王佳興，謝巖黎?，宋娟娟，馬衛(wèi)賓，孫淑敏，李 倩

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室，河南 鄭州 450001）

黃曲霉毒素污染是糧食安全面對的巨大挑戰(zhàn)之一，其廣泛存在于花生、玉米和高粱等農(nóng)作物中。其中 AFB1具有極強的毒性，致癌性和致突變性，對人類健康造成嚴重威脅[1]。微生物降解AFB1以其反應(yīng)條件溫和、成本低等優(yōu)點已被廣泛研究，對于降解產(chǎn)物研究的缺乏成為了限制其走向應(yīng)用的主要障礙。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的降解產(chǎn)物有十幾種，其中，有命名的分別是黃曲霉毒醇、AFB2a、AFD1、AFD2、AFD3、鄰苯二甲酸酐、8,9不飽和碳的 AFB1、AFB1-8,9-二氫二醇。AFB2a作為微生物降解AFB1的降解產(chǎn)物早在1972年就已被發(fā)現(xiàn)。有學(xué)者針對 AFB1的降解途徑以及降解產(chǎn)物進行了研究，Samuel等[2]的研究表明，孵育24 h后惡臭假單胞菌將AFB1降解至不可檢測水平。利用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）和傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）分析發(fā)現(xiàn)，AFB1降解并轉(zhuǎn)化為 AFD1，AFD2和 AFD3（推測是通過內(nèi)酯和呋喃環(huán)的羰基部分的損失）。在另外一項研究中，WU[3]利用紅外光譜（IR）表征了導(dǎo)致黃曲霉毒素（AF）完全降解的是一種酶，其負責(zé)打開 AFB1的呋喃環(huán)，導(dǎo)致隨后的水解。Taylor等[4]鑒定并表征了恥垢分枝桿菌的 F420H2依賴性還原酶，該酶催化 AF降解。這些酶不同于早先報道降解AF的酶，其通過還原α,β-不飽和酯，導(dǎo)致內(nèi)酯環(huán)不穩(wěn)定，從而達到解毒的作用。Wang等[5]從PhanerochaetesordidaYK-624中純化的錳過氧化物酶（MnP）在48 h后能夠降解86%的AFB1。隨后的分析表明，AFB1首先被MnP氧化為AFB1-8,9-環(huán)氧化物，然后水解為 AFB1-8,9-二氫二醇，在隨后的水解步驟中打開呋喃環(huán)，且檢測結(jié)果顯示降解產(chǎn)物誘變活性降低。Wang等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過誘導(dǎo)的地衣芽孢桿菌（BL010）的粗酶液可以有效降解 AFB1（降解率達到 97.3%），利用四極桿飛行時間液相色譜-質(zhì)譜（LC-Q-TOF/MS）檢測到分子式為C12H14O4的降解產(chǎn)物。Eshelli等[7]通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）和FT-IR對紅曲霉菌株（ATTC 4277）降解AFB1的反應(yīng)途徑進行了全面分析。假設(shè) AFB1通過一系列反應(yīng)被降解以形成具有分子式C13H16O4和質(zhì)量為236.104 9的芳族化合物，并對降解過程進行了有力推斷。

在最新的Li[8-9]的兩篇報道中，總共發(fā)現(xiàn)了八種降解產(chǎn)物，m/z 207.0（C11H10O4）比AFB1分子少了C6H2O2，是由于AFB1的酯鍵破壞，加氫形成乙醚鍵；AFB1的內(nèi)酯環(huán)斷裂，失去甲基和兩個一氧化碳，產(chǎn)生代謝物m/z 243.06（C14H10O4），再由羥基損失和雙鍵斷裂繼而形成 m/z 229.09（C14H12O3），隨后打開苯環(huán)失去一氧化碳，醚鍵斷裂形成 m/z 201.09（C13H12O2）；C14H12O3經(jīng)過醚鍵斷裂脫氧，以及苯環(huán)加成反應(yīng)形成產(chǎn)物 m/z 221.15(C14H20O2)；m/z 361.09（C18H16O8）比AFB1分子多CH4O2，由呋喃環(huán)左側(cè)的羥基和甲氧基的加成反應(yīng)形成，繼而酯鍵斷裂及羥基和甲氧基的斷裂，苯環(huán)上的加成反應(yīng)形成 m/z 277.14（C16H20O4），m/z 221.15（C14H20O2）比 C16H20O4少一個C2O2分子，是由于酮基和甲氧基的斷裂。

