胡瑤瑤，汪謝嬡，馮光勇，岳國軍，楊明鎮(zhèn)，張貴海

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，貴州 遵義 563099；2.湘南學(xué)院附屬醫(yī)院 腫瘤科，湖南 郴州 423000；3.深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518000；4.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，貴州 遵義 563000；5.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 介入科，貴州 遵義 563099)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道腫瘤之一，約25% CRC患者在確診時就已經(jīng)發(fā)生遠處器官轉(zhuǎn)移[1]，另約25% CRC患者在疾病治療過程中發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]，是其治療失敗的主要原因之一，而腫瘤細胞的侵襲及遷移是腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。電壓門控性鈉離子通道(Voltage-gated sodium channels,VGSCs)是由1個α亞基和4個β亞基構(gòu)成的蛋白復(fù)合體，SCN1A-SCN11A基因編碼的α亞基為功能亞基，共有9種亞型(Nav1.1～Nav1.9)[3]。VGSCs既可以在興奮細胞中表達，也可以在“非興奮”細胞和組織中表達，如：結(jié)直腸癌[4]、乳腺癌[5]、卵巢癌[6]及前列腺癌[7]等，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是VGSCs的特異性抑制劑，根據(jù)VGSCs對TTX的敏感性，VGSCs分為TTX敏感型(TTX-S)和TTX耐受型(TTX-R)。有研究發(fā)現(xiàn)，Nav1.5在結(jié)腸癌組織較正常組織呈高表達，并與結(jié)腸癌細胞侵襲勢能有關(guān)[9]，但其在CRC耐藥細胞中表達情況及其與轉(zhuǎn)移勢能的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究通過比較結(jié)直腸癌親本細胞SW620和耐藥細胞SW620/OxR 的Nav1.5功能及蛋白表達的差異，探討Nav1.5功能變化對CRC耐藥細胞侵襲、遷移的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑 結(jié)直腸癌細胞株SW620購于上海生命科學(xué)院細胞庫。 Leibovitz's L-15 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自上海依科賽公司；基質(zhì)膠(Matrigel)購自美國Corning公司；CCK8試劑盒購自ATGene公司；奧沙利鉑(Oxaliplatin，Oxa)、5-氟尿嘧啶(5-fluorocrail,5-FU)和小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國Sigma公司；河豚毒素(TTX)、兔抗人P-gp抗體購自美國Abcam公司；兔抗人Nav1.5單克隆抗體由以色列Alomone公司惠贈；PVDF膜(0.45 μm)和Transwell 小室(孔徑8 μm)均購自美國 Millipore公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京百泰克公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及耐藥細胞建立 人結(jié)直腸癌SW620細胞使用含10% 胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺的Leibovitz's15(L-15)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)(37 ℃，0% CO2飽和濕度)。采用濃度遞增法，逐漸增加L-15培養(yǎng)液中OxR的濃度直至臨床血漿濃度(2 μmol/L)，建立慢性抵抗OxR的SW620/OxR細胞株[10]。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 實驗設(shè)置分組：SW620組、SW620/OxR組及5-FU或TTX干預(yù)組。干預(yù)組為用含2.0 μg/mL 5-FU或30 μmol/L TTX的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h的SW620 和SW620/OxR細胞。

1.3.2 CCK-8法細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期細胞SW620和SW620/OxR均以5×103/孔，接種于96孔培養(yǎng)板(100 μL/孔)中，待細胞貼壁生長約70%后，分別加入含2.0 μg/mL 5-FU或30 μmol/L TTX或2 μmol/L Oxa繼續(xù)培養(yǎng)72 h，設(shè)置調(diào)零孔(僅含培養(yǎng)液和CCK-8)，以不含干預(yù)藥物的細胞孔為對照，每組設(shè)5個復(fù)孔。在既定時間每孔加10 μL的CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測A450 nm的吸光度值(OD值)，以吸光度值反應(yīng)細胞增殖力。

1.3.3 細胞遷移實驗 采用孔徑為8 μm的Transwell小室進行實驗，取5×104/mL的單細胞懸液200 μL加入小室內(nèi)室，下室加入500 μL含10% FBS的L-15培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h，取出小室PBS洗滌2次， 加4% 多聚甲醛固定20 min，再用5%結(jié)晶紫溶液染色20 min，棉棒拭去未透膜細胞。倒置顯微鏡下隨機選取5個高倍視野拍照、計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.3.4 細胞侵襲實驗 配置濃度為 25%的Matrigel 膠工作液包被Transwell小室，放回培養(yǎng)箱中靜置1 h，L-15水化小室濾膜。后續(xù)實驗步驟同細胞遷移實驗。

