陳 嫚 馬明洋 王紅霞 胡 強(qiáng) 龔迎春

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所藻類生物技術(shù)與生物能源研發(fā)中心，武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

混合營(yíng)養(yǎng)型是很多原生生物的一個(gè)重要特征,近年來已獲得了越來越廣泛的關(guān)注[1,2]?；旌蠣I(yíng)養(yǎng)型鞭毛藻在水生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在, 而且是水生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌的主要攝食者[3]。馬勒姆杯棕鞭藻(Poterioochromonas malhamensis)[4]屬于金藻綱(Chrysophyceae)棕鞭藻目(Ochromonadales)棕鞭藻科(Ochromonadaceae)杯棕鞭藻屬(Poterioochromonas)[5], 是典型的混合營(yíng)養(yǎng)型鞭毛藻, 被認(rèn)為是研究營(yíng)養(yǎng)型轉(zhuǎn)變[6,7]和其他有趣行為如細(xì)胞體積調(diào)控[8,9]、攝食特性[10]及抗菌作用[11]的模式生物。此外,P.malhamensis在攝食產(chǎn)毒藍(lán)藻和降解微囊藻毒素中發(fā)揮重要作用[12,13], 因此可能具有控制水華的巨大潛能。另外, 近年來有報(bào)道指出P. malhamensis是微藻(如小球藻[14,15]和集胞藻[16])的商業(yè)化培養(yǎng)中的主要攝食者并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

雖然P. malhamensis具有重要的生態(tài)學(xué)作用并對(duì)微藻產(chǎn)業(yè)帶來巨大危害, 但它的物種鑒定卻十分混亂。Poterioochromonas藻體單細(xì)胞, 前端兩根不等鞭毛, 葉綠體周生, 光合產(chǎn)物為金藻昆布多糖。具幾丁質(zhì)囊殼, 囊殼由上方的杯形和下方中空的柄組成[4]。由于形態(tài)極為相似, 杯棕鞭藻屬(Poterioochromonas)常與棕鞭藻屬(Ochromonas)混淆, 而囊殼的存在與否是區(qū)分Poterioochromonas與Ochromonas的重要特征[17]。P. malhamensis于1952年首次被報(bào)道, Pringsheim將其命名為Ochromonas malhamensis[18], 該株系即現(xiàn)在P. malhamensis的模式株SAG933-1a。后來Péterfi利用光學(xué)和電子顯微鏡揭示其存在囊殼結(jié)構(gòu), 將其重命名為Poterioochromo-nas malhhamensis[19]。此后, 研究報(bào)道了許多P.malhamensis或Poterioochromonassp., 它們的來源十分廣泛, 如微藻培養(yǎng)系統(tǒng)[14,15], 水華樣品[20], 甚至白蟻的消化道內(nèi)[21]。然而, 已有研究提供的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)非常不完善, 且至今針對(duì)該物種一直沒有詳細(xì)全面的形態(tài)描述。

對(duì)于P. malhamensis的形態(tài)鑒定, 其難點(diǎn)是檢測(cè)幾丁質(zhì)囊殼的存在, 這也是Poterioochromonas屬的重要特征[4]。然而, 這個(gè)重要的形態(tài)學(xué)特征在P.malhamensis有些類群的報(bào)道中并未被發(fā)現(xiàn), 即使是模式株SAG933-1a[18]。此外, 近年來在微囊藻培養(yǎng)體系中分離的Poterioochromonassp. DO-2004[22]和CCMP2718[23], 還有從苔蘚環(huán)境中分離到的其他株系[24]等, 也沒有觀察到囊殼結(jié)構(gòu), 從而給該類群的鑒定帶來很大困惑。因此, 檢查P. malhamensis囊殼的有無十分關(guān)鍵。此外, 研究表明Poterioochromonas形態(tài)變異性大, 包括細(xì)胞大小和形狀, 葉綠體的形態(tài)和數(shù)目, 細(xì)胞表面結(jié)構(gòu), 鞭毛相對(duì)身體的長(zhǎng)度, 甚至是胞內(nèi)儲(chǔ)存物的數(shù)量與種類, 在生長(zhǎng)的不同時(shí)期或周圍的環(huán)境或食物發(fā)生變化時(shí), 其形態(tài)變化很大[25],這些具有高變異性的形態(tài)是鑒定P. malhamensis時(shí)的又一大難題。因此, 尋找穩(wěn)定可信的形態(tài)特征是對(duì)P. malhamensis進(jìn)行物種鑒定的有效手段。

