黎維維，雷 杰，馬先奎，歐陽陳琳，王 剛

(遵義醫(yī)科大學 藥學院，貴州 遵義 563099)

卷柏屬(Selaginella)植物為多年生草本植物，藥用干燥全草[1]，世界各地分布著700種卷柏屬植物，中國約有60～70種[2]，主要分布在長江以南地區(qū)，在貴州、四川、云南等地都有分布，民間常用的卷柏屬植物有兗州卷柏、中華卷柏、細葉卷柏、小卷柏、墊狀卷柏等[3-4]，卷柏屬植物中的化學成分包括揮發(fā)油、黃酮類、甾類、生物堿等化合物[4-6]，具有抗腫瘤、抗炎[7]、抗氧化[8-9]、抗突變[10]等作用。頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(HS-SPME/GC-MS)是研究揮發(fā)性成分的重要方法[11]。與傳統(tǒng)方法相比，HS-SPME使用涂覆有固定相的熔融石英纖維來實現(xiàn)對揮發(fā)性成分的直接吸附[12]。該技術的優(yōu)點包括：集采樣、提取和分析于一體，操作簡便，縮短了分析時間；樣品消耗低，靈敏度高[13]。因此HS-SPME/GC-MS結合使用對揮發(fā)物能夠進行高效、靈敏和快速的分析。同時，基于NIST數(shù)據(jù)庫搜索，該技術可以實現(xiàn)復雜樣品系統(tǒng)中痕量揮發(fā)性成分的發(fā)現(xiàn)，例如倍半萜、單萜等活性成分。

由于卷柏屬植物種類繁多，外形特征相似，僅靠顯微鑒別等技術無法區(qū)別[14]，需要建立一個科學的質量評價體系。雖然已有學者通過GC-MS技術分析了部分卷柏屬植物的揮發(fā)性成分，但揮發(fā)性成分主要是飽和脂肪烴和飽和脂肪酸，無明顯差異[15]。鑒于卷柏屬植物顯著的藥理活性，有必要深入研究該屬植物的化學成分。[16]

本實驗利用HS-SPME與GC-MS聯(lián)用技術萃取分析兗州卷柏Selaginellainvolvingns(Si)、細葉卷柏Selaginellalabordei(Sl)、墊狀卷柏Selaginellapulvinata(Sp) 揮發(fā)性成分，建立一種快速、無溶劑萃取卷柏屬植物揮發(fā)性成分的方法，并利用GC-MS對3種卷柏屬植物進行比較分析。首先，通過單因素試驗研究不同參數(shù)(萃取頭類型、萃取時間、萃取溫度)對3種樣品揮發(fā)性成分的影響，以獲得最佳萃取條件。采用優(yōu)化后的方法分析評價3種植物揮發(fā)性成分，將獲得的數(shù)據(jù)運用主成分分析(PCA)建立不同卷柏屬植物評價體系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Agilent 6890/5973型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)；手動固相微萃取裝置、SPME手柄、100 μm PD萃取纖維頭、75 μm CAR/PDMS萃取纖維頭、65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭(美國supleco公司)；加熱器(北京康林科技有限公司)；JJY1002型電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)；DEY-400搖擺式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機有限公司)。

兗州卷柏、細葉卷柏、墊狀卷柏采自貴州省遵義市四面山，秋季采收，3種卷柏屬植物經(jīng)遵義醫(yī)科大學張玉金教授鑒定為Selaginellainvolvingns,Selaginellalabordei,Selaginellapulvinata。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗樣品制備 兗州卷柏、細葉卷柏、墊狀卷柏全草在室溫25 ℃下風干后，經(jīng)過粉碎機粉碎，過60目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實驗預處理 在每次進樣之前都需要對萃取頭凈化處理，于250 ℃加熱5 min后再使用。

1.2.3 頂空固相微萃取條件 分別精密稱取3種待測樣品粉末1.00 g放入15 mL萃取瓶中，于70 ℃水浴條件下預熱30 min，將不同涂層的萃取頭對樣品中揮發(fā)性成分吸附一定的時間，然后插入氣相色譜質譜聯(lián)用儀進樣口中吸附5 min進行檢測分析。