1.3.5 Na+電流檢測 全細胞膜片鉗技術(shù)被用于結(jié)直腸癌細胞膜Na+電流水平檢測。選取對數(shù)期生長的SW620、SW620/OxR及TTX干預(yù)細胞，制成單細胞懸液并計數(shù)，接種于35×10 mm的培養(yǎng)皿，37℃、100% 濕度及無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至完全貼壁。去除培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基，將細胞外液加入培養(yǎng)皿后置于倒置顯微鏡下，三維操縱儀移動電極，伸向細胞表面，加壓形成1 GΩ水平以上的高阻抗封接，破膜，形成全細胞記錄的形式，予不同參數(shù)的鉗制電壓觀察電流的變化，用Origin軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.6 Western blot檢測P-gp和Nav1.5蛋白表達水平 提取細胞總蛋白，BAC法測定蛋白濃度，6% 和10% SDS-PAGE電泳后，恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，含10%PBST脫脂奶粉室溫封閉1 h，與兔抗人抗體Nav1.5(1∶500)、兔抗人抗體P-gp(1∶2 000)及鼠抗人抗體β-actin(1∶5 000)4 ℃孵育過夜，再以過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，PBST漂洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑顯影，BIO-RAD全自動圖像采集圖像，Quantity Qne軟件分析目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 CRC耐藥細胞株的鑒定 CCK-8法結(jié)果分析顯示，奧沙利鉑(OxR，2 μmol/L)和5-氟尿嘧啶(5-FU，2.0 μg/mL)對SW620/OxR細胞的增殖無明顯抑制作用(0.940±0.078，0.941±0.037，P均> 0.05)，卻能顯著抑制SW620細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.447±0.049，0.515±0.023，P均<0.05，見圖1)；SW620/OxR與SW620細胞增殖能力也無明顯差異(P>0.05，見圖1)。Western blot結(jié)果也顯示，SW620/OxR細胞P-糖蛋白(P-gp)的蛋白表達水平較SW620細胞顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.20±0.06，0.60±0.07，P<0.05，見圖2)。

*：與對照組相比，OxR組和5-FU組對SW620/OxR細胞，SW620細胞的增殖比較，P<0.05。 圖1 OxR與5-FU對CRC細胞增殖力的影響

*：SW620/OxR細胞與SW620細胞P-gp蛋白水平比較，P<0.05。圖2 CRC細胞P-gp蛋白表達水平

2.2 CRC細胞Na+電流密度及Nav1.5蛋白表達水平變化 采用10 μmol/L濃度的TTX抑制SW620 和 SW620/OxR細胞-10 mV的Na+電流密度，以排除其它因素對Nav1.5通道的干擾(見圖3A、3B)。膜片鉗檢測結(jié)果顯示，與SW620細胞比較，SW620/OxR細胞膜 Na+電流水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3C～F)。Western blot結(jié)果也顯示，相較于 SW620細胞,SW620/OxR細胞Nav1.5蛋白表達水平也顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

*：SW620/OxR細胞與SW620細胞電流密度對比，P <0.05，pA代表電流單位，mV代表電壓單位。圖3 CRC細胞在-10 mV出現(xiàn)最大Na+電流密度比較

SW620/OxR細胞與SW620細胞Nav1.5蛋白表達水平對比。圖4 CRC細胞Nav1.5表達水平

2.3 TTX對CRC細胞增殖、遷移、侵襲及Nav1.5蛋白表達水平的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，30 μmol/L的TTX對SW620細胞和SW620/OxR細胞72 h的增殖力均無顯著影響(P>0.05，見圖5A )；遷移實驗卻顯示，SW620/OxR細胞遷移力較SW620細胞顯著增加(P<0.05，見圖5B)，TTX均能顯著降低SW620細胞和SW620/OxR細胞的遷移力(P均<0.05，見圖5B)。侵襲實驗顯示，SW620/OxR細胞的侵襲力較SW620細胞明顯增加，TTX均能顯著降低SW620細胞和SW620/OxR細胞的侵襲力(P<0.05，見圖5C)。 Western blot結(jié)果顯示，TTX均能顯著下調(diào)SW620細胞和SW620/OxR細胞Nav1.5蛋白表達水平(P<0.05，見圖5D)。

*：SW620/OxR細胞與SW620細胞遷移力對比，SW620/OxR細胞與SW620細胞侵襲力對比，P<0.05；△：TTX干預(yù)后，SW620/OxR細胞與SW620細胞遷移力比較，TTX干預(yù)后，SW620/OxR細胞與SW620細胞侵襲力比較，P<0.05；A:增殖；B：遷移；C：侵襲力；D：Nav1.5蛋白表達。圖5 TTX對CRC細胞增殖、遷移、侵襲及Nav 1.5蛋白表達的影響

3 討論

VGSCs是一種含有形成孔洞的α亞基和較小的、不形成孔洞的β亞基組成的異聚膜蛋白復(fù)合體，α亞基是其功能部分，β亞基具有調(diào)節(jié)α亞基在細胞表面表達及α亞基的門控的功能[11]。VGSCs除在心肌、神經(jīng)等可興奮細胞表達外，也可在“非興奮”腫瘤組織中表達[4-7]，并與部分腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。轉(zhuǎn)移是CRC治療失敗的最主要原因，而腫瘤細胞的遷移及侵襲是CRC遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，有研究發(fā)現(xiàn)Nav1.5在結(jié)腸癌組織呈高表達，且是CRC細胞促進侵襲基因網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)控因子[12]。然而，關(guān)于Nav1.5表達與CRC多藥耐藥的關(guān)系及其對CRC耐藥細胞遷移、侵襲的影響尚不清楚。