作為形態(tài)高度變化的小型鞭毛藻, 分子數(shù)據(jù)的引入是對(duì)形態(tài)學(xué)特征的重要補(bǔ)充, 并對(duì)其正確的物種鑒定起到關(guān)鍵作用。P. malhamensis的SSU rDNA基因早在1999年就被測(cè)序[26], 從而為該物種的準(zhǔn)確鑒定提供寶貴的參考信息。然而, 直至目前, 該物種的模式株SAG933-1a卻沒有被測(cè)序, 從而極大限制了該物種的準(zhǔn)確鑒定。隨著分子生物學(xué)方法的快速發(fā)展, 越來越多來自環(huán)境樣品的分子序列被鑒定為Poterioochromonasspp., 但沒有任何形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的支撐[27,28], 這對(duì)Poterioochromonas的分類學(xué)研究造成很大困擾。此外, 大量研究表明許多命名為Ochromonas的物種在進(jìn)化樹中位于Poterioochromonas分支內(nèi)[25], 也造成了這兩個(gè)屬的分類混淆。

本研究旨在對(duì)分離自小球藻的P. malhamensis的形態(tài)特征進(jìn)行全面的形態(tài)描述和分子系統(tǒng)發(fā)育分析, 并收集模式株SAG933-1a作為參考, 從而對(duì)P. malhamensis及相似物種的分類鑒定提供詳細(xì)的基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與培養(yǎng)

P. malhamensis樣本采集自美國亞利桑那州立大學(xué)內(nèi)的小球藻培養(yǎng)中, 可大量攝食小球藻, 該株系暫定為CMBB008。這株鞭毛藻在倒置顯微鏡(Olympus CKX41)下通過毛細(xì)玻璃管分離并在pH 6.5的AF-6培養(yǎng)基[29]中培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為(23±1)℃,持續(xù)提供50 μmol photons/(m2·s)的光照。

為對(duì)其形態(tài)學(xué)進(jìn)行比較研究, 分別從德國哥廷根大學(xué)藻種保藏中心(Culture Collection of Algae at G?ttingen University, SAG)購買P. malhamensisSAG933-1a以及從美國海洋藻類和微型生物國家保藏中心(National Center for Marine Algae and Microbiota, NCMA)購買P. malhamensisCCMP3181和P. stipitataCCMP1862, 并進(jìn)行純培養(yǎng), 培養(yǎng)條件同CMBB008。

1.2 光學(xué)顯微鏡觀察

通過顯微鏡(Olympus BX53)的微分干涉功能進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察, 并使用配置的DP80相機(jī)(Olympus)拍照, 用cellSens圖像軟件進(jìn)行拍攝及圖像處理。

在觀察囊殼時(shí), 將1 mL卡爾科弗盧爾-伊文斯藍(lán)染料(Calcofluor White-Evans blue, CW-Eb; Sigma-Aldrich)加入1 mL細(xì)胞懸液中, 然后在暗處靜置30min, 隨后在熒光顯微鏡(激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng) = 355/435 nm)下觀察[30]。葉綠體的數(shù)目通過自發(fā)熒光觀察。為統(tǒng)計(jì)葉綠體數(shù)目, 測(cè)量囊殼長(zhǎng)度及杯體長(zhǎng)寬和細(xì)胞大小等數(shù)據(jù), 隨機(jī)選取至少30個(gè)處于穩(wěn)定期的細(xì)胞進(jìn)行觀察, 長(zhǎng)度通過cellSens的圖像功能進(jìn)行測(cè)量。