1.2.4 氣相色譜與質譜條件 色譜條件：采用6890N-5973氣相色譜質譜聯(lián)用儀、 HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，起始溫度50 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫至130 ℃；然后以7 ℃/min升溫至200 ℃，保持5 min，氣化室溫度為250 ℃，分流進樣，分流比為10∶1，流速為0.8 mL/min，載氣為氦氣，流量1 mL/min。 質譜條件：電子轟擊電離(EI)，離子源溫度230 ℃，接口溫度為250 ℃，溶劑延遲5 min，質量掃描范圍m/z 50-550，電子能量70 eV。

1.2.5 重復性實驗[17]按“1.2.3及1.2.4”項下條件操作，進行進樣分析，在相同積分條件下，以3種卷柏屬植物揮發(fā)性成分的總峰面積為考察指標，計算其RSD均<2.0%，說明該方法重復性好，所選萃取條件精確，適合卷柏屬植物揮發(fā)性成分的分析。

1.2.6 主成分分析[18]采用SPSS18.0軟件對揮發(fā)油成分進行因子分析，根據(jù)相關系數(shù)列出相關矩陣，求出特征根及相應的特征變量。

1.2.7 HS-SPME條件的優(yōu)化 研究不同類型的萃取頭(30/50 μm PDMS、75 μm PDMS/CAR、100 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB)、萃取時間(5、10、15、20、25 min)、萃取溫度(80、90、100、110、120 ℃)對兗州卷柏、細葉卷柏、墊狀卷柏揮發(fā)性成分的提取效果，并優(yōu)化研究條件。

2 結果

2.1 萃取條件的選擇

2.1.1 萃取纖維頭的選擇 采用30/50 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、100 μm DVB/CAR/ PDMS、65 μm PDMS/DVB 4種不同纖維頭對3種卷柏屬植物揮發(fā)性成分的萃取效率進行比較，其余提取條件為:萃取時間20 min，萃取溫度100 ℃。4種 SPME 萃取纖維頭萃取不同種類化合物色譜圖總峰面積見圖1。使用 4 種不同 SPME 萃取纖維頭檢出的揮發(fā)性成分在種類和含量上有較大差異，采用 65 μm PDMS/DVB 萃取頭檢出的揮發(fā)性成分種類和數(shù)量較多，且揮發(fā)性成分色譜峰面積最大，確定65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭為最佳萃取纖維頭。

圖1 萃取纖維頭對不同類型揮發(fā)性成分的影響

2.1.2 萃取時間的選擇 選用65 μm PDMS/DVB萃取頭，萃取溫度為100 ℃條件下，對提取3種樣品揮發(fā)性成分的萃取時間(5、10、15、20、25 min)作了評價(見圖2)。當樣品在萃取瓶中加熱時，卷柏揮發(fā)性成分的總峰面積在0～20 min內持續(xù)增加，但隨著萃取時間的增加，在20～25 min時間范圍內3種卷柏屬植物揮發(fā)性成分的總峰面積下降，可能是因為部分揮發(fā)性成分在長期加熱條件下降解，由圖2可知揮發(fā)性成分的最大峰面積平均為7.7×106，確定最佳萃取時間為20 min。

圖2 萃取時間的選擇

2.1.3 萃取溫度的選擇 研究不同萃取溫度對3種卷柏屬植物揮發(fā)性成分的影響，設置溫度梯度(80、90、100、110、120 ℃)采用65 μm PDMS/DVB纖維頭萃取樣品20 min，如圖3所示，當溫度在80～100 ℃內，不同種類卷柏屬植物的揮發(fā)性成分的含量均有明顯增加。當溫度在100～120 ℃時，揮發(fā)性成分的總峰面積顯著降低。因此確定100 ℃作為最佳萃取溫度。

圖3 萃取溫度的選擇

2.2 3種卷柏屬植物揮發(fā)性物質的分析 按照頂空固相微萃取條件和氣相色譜-質譜條件，分析3種卷柏屬植物的揮發(fā)性成分，經(jīng)安捷倫化學工作站數(shù)據(jù)處理并用峰面積歸一化法從總離子圖中計算各組分相對質量分數(shù)，將所獲得的光譜通過NIST數(shù)據(jù)庫參考化合物數(shù)據(jù)相匹配，并結合相關文獻，初步鑒定了85種化合物。各組分的相對含量用百分數(shù)表示，即峰面積與總峰面積之比，分析結果見圖4和表2。

