入5 μL Annexin V-FITC混勻和5 μL碘化丙啶混勻，室溫黑暗中反應(yīng)，15 min后FACS Calibur流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡。

1.6 Western blot檢測Caspase3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá) 經(jīng)過指定的處理后，收獲心肌細(xì)胞H9C2，并在4℃下用細(xì)胞裂解液裂解30 min，定量后通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白(30 μg)進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在室溫下，用5%的脫脂牛奶將膜封閉60 min，然后與抗Caspase3(1∶1 000稀釋)、抗p-PI3K(1∶1 000稀釋)、抗PI3K(1∶1 000稀釋)、抗p-AKT(1∶1 000稀釋)、抗AKT(1∶1 000稀釋)、抗GAPDH(1∶2 000稀釋)一抗孵育過夜。與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶3 000稀釋)一起孵育，在室溫下放置1.5 h。使用ELC可視化反應(yīng)信號(hào)，之后掃描、ImageJ軟件進(jìn)行分析。以GAPDH為對(duì)照，測定Caspase3、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)。

1.7 比色法測定SOD活性和MDA含量 依照SOD、MDA試劑盒的檢測步驟，心肌細(xì)胞H9C2經(jīng)過指定的處理后，收獲上清液，進(jìn)行SOD活性和MDA含量測定。

2 結(jié)果

2.1 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中凋亡及細(xì)胞活性的影響 CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測結(jié)果顯示(見圖1和表1)，與對(duì)照組相比，高糖組心肌細(xì)胞H9C2的OD值降低，細(xì)胞凋亡率增加，Caspase3蛋白表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。高糖+低劑量藥物組的細(xì)胞活性、凋亡率和Caspase3蛋白表達(dá)相比于高糖組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組或高糖+低劑量藥物組相比，高糖+中、高劑量藥物組心肌細(xì)胞H9C2的細(xì)胞活性逐漸增強(qiáng)，凋亡率逐漸減弱，Caspase3蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與高糖+中劑量藥物組相比，高糖+高劑量藥物組的心肌細(xì)胞H9C2活性升高，凋亡率降低，Caspase3蛋白表達(dá)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

A：對(duì)照組；B：高糖組；C：高糖+低劑量藥物組；D：高糖+中劑量藥物組；E：高糖+高劑量藥物組。圖1 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中凋亡及Caspase3蛋白表達(dá)的影響

表1 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的活性、凋亡及Caspase3蛋白表達(dá)的影響

2.2 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中SOD、MDA水平變化的影響 與對(duì)照組相比，高糖組心肌細(xì)胞H9C2的SOD活性降低，MDA含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。高糖組與高糖+低劑量藥物組的細(xì)胞相比，SOD活性和MDA含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組或高糖+低劑量藥物組相比，高糖+中、高劑量藥物組心肌細(xì)胞H9C2的SOD活性逐漸增強(qiáng)，MDA含量減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與高糖+中劑量藥物組相比，高糖+高劑量藥物組的心肌細(xì)胞SOD活性升高，MDA含量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，見表2)。

表2 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中SOD、MDA水平變化的影響

2.3 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中PI3K/AKT的影響 與對(duì)照組相比，高糖組心肌細(xì)胞H9C2的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高糖+低劑量藥物組內(nèi)p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)相比于高糖組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高糖組或高糖+低劑量藥物組相比，高糖+中、高劑量藥物組心肌細(xì)胞H9C2的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高糖+中劑量藥物組相比，高糖+高劑量藥物組心肌細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而5組細(xì)胞之間的PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，見圖2和表3)。

A：對(duì)照組；B：高糖組；C：高糖+低劑量藥物組；D：高糖+中劑量藥物組；E：高糖+高劑量藥物組。圖2 p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白的表達(dá)

表3 咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中PI3K/AKT的影響

2.4 LY294002減弱咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞活性的影響 CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測結(jié)果顯示(見圖3～5)，與高糖組相比，高糖+LY294002組心肌細(xì)胞H9C2的OD值降低、細(xì)胞凋亡率增加、Caspase3蛋白表達(dá)水平升高，p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平降低；但高糖+高劑量藥物組提高心肌細(xì)胞的OD值，降低細(xì)胞凋亡率，并減少Caspase3蛋白表達(dá)量，增加p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。心肌細(xì)胞H9C2使用20 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖和PI3K/AKT特異性抑制劑LY294002處理后，與高糖+高劑量藥物組相比，高糖+高劑量藥物+LY294002組細(xì)胞的OD值減少、細(xì)胞凋亡率增強(qiáng)、Caspase3蛋白表達(dá)量升高，p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。4組細(xì)胞PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A：高糖組；B：高糖+LY294002；C：高糖+高劑量藥物組；D：高糖+高劑量藥物組+LY294002。圖3 LY294002對(duì)咪達(dá)唑侖作用的高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷凋亡及相應(yīng)蛋白表達(dá)的影響

表4 LY294002減弱咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷凋亡及細(xì)胞活性的影響