將10 μL BODIPY 505/515染料(DMSO溶解, 儲(chǔ)存液濃度為5 mmol/L; Invitrogen)加入1 mL細(xì)胞懸液中進(jìn)行染色, 在室溫下暗處靜置10min后在熒光顯微鏡(激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)=490/515 nm)下觀察胞內(nèi)的油滴[31]。

1.3 電子顯微鏡觀察

鞭毛藻掃描電鏡和透射電鏡的樣品制作方法參照Gong等[32]。此外, 本文還對(duì)該鞭毛藻的胞囊開展掃描電鏡觀察。胞囊的收集方法為: 在AF-6培養(yǎng)基中加入麥粒(1粒/10 mL)靜置培養(yǎng)獲得高濃度的細(xì)胞。隨后提供低光[10—20 μmol photons/(m2·s)],光周期為12h﹕12h。每天在光鏡下監(jiān)測(cè)是否有胞囊的產(chǎn)生。一旦有大量胞囊產(chǎn)生, 將培養(yǎng)液以3000×g離心10min, 棄去上清, 將沉淀在酒精燈上方加熱直至水分蒸發(fā)干。加入2—4滴濃鹽酸, 酒精燈加熱至鹽酸蒸發(fā)。然后依次加入2—4滴濃硫酸和濃硝酸, 重復(fù)上述步驟, 酸處理將去除胞囊的有機(jī)質(zhì)。然后將處理干凈的胞囊在含變色硅膠的真空干燥器中干燥3d[33], 制作掃描電鏡樣品并拍照。

1.4 DNA提取, 擴(kuò)增和測(cè)序

將P. malhamensisCMBB008、SAG933-1a和CCMP3181及P. stipitataCCMP1862的細(xì)胞經(jīng)過12000×g離心5min, 參照DNeasy Blood & Tissue試劑盒(Qiagen)說明書提取細(xì)胞的總DNA。

SSU rDNA基因片段擴(kuò)增采用引物SSU-F(5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′)和SSU-R(5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′)[34], 反應(yīng)程序設(shè)置為95℃預(yù)變性5min; 95℃變性1min, 50℃退火1min, 72℃延伸2min 30s, 35個(gè)循環(huán); 72℃末端延伸10min。rbcL基因片段擴(kuò)增采用設(shè)計(jì)的引物rbcL-F(5′-CAGTAGTATGGACAG-3′)和rbcL-R(5′-CCAACTACAGTTCCAGC-3′), 反應(yīng)程序設(shè)置為95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s, 45℃退火30s, 72℃延伸1min, 35個(gè)循環(huán); 72℃末端延伸10min。

擴(kuò)增的DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳后通過E.Z.N.A.?膠回收試劑盒(OMEGA, Biotek)純化, 然后根據(jù)說明書連接到pGEM-T?載體(Promega)上, 轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)。藍(lán)白斑篩選出白色克隆, 根據(jù)單克隆PCR的電泳結(jié)果挑選5—10個(gè)陽性克隆送往武漢天一輝遠(yuǎn)公司測(cè)序, 最后將四個(gè)株系的SSU rDNA和rbcL序列上傳至GenBank。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了確定P. malhamensisCMBB008及Poterioochromonas屬在金藻綱中的系統(tǒng)發(fā)育地位, 用本研究中測(cè)定的4個(gè)SSU rDNA和3個(gè)rbcL序列, 以及從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中收集的金藻綱的49個(gè)SSU rDNA和28個(gè)rbcL序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 此外分別選取4個(gè)和2個(gè)真眼點(diǎn)藻綱的SSU rDNA和rbcL序列作為外類群。將上述序列利用ClastalX軟件[35]進(jìn)行比對(duì), 然后用SeaView[36]修剪序列, 同時(shí)用最大似然法(Maximum likelihood, ML)[37]和貝葉斯推斷法(Bayesian Inference, BI)[38]進(jìn)行進(jìn)化分析。使用最大似然法在線建樹(http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/), 分支節(jié)點(diǎn)支持率采用Bootstrap 1000次檢驗(yàn); 貝葉斯推斷法分析在MrBayes軟件中進(jìn)行, 共運(yùn)算1000000代, 對(duì)每1000代進(jìn)行1次抽樣。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)描述