多藥耐藥(MDR)是導(dǎo)致腫瘤化療和治療失敗的重要因素之一[13]。P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是由MDR1基因編碼的一種轉(zhuǎn)運體，通過影響腫瘤細胞的藥物轉(zhuǎn)運在MDR中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，對奧沙利鉑耐藥的SW620/OxR細胞對5-氟尿嘧啶也產(chǎn)生耐藥，P-gp表達水平也顯著增加，與課題組以前研究報道一致[10]。Baptista-Hon等[14]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌SW620細胞表達成人型和新生兒型Nav1.5變異體，兩者均有相似的穩(wěn)定失活狀態(tài)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nav1.5在轉(zhuǎn)移性CRC親本細胞SW620和耐藥細胞SW620/OxR均有表達，SW620/OxR細胞Nav1.5表達水平及細胞膜Na+電流水平均顯著高于SW620細胞，提示SW620/OxR細胞Na+電流增加可能源于Nav1.5表達上調(diào)，Nav1.5可能參與CRC多藥耐藥過程。House等[15]研究表明，來自同一結(jié)腸癌患者的原發(fā)灶SW480細胞Nav1.5表達水平低于轉(zhuǎn)移灶SW620細胞。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)，來自同一SW620的親本細胞Nav1.5蛋白表達水平明顯低于耐藥細胞。由此可見，Nav1.5在CRC不同階段及不同狀態(tài)表達不同，這可能與CRC 細胞部分生物學(xué)特性有關(guān)。Brackenbury 等[16]等研究顯示，Nav1.5在轉(zhuǎn)移性三陰(缺乏雌激素受體、孕激素受體和HER2)乳腺癌MDA-MB-231細胞中表達，且在體外能通過細胞外基質(zhì)增強癌細胞的遷移和侵襲力。此外，Nelson等[17]研究顯示，在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDA-MB-231細胞裸鼠移植瘤中，鈉通道抑制劑苯妥英鈉能抑制其向肝臟及肺臟的遠處轉(zhuǎn)移；A-803467作為一種強效的選擇性Nav1.8鈉通道阻滯劑[18]，對ABCG 2介導(dǎo)的MDR有明顯的抑制作用，也能顯著提高H460/MX20(由人非小細胞肺癌親本H460細胞通過逐步增加MX誘導(dǎo)的高表達ABCG2的耐藥細胞株)細胞對ABCG2底物米托蒽醌及拓撲替康的敏感性及增強拓撲替康對裸鼠移植瘤的抗腫瘤作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，SW620/OxR細胞的遷移力和侵襲力均較SW620細胞顯著增加，而兩種細胞的增殖力卻無顯著差異，提示CRC耐藥細胞的遷移力和侵襲力增加可能與耐藥細胞Nav1.5蛋白表達上調(diào)有關(guān)。Baptista-Hon等[14]研究表明，VGSCs抑制劑羅哌卡因能抑制轉(zhuǎn)移性CRC SW620細胞的侵襲和Nav1.5通道的活性。為進一步明確Nav1.5功能與CRC細胞遷移和侵襲的關(guān)系，本研究應(yīng)用鈉通道抑制劑TTX，觀察其對兩種CRC細胞的Nav1.5表達、Na+電流及遷移和侵襲的的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，30 μmol/L的TTX能顯著降低親本和耐藥細胞的遷移及侵襲力，且下調(diào)兩種細胞的Nav1.5表達水平及降低兩種細胞的Na+電流水平，這進一步提示了Nav1.5能促進CRC細胞的遷移及侵襲，及Nav1.5抑制劑TTX抑制CRC細胞遷移、侵襲及Na+電流水平可能與Nav1.5表達下調(diào)有關(guān)。然而，本研究卻顯示，TTX對SW620和SW620/OxR細胞的增殖力無顯著影響，由此可見Nav1.5可能不參與CRC細胞增殖的調(diào)控。目前，雖有研究認為Nav1.5編碼基因SCN5A可通過細胞遷移、細胞周期控制基因和Wnt信號通路等調(diào)控CRC細胞侵襲[15]，但尚無大規(guī)模臨床試驗研究證實VGSCs抑制劑對腫瘤的抑制效應(yīng)[20]。因此，VGSCs抑制劑在抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移方面具有較大的潛能，其有望成為抗腫瘤治療的新型靶向藥物。

綜上所述，CRC耐藥細胞Na+內(nèi)向電流增加可能源于Nav1.5表達上調(diào)，并參與CRC的多藥耐藥；Nav1.5能促進CRC細胞遷移及侵襲，TTX降低CRC細胞的遷移及侵襲力也可能部分與下調(diào) Nav1.5蛋白表達有關(guān)。