表5 PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

2.5 LY294002減弱咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中SOD、MDA的影響 與高糖組相比，高糖+LY294002組心肌細(xì)胞H9C2的SOD活性降低，MDA含量升高；而高糖+高劑量藥物組心肌細(xì)胞的SOD活性增強(qiáng)，MDA含量減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。心肌細(xì)胞H9C2使用20 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖和PI3K/AKT特異性抑制劑LY294002處理后，相比于高糖+高劑量藥物組，高糖+高劑量藥物組+LY294002組降低細(xì)胞的SOD活性，提高M(jìn)DA含量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，見表6)。

表6 高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中SOD、MDA含量的測定

3 討論

本項(xiàng)研究中，使用體外模型評(píng)估了咪達(dá)唑侖對(duì)心肌細(xì)胞高糖損傷的保護(hù)作用，即將心肌細(xì)胞H9C2暴露于高糖，誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，結(jié)果證明了咪達(dá)唑侖對(duì)高糖損傷的心肌細(xì)胞保護(hù)能力，主要表現(xiàn)為細(xì)胞活性的顯著提高，細(xì)胞凋亡的降低，SOD活性的增強(qiáng)和MDA含量的抑制。在對(duì)機(jī)制的初步探索中，發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)暴露于高糖的H9C2細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

長期高血糖和高血糖引起的氧化應(yīng)激是糖尿病性心肌病發(fā)展的主要原因[12]。此外，心臟氧化應(yīng)激與細(xì)胞死亡和心肌纖維化有關(guān)，將導(dǎo)致潛在的致命性心臟事件。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，SOD是抗氧化防御系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，二者可以反映細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷程度。既往研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在糖尿病性心肌病的進(jìn)展中起重要作用[13]。Caspase-3是一種重要的凋亡執(zhí)行蛋白酶，已成為細(xì)胞凋亡研究的重點(diǎn)[14]。本研究中，高糖會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞H9C2活性抑制、凋亡增加和氧化損傷，表明高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9C2損傷，且這種損傷可能與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)。

苯二氮卓衍生物咪達(dá)唑侖是用于鎮(zhèn)靜的最廣泛使用的麻醉劑，Lee等[15]已證明咪達(dá)唑侖對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中高血糖引起的血管滲漏具有預(yù)防作用，可以防止活性氧(ROS)生成。然而其在糖尿病心肌病中的作用尚未明了。本項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，10、20 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖干預(yù)后，高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2的活性升高，細(xì)胞凋亡和Caspase3蛋白表達(dá)降低，抗氧化酶SOD活性增強(qiáng)且脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量減少，這些結(jié)果表明咪達(dá)唑侖具有改善心肌細(xì)胞損傷的功能，它可能通過促進(jìn)細(xì)胞活性，減輕氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡來保護(hù)高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞H9C2損傷。并且，20 ng/mL與10 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖的作用結(jié)果差異顯著，因此后續(xù)選擇20 ng/mL劑量進(jìn)一步研究。

PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、代謝、存活和炎癥的關(guān)鍵。PI3K是血糖調(diào)節(jié)的關(guān)鍵協(xié)調(diào)器，提示其可能參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展[16]。PI3K產(chǎn)生脂質(zhì)第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphophate，PIP3)，從而導(dǎo)致AKT磷酸化。AKT在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與凋亡之間的平衡方面具有重要意義。疏水基序和激活環(huán)上的AKT磷酸化可激活激酶并促進(jìn)細(xì)胞存活[17]。高糖可以抑制PI3K/AKT途徑，而激活PI3K/AKT信號(hào)通路有利于防止高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[18]。有研究表明，咪達(dá)唑侖可以濃度依賴性的誘導(dǎo)B35細(xì)胞中AKT的磷酸化，并降低葡萄糖氧化酶(GOX)誘導(dǎo)的B35神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞免受誘導(dǎo)的ROS損傷[19]。為了確定咪達(dá)唑侖如何調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路并進(jìn)一步調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞損傷，采用Western blot檢測PI3K/AKT通路蛋白水平，發(fā)現(xiàn)高糖刺激后PI3K/AKT途徑的磷酸化水平降低，這與以前的研究一致[20]。值得注意的是，當(dāng)用高糖刺激心肌細(xì)胞H9C2時(shí)，10、20 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖干預(yù)后，心肌細(xì)胞H9C2中p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高，而PI3K和AKT蛋白表達(dá)水平無明顯變化，表明咪達(dá)唑侖可以提高PI3K/AKT信號(hào)通路活性。證明咪達(dá)唑侖在糖尿病性心肌病中發(fā)揮作用的潛在機(jī)理與PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。當(dāng)在心肌細(xì)胞H9C2使用PI3K/AKT信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002時(shí)，與高糖組相比，LY294002處理顯著減少高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2的細(xì)胞活性、SOD活性，明顯增加細(xì)胞凋亡率、Caspase3蛋白表達(dá)量、MDA含量。并且，咪達(dá)唑侖對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性的促進(jìn)作用，以及對(duì)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的抑制作用被LY294002所減弱。綜合這些結(jié)果，說明咪達(dá)唑侖通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路來保護(hù)心肌細(xì)胞免受高糖損傷。

綜上所述，10、20 ng/mL劑量的咪達(dá)唑侖可以提高高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2的細(xì)胞活性，減輕氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡，其保護(hù)心肌細(xì)胞免受高糖損傷的機(jī)制與激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。