P. malhamensisCMBB008細(xì)胞形狀多變, 大部分是球形或卵圓形, 也可見其他不規(guī)則形狀(圖 1A—D), 細(xì)胞大小為6.5—12.4 μm(表 1)。沒有眼點(diǎn)。每個(gè)細(xì)胞有兩根長(zhǎng)短不等的鞭毛: 長(zhǎng)鞭毛是體長(zhǎng)的1—1.5倍, 短鞭毛在顯微鏡下有時(shí)難以觀察到(圖 1A、1B)。長(zhǎng)鞭毛上附生茸毛, 而短鞭毛光滑(圖 2A、2B)。細(xì)胞縱分裂, 細(xì)胞復(fù)制產(chǎn)生兩套鞭毛(圖 2C)。典型的葉綠體呈棕黃色的二裂片狀(圖 1E), 其形狀和顏色會(huì)在不同的生長(zhǎng)階段和培養(yǎng)條件下稍有變化(圖 1A—E)。不含葉綠體的細(xì)胞非常罕見(圖 1F)。細(xì)胞有時(shí)會(huì)通過囊殼的柄附著在顆粒上而聚集成群體(圖 1G)。在細(xì)胞體側(cè)有時(shí)能觀察到帶狀或柄狀的偽足(圖 1D和1H、圖 2F)。透明的伸縮泡位于細(xì)胞前端, 細(xì)胞核在尾部(圖 1B)。細(xì)胞能通過吞噬攝食小球藻或細(xì)菌, 食物顆粒在食物泡中消化(圖 1H、1I)。在攝食過程中, 細(xì)胞通過鞭毛吸附小球藻(圖 2D), 通過細(xì)胞膜攝入小球藻或排出食物殘?jiān)?圖 2E)。細(xì)胞在攝食時(shí)很容易體型拉長(zhǎng)且形成偽足(圖 2F)。穩(wěn)定期的細(xì)胞中常可見油滴和大的昆布多糖液泡(圖 1J、1K)。囊殼在光學(xué)顯微鏡下很難觀察到, 要借助CW-Eb染料在熒光顯微鏡下觀察(圖 1M、1N)。囊殼杯狀結(jié)構(gòu)較寬和淺(圖 1L),平均寬度和深度為9.4和8.0 μm(表 1)?？盏哪覛こＭㄟ^柄基部聚集成簇(圖 1L)。在觀察中還罕見地發(fā)現(xiàn)胞囊形成的初級(jí)階段, 色素體膨大致密, 細(xì)胞外包裹一層厚的膠狀物質(zhì), 細(xì)胞位于囊殼的杯狀結(jié)構(gòu)上(圖 1O、1P)。

細(xì)胞在饑餓條件下產(chǎn)生硅質(zhì)胞囊(圖 3)。胞囊呈球形, 直徑10—15 μm, 表面光滑。胞囊頂部有一個(gè)小孔, 小孔周圍有三層領(lǐng)狀結(jié)構(gòu): 第一層圓錐形,第二層含有三個(gè)向內(nèi)彎曲的凸起, 第三層含有三個(gè)扁平的圓頂(圖 3D—F)。在有些胞囊中, 小孔被一小型的塞子封口(圖 3F)。