通過質(zhì)譜檢測，未檢測到任何降解產(chǎn)物的報道也有很多（Alberts等[10-11]，F(xiàn)arzaneh 等[12]，Sangare等[13]，RakshaRao等[14]）。同樣，Xia等[15]分離得到具有AFB1降解能力的枯草芽孢桿菌，AFB1降解后利用質(zhì)譜未檢測到任何降解產(chǎn)物，他們推測降解反應(yīng)可能是多種酶在共同發(fā)揮作用，將AFB1降解為不同于本身性質(zhì)的物質(zhì)?；趯嶒炇液Y選保藏的 AFB1降解菌 M19產(chǎn)生的 AFB1降解酶PADE，本課題組已對降解產(chǎn)物的致突變性和細胞毒性進行了研究，結(jié)果顯示，AFB1降解后致突變性和細胞毒性均明顯降低。本研究進一步對AFB1降解液進行薄層色譜及熒光光譜分析，分析降解產(chǎn)物可能的結(jié)構(gòu)變化，通過液質(zhì)檢測 AFB1降解產(chǎn)物。對于降解產(chǎn)物的研究為細菌M19和降解酶PADE降解AFB1在食品工業(yè)及飼料產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

WD-9403C薄層色譜掃描儀：北京六一儀器廠；F-7100熒光分光光度計：日本株式會社日立高新技術(shù)科學(xué)那珂事業(yè)所；實驗所用氯仿、丙酮（分析純）等試劑：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 薄層色譜（TLC）檢測降解產(chǎn)物

測試樣品：AFB1標準溶液（2.5 μg/mL）；降解反應(yīng)進行后，通過萃取分層分別獲得有機相及水相，有機相通過氮氣吹干重新溶解在展開劑里，水相通過超濾去除酶蛋白，即可點樣進行薄層色譜分離，同時以甲醇代替 AFB1經(jīng)同樣處理作為對照。

按照實驗樣品大小將硅膠板裁成合適尺寸，設(shè)置好點樣的位置，取樣品10 μL點在硅膠板相應(yīng)的位置上，將點好樣品的溶劑吹干，硅膠板斜放于展開劑（氯仿：丙酮=85∶55）[16]中，展開劑浸沒薄層板7～8 mm，待展開劑前沿上升到硅膠板的另一邊緣將板小心取出。將晾干的薄層板置于365 nm紫外燈下觀察，記錄熒光斑點的位置。

1.2.2 降解產(chǎn)物的熒光光譜分析

將 25 μL的 AFB1與 975 μL的PADE溶液混合進行降解反應(yīng)，用二氯甲烷萃取有機相在氮氣下吹干，重新溶解在甲醇水溶液中（甲醇：水=1∶1），在熒光分光計下，設(shè)置激發(fā)波長365 nm，掃描發(fā)射光譜[17-18]，AFB1與磷酸鹽緩沖液混合作為對照組。

1.2.3 液質(zhì)檢測降解產(chǎn)物

將 25 μL的AFB1與 975 μL的PADE溶液混合進行降解反應(yīng)，分別在降解0、1、3 d時終止反應(yīng)，萃取有機相，用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測。液質(zhì)采用Thermo Q Exactive Plus LCMS系統(tǒng)，ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 2018專業(yè)軟件繪圖，對產(chǎn)物熒光特性的減弱進行表征，方差分析的顯著性水平是P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜檢測分析

TLC薄層色譜掃描圖顯示（圖1），經(jīng)過降解后，AFB1的熒光特性減弱（仍有部分毒素殘留），RakshaRao等[14]也發(fā)表了相似的結(jié)論，有機相降解液未檢測到新的熒光吸收物質(zhì)，水相降解液也未檢測到吸收物質(zhì)，表明降解產(chǎn)物沒有熒光吸收。

