狄海波，李軍毅，侯世科

(1.武警特色醫(yī)學(xué)中心燒傷凍傷及組織功能重建研究所，天津 300162； 2.棗礦集團(tuán)中心醫(yī)院，山東 棗莊 277100)

煙霧吸入損傷(SII)死亡率約 30%，其特征是煙霧中的有害因素(包括熱量、微顆粒、毒性物質(zhì)及氣道刺激物)介導(dǎo)的氣道或全身炎癥反應(yīng)，通常會(huì)導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，這也是燒傷患者高死亡率的主要危險(xiǎn)因素[1-3]。在SII發(fā)病過(guò)程中，氣道炎癥導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞向肺內(nèi)遷移，然后釋放細(xì)胞毒性酶、活性氧和其他氧化物[4-5]。這些有毒物質(zhì)的積累是氣道上皮和肺內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要因素。因此，受損肺泡的氣體交換受損，導(dǎo)致低氧血癥和高碳酸血癥[4-6]。Club細(xì)胞蛋白10-kDa(CC10)是Club細(xì)胞分泌的主要蛋白質(zhì)。這些CC10表達(dá)細(xì)胞已被證明在保持氣道上皮的完整性和促進(jìn)上皮修復(fù)方面起著關(guān)鍵作用[7]。CC10是一種具有多種作用機(jī)制的強(qiáng)效抗炎蛋白，包括抑制磷脂酶A2(PLA2)[8-9]、抑制中性粒細(xì)胞[10-11]、抑制NF-kB信號(hào)[12]。在幾種急性肺損傷動(dòng)物模型中， rhCC10的治療均觀察到了肺炎性介質(zhì)的減少，肺結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)，肺機(jī)械功能、氣體交換和肺血管屏障的改善[12-15]。本研究旨在探討rhCC10對(duì)煙霧吸入損傷大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要實(shí)驗(yàn)裝置 SPF級(jí)健康雄性SD 大鼠156只，8～12 周齡，體重200±20 g，購(gòu)自北京維通利華。大鼠飼養(yǎng)在溫度20～25 ℃、相對(duì)濕度50%～70% 的環(huán)境中。自行研制的產(chǎn)煙-實(shí)驗(yàn)一體的密閉裝置，由亞克力板材組成，包括由管道聯(lián)通的煙霧生成單元和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單元。煙霧生成單元內(nèi)含1 個(gè)溫控電熱爐、1個(gè)鼓風(fēng)機(jī)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單元包含2個(gè)排風(fēng)扇、1 個(gè)水循環(huán)冷卻系統(tǒng)，可控制箱內(nèi)溫度于20～25 ℃ ，以及1 個(gè)溫度檢測(cè)器和1 個(gè)煙霧成分檢測(cè)器。

1.2 動(dòng)物模型制備 基于朱峰等[16]的描述建立煙霧吸入性肺損傷模型。將100 g混合材料粉末(包括發(fā)泡橡塑絕熱制品、阻燃白膠、阻尼材料、無(wú)鹵電纜、硅丙乳膠漆每種材料的20 g)放入電熱爐的金屬板上，然后加熱這些材料產(chǎn)生煙霧。使用鼓風(fēng)機(jī)將煙霧送入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單元。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單元控制溫度24～27 ℃以排除煙氣的熱損傷。使用煙霧成分檢測(cè)器和鼓風(fēng)機(jī)保持室內(nèi)穩(wěn)定的煙霧環(huán)境，氧氣保持18%～20%，一氧化碳體積分?jǐn)?shù)450～500 ppm，硫化氫體積分?jǐn)?shù)5～10 ppm。當(dāng)氣體濃度低于上述范圍時(shí)，鼓風(fēng)機(jī)將煙送入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單元。將清醒的大鼠置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單元中吸入煙霧30 min完成造模。

1.3 藥物處理及分組 156只成年雄性SD 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(sham組，n=6)、煙霧模型組(SII組，煙霧吸入30 min，n=50)以及煙霧+ rhCC10 干預(yù)組[SII+rhC2組(煙霧+2 mg/kg的rhCC10)]2 mg/kg、SII+ rhC10組[(煙霧+ 10 mg/kg的rhCC10)10 mg/kg，n=50]，SII+ rhC2、SII+ rhC10組在煙霧吸入前1 h分別給予2 mg/kg、10 mg/kg rhCC10腹腔注射[17]，此后每隔12 h重復(fù)注射1次，連續(xù)3 d，對(duì)照組腹腔注射等量晶體液。統(tǒng)計(jì)并計(jì)算大鼠1、3、6、12、18、24 h存活率，實(shí)驗(yàn)24 h隨機(jī)選取6只大鼠腹主動(dòng)脈血?dú)夥治龊蟀矘?lè)死，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織，用于進(jìn)一步檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)28 d剩余大鼠安樂(lè)死，取肺組織用于病理學(xué)檢測(cè)。