透射電鏡照片揭示了胞質(zhì)中細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)(圖 4)。細(xì)胞有一個(gè)大的細(xì)胞核(1.6—2.1 μm), 核仁和細(xì)胞質(zhì)清晰可見(圖 4A、4B和4E)。高爾基體是由許多半圓環(huán), 即扁平膜囊堆積而成, 周圍有大量圓形囊泡(圖 4F)。葉綠體和線粒體的數(shù)目和大小會(huì)隨著細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)方式的不同而發(fā)生輕微改變: 在細(xì)胞自養(yǎng)時(shí), 葉綠體很明顯, 而線粒體數(shù)量少且個(gè)體小(圖 4A); 當(dāng)轉(zhuǎn)化為吞噬營(yíng)養(yǎng)時(shí), 會(huì)出現(xiàn)大量食物泡, 葉綠體會(huì)變得很小或消失, 但是線粒體的數(shù)目或體積大小會(huì)增大(圖 4B)。兩片二裂片狀葉綠體中間有橋連, 細(xì)胞核和葉綠體共用外膜(圖 4E)。鞭毛呈現(xiàn)“9+2”型微管結(jié)構(gòu)(圖 4D)。另外, 可見鞭毛根部的過渡區(qū), 過渡螺旋結(jié)構(gòu)及含過渡平面的基體等超微結(jié)構(gòu)(圖 4C和G)。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

基于最大似然法和貝葉斯推斷法(ML/BI)構(gòu)建SSU rDNA(圖 5)和rbcL(圖 6)基因的系統(tǒng)發(fā)育樹以確定P. malhamensisCMBB008的系統(tǒng)發(fā)育地位以及該屬與金藻綱中其他物種的關(guān)系。通過測(cè)序獲得P. malhamensisCMBB008, SAG933-1a, CCMP 3181和P. stipitataCCMP1862的SSU rDNA基因序列(登錄號(hào)分別為MH536660、MH536656、MH 542674和MH536657)和前三株P(guān). malhamensis的rbcL基因序列(登錄號(hào)分別為MH643691、MH64 3685和MH643684)。系統(tǒng)發(fā)育分析最后比對(duì)的SSU rDNA序列包含57個(gè)物種1686個(gè)堿基,rbcL序列包含33個(gè)物種914個(gè)堿基。

圖1 P. malhamensis CMBB008的光學(xué)形態(tài)照片F(xiàn)ig. 1 Light micrographs of P. malhamensis CMBB008

SSU rDNA基因樹(圖 5)包含金藻綱中的5個(gè)目。所有的Poterioochromonas聚為一支, 位于棕鞭藻目(Ochromonadales)中, 該分支內(nèi)分3個(gè)群(A、B和C):P. stipitataCCMP1862和Poterioochromonassp. ACOI-1258形成分支A;P. malhamensisCCMP 3181, HT-2和兩株P(guān)oterioochromonassp.(CCMP 2718和CCMP2060)形成分支B; SAG933-1a和其他P. malhamensis, 3株P(guān)oterioochromonassp., 2株未培養(yǎng)的金藻共同構(gòu)成分支C。在分支C中, CMBB 008株系最先分化, 其他株系構(gòu)成另外一支后分化。此外, A支與B和C構(gòu)成的進(jìn)化支以較高的支持率(ML/BI=73.7%/0.92)形成姊妹支, B和C形成姊妹支在SSU rDNA樹中支持率較低(ML/BI<50%/0.70)。Poterioochromonas支系與含3株未定種的分支D親緣關(guān)系密切(ML/BI>90%/0.95)。最后, A-D共同形成的大分支與4株Ochromonas也形成親緣關(guān)系很近的姐妹支(ML/BI>90%/0.95)。與Poterioochromonas形態(tài)相似的Ochromonas屬位于棕鞭藻目的兩個(gè)分支中。

表1 Poterioochromonas不同種群的形態(tài)比較Tab. 1 Morphology comparison between different population of Poterioochromonas

圖2 P. malhamensis CMBB008的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 2 Scanning electron micrographs of P. malhamensis strain CMBB008

在NCBI中金藻綱的rbcL序列相對(duì)較少, 為獲得更準(zhǔn)確的系統(tǒng)發(fā)育分析, 本研究收集了幾乎所有的Poterioochromonas的rbcL序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 6), 結(jié)果表明基于不同基因的進(jìn)化樹整體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)略有區(qū)別, 但Poterioochromonas支的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與SSU rDNA基因樹表現(xiàn)出一致性, 也分為支持率很高的三個(gè)支系。