在最佳萃取條件下，3種卷柏屬植物的總離子流圖(TIC)如圖4所示，對其揮發(fā)性成分進行分析后發(fā)現(xiàn)，3種卷柏屬植物在揮發(fā)性物質的種類及相對含量上存在一定的差異，3種卷柏屬植物中共鑒定出85種成分，兗州卷柏中共分離出37種峰，確定了其中的34種成分，占總揮發(fā)性成分的87.79%；細葉卷柏中共分離出40種峰，確定了其中的38種成分，占總揮發(fā)性成分的84.43%；墊狀卷柏中共分離出50種峰，確定了其中的48種成分，占總揮發(fā)性成分的94.17%，得到的保留指數(shù)與文獻報道一致，化合物的保留時間和保留指數(shù)在40 min之內呈線性相關。3種卷柏屬植物中有4種共有成分，包括1-十三烯、石竹素、β-瑟林烯、(9E)-9-十八碳烯。

A:兗州卷柏(Si)；B:細葉卷柏(Sl)；C:墊狀卷柏(Sp)。圖4 3種卷柏屬植物的總離子流圖

結合表1和圖5看出，被鑒定出的揮發(fā)性成分可分為12類，包括倍半萜21種、脂肪烴16種、醇類11種、酮類9種、單萜類4種、酯類5種、醛類6種、醚類5種、芳香族化合物4種、酚類2種、鹵代烴1種、呋喃化合物1種。從測定結果可知，3種卷柏屬植物在含量和種類上存在差異，例如細葉卷柏和墊狀卷柏中倍半萜含量明顯高于兗州卷柏，且細葉卷柏中的倍半萜含量最多；細葉卷柏和墊狀卷柏中脂肪烴含量約為兗州卷柏的4倍；醇類含量在3種卷柏屬植物中的分布差異較大，兗州卷柏中醇類含量分別是細葉卷柏的26倍和墊狀卷柏的5倍；兗州卷柏醛類的含量分別是細葉卷柏的7倍和細葉卷柏的8倍。此外，細葉卷柏中不存在芳香族化合物，鹵代烴是其特有成分；呋喃、單萜是墊狀卷柏中的特有成分。

表1 3種不同卷柏屬植物的揮發(fā)性成分比較

圖5 3種卷柏屬植物中揮發(fā)性成分的種類

倍半萜類(21)、醇類(11)、脂肪烴類(16)是3種卷柏屬植物中的揮發(fā)性成分含量和種類較高的3種類型。倍半萜是所有揮發(fā)性成分中含量和種類均較多的物質，其主要成分包括反式石竹烯、白菖烯、異長葉烯、佛術烯、香樹烯。其中墊狀卷柏中的白菖烯是兗州卷柏的6倍，兗州卷柏中的佛術烯是墊狀卷柏中的6倍、細葉卷柏中的香樹烯是墊狀卷柏的2倍；有趣的是在細葉卷柏中檢出 (-)-Α-蓽澄茄油烯、(+)-環(huán)苜蓿烯、異長葉烯、(-)-α-古蕓烯、α-蒎烯、α-律草烯、花柏烯、α-姜黃烯，而其它兩種卷柏屬植物沒有檢測到(具體揮發(fā)性成分見表2)。

表2 3種卷柏屬植物揮發(fā)性的成分及相對含量(%)

醇類物質在兗州卷柏中的含量較多，主要成分包括1-辛烯-3-醇、辛醇，其中1-辛烯-3-醇的含量是墊狀卷柏的34倍，其含量超過總揮發(fā)性成分的1/3，較細葉卷柏和墊狀卷柏中的醇類物質多，Gunaseelan等[19]發(fā)現(xiàn)芳樟醇可以預防小鼠皮膚急性紫外線B引起的增生、脂質過氧化和抗氧化損失，并可以進一步抑制小鼠皮膚中環(huán)氧合酶2和鳥氨酸脫羧酶的過表達，表明醇類物質具有一定的抗氧化作用。在我們的初步實驗中發(fā)現(xiàn)卷柏屬揮發(fā)性成分具有抑制腫瘤細胞增殖及清除自由基的作用，但還需進一步研究關于卷柏屬植物具體成分的藥理活性。

續(xù)表2

2.3 統(tǒng)計學分析

2.3.1 主成分分析 將3種卷柏的揮發(fā)性物質的含量導入SPSS18.0中，行表示分析的樣品(9批卷柏樣品)，在進行分析前需將數(shù)據(jù)進行均一化處理，主成分的特征值及方差貢獻率是選擇主成分的指標[20]，具體指標信息見表3。只有特征值為>1的不同樣本的主成分(PCs)作為數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理[21]。采用PCA對數(shù)據(jù)集進行分析，最終考慮采用PC1、PC2(見表3)，其主成分分析圖見圖6。