1.4 支氣管肺泡灌洗 支氣管肺泡灌洗術(shù)(BAL)采用20號(hào)氣管造瘺術(shù)，使用血管導(dǎo)管向左肺灌注含0.5 mM EDTA的冷PBS (1 mL aliquots)，輕輕取出液體，收集約2.75 mL的總?cè)萘?共注射3次)。液體立即被放在冰上。在第一次注射中大約有70%的液體和在隨后的注射中有90%的液體被回收。一部分用于蛋白定量檢測(cè)，一部分用于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

1.5 血漿及BALF檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)24 h從各組大鼠腹主動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血2.5 mL，采用Premier3000動(dòng)物血?dú)夥治鰞x分析氧分壓，通過(guò)XFA6030型動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀分析BALF中白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞比例及巨噬細(xì)胞比例，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清及BALF 中白細(xì)胞介素-6(IL-6)(abcam公司，ab9324，美國(guó))、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)(abcam公司，ab106129，美國(guó))水平。BALF離心后取上清，BCA蛋白定量法檢測(cè)其蛋白濃度。

1.6 肺組織濕干重比 取右肺下葉，生理鹽水洗凈，擦干，置于一片鋁箔上，立即稱重(濕重)。將肺在60 ℃的烘箱中干燥，48 h后稱重(干重)。濕干比(W/D)是一種常用的水腫形成的檢測(cè)方法。

1.7 Western blot檢測(cè) 取各組大鼠肺組織，采用RIPA裂解液裂解(碧云天，GMA001981，中國(guó))，充分勻漿，于4 ℃離心15 min，取上清，BCA法定量總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。進(jìn)一步檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)(abcam公司，ab134132，美國(guó))、高遷移率族蛋白B1(Highmobilitygroupboxl,HMGB1)(abcam公司，ab77302，美國(guó))蛋白質(zhì)濃度。用含有0.1%牛血清白蛋白的PBS在室溫下將膜封閉1 h， PBST洗滌后抗體溫育過(guò)夜：兔抗鼠MPO一抗(1∶1 000)，兔抗鼠HMGB1一抗(1∶1 000)和β-actin一抗(1∶1 000)。將膜用PBST清洗4次后與山羊抗兔二抗(1∶1 000)在室溫下孵育2 h。PBST清洗后采用ECL試劑盒檢測(cè)條帶的化學(xué)發(fā)光，使用ImageJ軟件分析圖像。

1.8 病理學(xué)檢查 4%多聚甲醛固定肺組織48 h，石蠟包埋、切片(片厚4 μm)，脫蠟后進(jìn)行蘇木素- 伊紅(HE)染色。采用單盲法由2名病理科醫(yī)生分別于光鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察，每張切片至少選取20 個(gè)隨機(jī)高倍視野，根據(jù)肺泡內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺泡間隔內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、透明膜形成與否、肺泡腔內(nèi)是否殘存蛋白質(zhì)、肺泡間隔厚度、肺纖維條索等進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 rhCC10對(duì)大鼠24 h存活的影響 SII組大鼠24 h 存活率顯著低于sham組(36% 比100%，P<0.05)。SII+rhC2、SII+rhC10組大鼠24 h 存活率分別提升至62%、74%，均顯著高于SII 組(P均<0.05)；其中SII+rhC10組存活率顯著高于SII+rhC2組(P均<0.05，見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠24 h Kaplan-Meier生存曲線

2.2 rhCC10改善氧合指數(shù) 與sham組相比，SII組氧合指數(shù)明顯下降 [(283.33±32.26)vs(457.94±14.57)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SII+rhC2組高于SII組[(357.14±19.05)vs(283.33±32.26)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SII+rhC10組明顯高于SII組[(377.78±25.32)vs(283.33±32.26)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而SII+rhC2組與SII+rhC10組間氧合指數(shù)未見(jiàn)明顯差異(P>0.05，見(jiàn)圖2)。

*：與sham組比較，P<0.05；#：與SII組相比P<0.05。圖2 各組大鼠24 h氧合指數(shù)