3 討論

3.1 P. malhamensis的種間形態(tài)學(xué)比較

基于詳細(xì)的形態(tài)學(xué)觀察, 本研究分離的CMBB 008株系與最早對(duì)P. malhamensis的描述幾乎是一致的[18,19], 特征如下: 細(xì)胞呈球形或卵形, 有一個(gè)或兩個(gè)二裂片狀的葉綠體, 沒有眼點(diǎn), 有兩根不等鞭毛和鞭毛附近的伸縮泡, 細(xì)胞后部的金藻多糖液泡及特殊的囊殼結(jié)構(gòu)。BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)結(jié)果表明CMBB008與模式株SAG933-1a是同一個(gè)種(SSU rDNA-ITS基因序列相似度99.76%)。因此形態(tài)學(xué)和分子數(shù)據(jù)均支持本研究中分離自亞利桑那小球藻培養(yǎng)的鞭毛藻為P.malhamensis。

A—C. 光鏡照片; D—F. 掃描電鏡照片; 圖F中箭頭表示孔塞; 標(biāo)尺: A—C為5 μm; D—F為2 μm A—C. Light micrographs; D—F. Electron micrographs. Arrow in F represents plug in pore. Scale bars: 5 μm for A—C, 2 μm for D—F

到目前為止,Poterioochromonas屬僅報(bào)道3個(gè)種, 分別是P. malhamensis[19]、P. stipitata[17]和P.nutans[39]。然而有關(guān)這3個(gè)物種的區(qū)分存在爭(zhēng)議, 每個(gè)物種都找不到一個(gè)在形態(tài)上可以與其他物種區(qū)分的明顯特征[19]。P. stipitataScherffel為該屬模式種, 單細(xì)胞, 球形或長(zhǎng)條形。細(xì)胞7—10 μm, 長(zhǎng)鞭毛長(zhǎng)達(dá)20 μm, 長(zhǎng)鞭毛是短鞭毛的2.5倍長(zhǎng)。一個(gè)葉綠體, 無眼點(diǎn)。有杯狀囊殼, 囊殼后端有一條細(xì)而中空的柄[17]。P. nutans的囊殼比P. stipitata更寬和淺,有1—3個(gè)葉綠體[39]。Péterfi[19]認(rèn)為P. malhamen-sis和P. stipitata可能屬于同種異名, 但缺少更多數(shù)據(jù)的支持。后來Peck[30]認(rèn)為P. malhamensis囊殼柄的基部為單一的足, 少數(shù)足具2條分支, 而P. stipitata的足具3條或多于3條分支, 此特征可用于區(qū)分P. malhamensis和P. stipitata。本研究針對(duì)前人研究中爭(zhēng)議比較大的葉綠體數(shù)目和囊殼形態(tài)這兩個(gè)特征進(jìn)行了深入的觀察比較。

葉綠體數(shù)目一直是Poterioochromonas分類學(xué)研究者廣泛關(guān)注且存在爭(zhēng)議的一個(gè)特征。根據(jù)Pringsheim對(duì)P. malhamensis的模式株SAG933-1a的描述, 該物種葉綠體的大小和顏色變化較大, 一個(gè)葉綠體由兩個(gè)部分連接而成[18], 但對(duì)于同一株系,Péterfi[19]觀察到1—3個(gè)葉綠體或者更多。P.nutans也有1—3個(gè)葉綠體[39], 而P. stipitata有1個(gè)[17]或2個(gè)[22](表 1)。本研究經(jīng)過對(duì)大量細(xì)胞的觀察, 發(fā)現(xiàn)P. malhamensisSAG933-1a的葉綠體有1—2個(gè),P.malhamensisCCMP3181和P. stipitataCCMP1862通常只有1個(gè)葉綠體, 而CMBB008的葉綠體與SAG 933-1a類似, 有1—2個(gè)。此外, 本研究通過透射電鏡的觀察(圖 4B), 發(fā)現(xiàn)P. malhamensis處于吞噬營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)時(shí)葉綠體會(huì)變小, 表明葉綠體數(shù)目和大小在不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下也會(huì)有所變化, 這與前人的研究一致[15,21]。為此, 我們推斷葉綠體數(shù)目的變異性在不同種甚至是同一物種的不同株系或者同一株系的不同營(yíng)養(yǎng)時(shí)期中普遍存在, 因此不適合用葉綠體數(shù)目來進(jìn)行Poterioochromonas不同物種之間的區(qū)分。