表3 主成分的特征值及貢獻率

A：散點圖；B：載荷圖。圖6 3種卷柏屬植物揮發(fā)性成分主成分分析

2個主成分的載荷矩陣通過SPSS18.0軟件處理可得到特征向量，即特征值>1的向量，3種卷柏屬的主成分得分可通過Y1=FAC1-1-1*SQRT(λ1)(表3中λ1=48.34)，Y2=FAC2-2-1*SQRT(λ2) (表3中λ2=36.105)，表4中的Y1為3次重復實驗中PC1的平均值，Y2為3次重復實驗中PC2的平均值[22-23]。通過Y=0.57Y1+0.42Y2計算即可得每個樣品的綜合得分，各項系數(shù)為各主成分的貢獻率，Y1、Y2為各成分的評分[24],見表4。

表4 樣品主成分評分

詳細分析各變量后，由圖6可知，PC1的主要成分為壬醛、萜品油烯、芳樟醇、4-烯丙基苯甲醚、癸醛、β-環(huán)檸檬醛、茴香腦、黃樟素、甲基丁香酚、二氫獼猴桃內酯、十三烷、1-十三烯、1,1,6三甲基-1,2二氫萘、香葉基丙酮、十四烷、β-律草烯、反式石竹烯、(-)-α-古蕓烯、抗氧劑264、α-畢橙茄醇、1-十六烯、正十六烷，其特征值都接近于1；PC2的主要成分為3-苯基丁-2-酮、4-羥基-3-叔丁基-苯甲醚、橙化基丙酮、正十五烷、β-瑟林烯、紫羅醇、S-(Z)-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、柏木腦；經(jīng)過PCA分析，3種卷柏存在一些共有的成分，但是通過各因子的得分可知，墊狀卷柏是3種卷柏屬植物中綜合評分較高的的植物，表明3種卷柏屬植物的揮發(fā)性成分存在一定的差異。

3 討論

對于揮發(fā)性成分的提取，以前的研究多采用水蒸氣蒸餾法與超臨界CO2萃取法，但是這種方法存在一定的不足之處，水蒸氣蒸餾的提取時間較長，且高溫使一些熱不穩(wěn)定的成分分解導致?lián)]發(fā)性成分的損失，對環(huán)境也有一定的污染。而頂空固相微萃取方法能很好的解決這些問題，可作為一種新型通用的方法對揮發(fā)性成分進行提取。

通過實驗結果推斷3種卷柏屬植物揮發(fā)性成分存在一定的差異，兗州卷柏中醇類物質含量最多，可作為兗州卷柏的特征性物質；細葉卷柏中不存在芳香族化合物，鹵代烴是其特有成分，而其它2種卷柏屬植物未有該類型化合物；呋喃及單萜化合物只存在于墊狀卷柏；細葉卷柏和墊狀卷柏中倍半萜類成分含量最高。對3種卷柏植物的揮發(fā)性成分進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)3種卷柏屬植物的特征性成分存在一定的差異，通過各因子的得分可知，墊狀卷柏是3種卷柏植物評分較高的植物、其次是兗州卷柏、最后是細葉卷柏。采用HS-SPME-GC-MS技術分析探索卷柏屬植物揮發(fā)性的痕量成分，分析3種卷柏屬植物揮發(fā)性物質的差別，為卷柏屬植物揮發(fā)性成分的評價與分析提供一個方向。同時該方法也適用于分析其它具有揮發(fā)性成分的植物，成為一種通用的新型的方法。首次成功運用HS-SPME/GC-MS法分析兗州卷柏、細葉卷柏、墊狀卷柏中的揮發(fā)性物質。經(jīng)過評估不同的萃取條件(萃取纖維頭類型、萃取溫度、萃取時間)，通過單因素實驗,得到最優(yōu)條件如下:65 μm PDMS/DVB纖維頭、萃取時間20 min、萃取溫度100 ℃。在此基礎上，采用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術對3種植物作了詳細分析，共檢出85種成分。此外，通過化主成分分析對不同揮發(fā)性化合物的分析數(shù)據(jù)進行了詳細的評價，突出了3種卷柏植物不同揮發(fā)性成分的差異。因此，對3種卷柏屬植物揮發(fā)性成分的深入研究，可以作為評價和區(qū)分不同種類卷柏屬植物的有效工具。