2.3 rhCC10 減輕SII炎癥水平 SII后血漿及BALF中IL- 6、NF-κB水平均顯著高于sham組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而rhCC10治療組IL- 6、NF-κB水平較SII組均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在BALF的細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)SII組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比例高于sham組，而巨噬細(xì)胞比例低于sham組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rhCC10治療組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比例均顯著降低，而巨噬細(xì)胞比例明顯增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而SII+rhC10組白細(xì)胞計(jì)數(shù)低于SII+rhC2組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 rhCC10對(duì)煙霧吸入性急性肺損傷大鼠BALF及血漿中炎性因子的影響

SII后肺組織MPO、HMGB1 表達(dá)較sham 組顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；rhCC10治療組MPO、HMGB1 表達(dá)水平較SII組均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而SII+rhC10組HMGB1低于SII+rhC2組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

*：與sham組比較，P<0.05；#：與SII組相比，P<0.05；@：與SII+rhC2組相比，P<0.05。圖3 各組大鼠肺組織蛋白免疫印跡

2.4 rhCC10 減輕肺組織水腫及蛋白外滲 與sham組相比， SII組 W/D明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SII組比較，SII+rhC2組和SII+rhC10組W/D均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。BALF 中蛋白水平檢測(cè)結(jié)果表明，SII組蛋白水平均顯著高于sham組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SII組比較，SII+rhC2組和SII+rhC10組蛋白水平均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且SII+rhC10組低于SII+rhC2組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表2 rhCC10對(duì)肺組織水腫及蛋白外滲的影響

2.5 rhCC10減輕肺組織水腫，減輕肺組織纖維化 實(shí)驗(yàn)24 h：sham組大鼠各級(jí)支氣管、肺泡管、肺泡囊、肺泡及肺泡隔組織結(jié)構(gòu)完整清晰，無(wú)充血、水腫，肺泡腔內(nèi)無(wú)明顯滲出(見(jiàn)圖4A)；SII組肺間質(zhì)大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)有中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織毛細(xì)血管充血，肺泡隔水腫、增厚，肺泡間隔增寬變形，肺組織結(jié)構(gòu)破壞(見(jiàn)圖4B)；rhCC10干預(yù)組肺組織炎性反應(yīng)介于sham組與SII組之間，較SII組有所減輕(見(jiàn)圖 4C和D)。與sham組相比，SII組肺泡腔面積比縮小，而 rhCC10干預(yù)組肺泡腔所占面積介于兩者之間，但大于SII組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。實(shí)驗(yàn)28 d：SII組在支氣管周?chē)写笃瑢?shí)變區(qū)，肺泡壁異常增厚，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，腔內(nèi)無(wú)明顯滲出物，肺實(shí)質(zhì)炎癥吸收，成纖維細(xì)胞增生，肺組織纖維化，斑片狀分布，肺泡融合，肺泡腔縮小，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，此階段呈中度至重度肺纖維化改變(見(jiàn)圖4F)。rhCC10干預(yù)組肺纖維化程度介于sham組與SII組之間，表現(xiàn)輕、中度肺纖維化改變，在支氣管周?chē)芯植坷w維化，病變范圍局限，肺泡間隔增厚，肺泡隔纖維增生灶較少，較SII組有減輕，肺泡結(jié)構(gòu)完整性基本恢復(fù)(圖 4G、H)。與sham組相比，SII組肺泡腔面積比明顯縮小， rhCC10干預(yù)組肺泡腔所明顯大于SII組，但仍小于sham組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中SII+rhC10組肺空泡腔面積比大于SII+ rhC2組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

A～D：實(shí)驗(yàn)24 h肺組織HE染色；E～H:實(shí)驗(yàn)28 d肺組織HE染色；其中A和E：sham組，B和F：SII組，C和G：SII+ rhC2組，D和H：SII+ rhC10組；圖片放大倍數(shù)為200倍。圖4 各組大鼠肺組織HE染色