圖4 P. malhamensis CMBB008的透射電鏡照片F(xiàn)ig. 4 Transmission electron micrographs of P. malhamensis strain CMBB008

另外, 學(xué)者們普遍認(rèn)為囊殼是鑒定Poterioochromonas的重要結(jié)構(gòu)[23]。然而在P. malhamensis的物種鑒定過程中, 有些被鑒定為P. malhamensis的物種完全沒有觀察到囊殼結(jié)構(gòu), 即使是P. malhamensis的模式株SAG933-1a, 其囊殼也被觀察到時(shí)有時(shí)無, 這給其分類帶來很大困擾。因此有學(xué)者懷疑Poterioochromonas中含有一些沒有囊殼的物種[23], 如果該結(jié)論成立, 則該屬的形態(tài)特征描述需要重新定義。為此, 我們對(duì)所分離的CMBB008以及從不同保藏中心收集的P. malhamensisSAG933-1a、CCMP3181和P. stipitataCCMP1862的囊殼進(jìn)行了詳細(xì)的觀察, 發(fā)現(xiàn)它們都具有囊殼, 表明囊殼是P. malhamensis或Poterioochromonas的基本結(jié)構(gòu)。雖然該結(jié)果僅僅是基于四個(gè)株系的觀察, 但是仍具有重要的意義。將我們的研究方法和前人進(jìn)行比較, 有兩個(gè)問題值得引起注意: 首先,Poterioochromonas具有兩種形態(tài), 即不含囊殼的游動(dòng)細(xì)胞形態(tài)和具有囊殼的有柄固著形態(tài), 在培養(yǎng)過程中細(xì)胞大多是以游離的形式存在, 此時(shí)很難觀察到囊殼,因此給物種鑒定帶來困難, 而已有研究幾乎都是根據(jù)游離細(xì)胞的觀察判斷是否含有囊殼。在本研究中我們發(fā)現(xiàn), 雖然附著有細(xì)胞的囊殼結(jié)構(gòu)很難觀察到, 但是沒有細(xì)胞附著的囊殼卻普遍存在且常常出現(xiàn)多個(gè)囊殼聚集成簇的現(xiàn)象(圖 1G和1L)。這些光禿的囊殼柄是細(xì)胞游離后留下來的, 由于其主要成分是幾丁質(zhì)[30], 因此可以在培養(yǎng)物中存在較長(zhǎng)的時(shí)間, 本研究正是基于這些游離囊殼柄的觀察判斷細(xì)胞含有囊殼結(jié)構(gòu)的。另外, 在本研究中我們采用CW-Eb對(duì)囊殼進(jìn)行染色, 該方法極大提高了囊殼在顯微鏡下的可視性。雖然早在1980年Herth[40]已提出可用CW-Eb對(duì)P. malhamensis的囊殼結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效染色, Peck[30]也利用該方法對(duì)一些金藻的囊殼開展了研究, 但在Poterioochromonas的鑒定中并沒有得到廣泛應(yīng)用, 有些學(xué)者在形態(tài)學(xué)觀察過程中沒有利用任何染色[22], 有些染色方法明顯沒有CW-Eb效果好[23]。因此本研究認(rèn)為所有的P. malhamensis都有囊殼, 至少在生活史的某些階段, 前人沒有觀察到囊殼結(jié)構(gòu)主要是受限于所使用的方法。我們強(qiáng)烈建議將CW-Eb染色作為觀察Poterioochromonas囊殼結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)方法, 此外在觀察過程中不能僅對(duì)游動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行觀察, 還要對(duì)該細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)行全面詳細(xì)觀察, 采樣過程中注意對(duì)培養(yǎng)器皿底部樣品的采集, 以快速確定該細(xì)胞是否可以形成囊殼結(jié)構(gòu)。