圖1 降解AFB1的TLC分析Fig.1 TLC analysis of degradation of AFB1

2.2 降解產(chǎn)物的熒光光譜分析

AFB1經(jīng)PADE降解后（圖2），產(chǎn)物的熒光特性減弱（仍有部分 AFB1未降解）。AF的熒光特性與其結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯環(huán)有關(guān)，內(nèi)酯環(huán)斷裂會導(dǎo)致熒光消失[19]，則可推測此降解反應(yīng)是 AFB1的內(nèi)酯環(huán)裂解。而篩選銅綠假單胞菌 M19是采用香豆素為碳源的培養(yǎng)基篩選而來，內(nèi)酯環(huán)是香豆素結(jié)構(gòu)的一部分，進一步證實了 PADE對 AFB1的作用位點是內(nèi)酯環(huán)。相同的結(jié)論有Samuel等[2]，Motomura 等[20]，Guan 等[21]，徐丹[17]，蔡國林等[18]的研究。圖中實驗組的熒光光譜較對照組向右（低能量方向）移動，可能是用激發(fā)波長激發(fā)發(fā)射光譜，發(fā)射光譜的最高峰有能量損失，或物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變分子重排消耗了能量，發(fā)射光譜的峰向長波長方向移動。

圖2 PADE對AFB1熒光特性的影響Fig.2 Effect of PADE on the fluorescence characteristics of AFB1

2.3 液質(zhì)聯(lián)用檢測AFB1降解產(chǎn)物

根據(jù) AFB1降解后的 LC-MS圖譜分析以及AFB1降解產(chǎn)物的相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)在降解的過程中，在保留時間7.85 min附近，出現(xiàn)一質(zhì)荷比為227.18的物質(zhì)P，其峰面積逐漸增大（表1），可視為降解產(chǎn)物；AFB1的保留時間為 10.01，隨著降解時間的增加，其峰面積逐漸降低，含量逐漸減少（表1）。根據(jù)物質(zhì)P的一級質(zhì)譜圖（圖3），利用Xcalibur軟件分析其分子式為C14H10O3。與Li[8]報道的降解產(chǎn)物 C14H12O3相比少了兩個氫原子，我們推測，可能在反應(yīng)過程中只發(fā)生了羥基損失但雙鍵并未斷裂。AFB1經(jīng)過降解酶PADE作用后，其內(nèi)酯環(huán)斷裂，失去甲基和兩個一氧化碳，并發(fā)生羥基損失（圖4）。這符合我們之前的判斷，此降解反應(yīng)是 AFB1的內(nèi)酯環(huán)裂解，但此結(jié)果需要進一步驗證。本研究中并未得到任何中間產(chǎn)物，分析原因，可能由于時間點選取的單一性，導(dǎo)致我們并未觀察到降解過程中的其他中間產(chǎn)物。在進一步的實驗中，我們期望通過觀察多個不同降解時間點的產(chǎn)物組成，并通過質(zhì)譜來探索具體且詳盡的AFB1降解機制。

表1 降解過程中峰面積的變化Table 1 Change of peak area during degradation

圖3 物質(zhì)P的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of substance P

圖4 推斷的AFB1可能降解途徑Fig.4 Proposed scheme of AFB1 degradation

3 結(jié)論

通過對 AFB1降解液進行薄層色譜和熒光光譜分析，發(fā)現(xiàn)降解后熒光減弱，表明了 AFB1降解過程中內(nèi)酯鍵的斷裂；結(jié)合薄層色譜和熒光光譜分析，液質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)一分子量為226的降解產(chǎn)物，利用Xcalibur軟件分析其分子式為C14H10O3，并對其降解途徑進行推測，AFB1經(jīng)過降解酶PADE作用后，其內(nèi)酯環(huán)斷裂，失去甲基和兩個一氧化碳，并發(fā)生羥基損失。

在前期的工作中，本課題組已對于降解產(chǎn)物的致突變性和細胞毒性進行了研究，結(jié)果顯示，AFB1降解后致突變性和細胞毒性均明顯降低。本研究已對 AFB1降解產(chǎn)物和降解途徑進行了初步的闡釋。這為AFB1降解菌M19和降解酶PADE降解 AFB1在食品工業(yè)及飼料產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。在進一步的實驗中，我們期望通過觀察多個不同降解時間點的產(chǎn)物組成，并通過質(zhì)譜來探索具體且詳盡的AFB1降解機制。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。