表3 各組大鼠肺組織空泡腔面積比

3 討論

煙霧吸入損傷導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷，通常致命，其特征是嚴(yán)重的肺炎癥、上皮去角質(zhì)、氣道阻塞、肺出血和肺水腫，以及長(zhǎng)期預(yù)后的肺纖維化[1,18]。本研究的主要發(fā)現(xiàn)是，腹腔注射10 mg/kg rhCC10的治療可減少肺部炎癥，保護(hù)肺結(jié)構(gòu)，改善氣體交換和肺纖維化。與先前SII兔子模型中靜脈注射rhCC10保護(hù)的肺結(jié)構(gòu)，減少肺部炎癥，改善肺功能的研究發(fā)現(xiàn)一致[13]。作為磷脂酶a2抑制劑，rhCC10也可以防止肺表面活性劑的降解，從而保持肺功能[14,19]。作為氣道上皮細(xì)胞中NF-kB信號(hào)的抑制劑，rhCC10可以抑制急性肺損傷中的下游炎癥反應(yīng)[13]，在評(píng)估 rhCC10 的其他幾個(gè)急性肺損傷模型中觀察到的[13-15]。據(jù)報(bào)告，在患有呼吸窘迫的早產(chǎn)兒中，腹腔內(nèi)施用rhCC10可顯著減少肺部炎癥[20]。CC10，也稱為促分泌素1A1、CCSP、CC16、子宮珠蛋白和尿蛋白-1，是內(nèi)襯非纖毛呼吸道上皮細(xì)胞的主要分泌物，也包括Club細(xì)胞。Club細(xì)胞亞群包括氣道中的祖細(xì)胞，這些祖細(xì)胞在上皮損傷后重新填充。除了抗炎和抗纖維化特性[21-22]，CC10蛋白被認(rèn)為在修復(fù)損傷后呼吸道上皮方面起著一定的作用[23]。研究表明，在萘損傷小鼠模型中，使用rhCC10可以促進(jìn)肺上皮的修復(fù)，特別是增加Club細(xì)胞的數(shù)量[24]。

本研究中對(duì)SII大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)估表明，rhCC10不僅抑制了肺部的破壞性炎癥，而且可能有助于修復(fù)損傷后氣道上皮，改善肺纖維化。雖然CC10的機(jī)制方面尚未完全了解，但rhCC10介導(dǎo)的肺生物力學(xué)整體改善可能是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、加速上皮修復(fù)減少上皮脫落、減少粘液阻塞、抑制支氣管痙攣的結(jié)果。無(wú)論rhCC10是通過(guò)減少炎癥、加速上皮修復(fù)，還是兩者的結(jié)合，肺組織結(jié)構(gòu)和氣道完整性得以保存，這些都與改善肺氣體交換直接相關(guān)。氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)是氣體交換的主要指標(biāo)，通過(guò)rhCC10治療，本研究發(fā)現(xiàn)氧合指數(shù)以劑量依賴的方式得到改善。氧合指數(shù)的改善至關(guān)重要，因?yàn)樗cSII患者的死亡率有關(guān)[25]。與先前的研究一致，rhCC10治療降低了SII肺組織中的嗜中性粒細(xì)胞MPO，以及肺組織中性粒細(xì)胞的數(shù)量[18]。而HMGB1作為一種促炎因子，可以通過(guò)與模式識(shí)別受體家族中的受體相結(jié)合促進(jìn)炎癥的形成[26]。在沒(méi)有CC10干預(yù)的情況下，CC10基因敲除小鼠對(duì)各種呼吸道病原體和吸入性損傷表現(xiàn)出中性粒細(xì)胞大量增多[27-28]。因此，機(jī)體自然生成的CC10和rhCC10治療均可以抑制肺損傷中性粒細(xì)胞的聚集。本研究顯示，SII組肺組織中的HMGB1 和MPO 表達(dá)顯著升高，而rhCC10干預(yù)后可顯著降低HMGB1 和MPO 的蛋白表達(dá)，從而減輕肺部炎癥反應(yīng)。

多項(xiàng)研究還表明，與健康者相比CC10在呼吸衰竭患者的氣管吸氣或支氣管-肺泡液中含量較低，包括早產(chǎn)兒[29]、肺炎[30]和ARDS[10]。其它研究發(fā)現(xiàn)，在SII[31]期間，血漿或血清中的CC10增加。而循環(huán)CC10的減少與慢性肺病(如COPD和支氣管炎)的漸進(jìn)氣道重塑、肺功能喪失和Club細(xì)胞損失有關(guān)[32-33]。在之前的研究中高劑量rhCC10的治療也減輕了SII引起的綿羊肺CC10mRNA的減少，這表明rhCC10保護(hù)的Club細(xì)胞在氣道上皮[34]。關(guān)于rhCC10的整體治療效果，本研究結(jié)果表明10mg/kg劑量效果最佳，2mg/kg的劑量也表現(xiàn)出一定程度的保護(hù)作用。此外還確定了rhCC10對(duì)磷脂蛋白a2的抑制，抑制呼吸道上皮NF-kB信號(hào)，減少肺中性粒細(xì)胞聚集的作用。

綜上所述，基于本研究發(fā)現(xiàn)和先前的研究結(jié)果，rhCC10治療可減少肺部炎癥，保護(hù)肺結(jié)構(gòu)和功能的完整性，改善氣體交換和減少肺纖維化，為臨床SII治療提供了可靠的依據(jù)。