圖5 基于金藻綱SSU rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on the SSU rDNA gene sequences of Chrysophyceae

圖6 基于金藻綱rbcL基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogenetic tree based on the rbcL gene sequences of Chrysophyceae

以上觀察表明葉綠體和囊殼在細(xì)胞的不同生活史時(shí)期其形態(tài)表現(xiàn)出較大的變異性, 將其作為Poterioochromonas屬不同物種之間的區(qū)分標(biāo)志存在很大困難, 為此, 本研究試圖通過對(duì)形態(tài)上更為穩(wěn)定的胞囊的觀察, 為該屬的物種鑒定尋找更為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)特征。胞囊是細(xì)胞在饑餓狀態(tài)下形成以抵御不良環(huán)境, 前人在鑒定與Poterioochromonas形態(tài)相似的Ochromonas屬時(shí), 認(rèn)為胞囊形態(tài)比游泳細(xì)胞的形態(tài)更穩(wěn)定可靠[41,42]。此前, 僅Andersen等[23]對(duì)兩株P(guān)oterioochromonas未定種(CCMP2060和CCMP2718)的胞囊形態(tài)進(jìn)行報(bào)道。本研究通過掃描電鏡詳細(xì)觀察了CMBB008的胞囊(圖 3), 發(fā)現(xiàn)其與上述兩個(gè)物種的領(lǐng)狀結(jié)構(gòu)有很大不同, 此外本研究觀察到CMBB008的胞囊具有孔塞, 該結(jié)構(gòu)在前兩株研究中沒有被發(fā)現(xiàn)?？紤]到胞囊結(jié)構(gòu)在不同株系間的顯著區(qū)別, 它很有可能作為種間區(qū)分的有效特征。然而, 目前有描述胞囊結(jié)構(gòu)的株系非常少,因此后續(xù)需要對(duì)更多Poterioochromonas的胞囊結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面觀察, 以證明胞囊結(jié)構(gòu)是否有Poterioochromonas種間區(qū)分的潛力。

3.2 P. malhamensis的種內(nèi)形態(tài)學(xué)比較

在Poterioochromonas屬中, 雖然僅有3個(gè)物種,但是P. malhamensis無疑是最受關(guān)注而且是報(bào)道最多的物種。將本研究中的CMBB008與P. malhamensis其他種群比較, 發(fā)現(xiàn)不同種群細(xì)胞大小相似, 但是囊殼變化較為明顯(表 1)。CMBB008的囊殼長(zhǎng)度總體小于模式株SAG933-1a(18.3—47.5 μmvs.37.2—129.9 μm), 而且P. malhamensis的囊殼長(zhǎng)度總體大于P. stipitata(12—130 μmvs. 10—24 μm)。除囊殼長(zhǎng)度外, 比較研究結(jié)果表明, CMBB008的囊殼杯狀較深且寬(8.0 μm深和9.4 μm寬), SAG 933-1a適中(6.7 μm深和7.8 μm寬), 而P. stipitata較淺而窄(5.0 μm深和6.0 μm寬)?？偟膩碚f,P. stipitata的囊殼杯狀比P. malhamensis更小。另一點(diǎn)需要注意的是, 本研究所測(cè)量的SAG933-1a囊殼比前人的描述顯著更長(zhǎng)(37.2—129.9 μmvs. 10—40 μm), 囊殼的杯狀形態(tài)也稍有區(qū)別(表 1)。因?yàn)槟覛ぞ哂兄匾纳鷳B(tài)學(xué)作用[30], 并存在形態(tài)可塑性, 據(jù)報(bào)道室內(nèi)培養(yǎng)超過30年的P. malhamensis相比于新分離的株系在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)上都會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生不同的響應(yīng)[43], 因此長(zhǎng)期在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)可能導(dǎo)致囊殼形態(tài)發(fā)生改變?？傊? 僅通過形態(tài)學(xué)特征難以區(qū)分不同種群, 后期有待尋找合適的分子標(biāo)記以對(duì)種群進(jìn)行有效區(qū)分。

3.3 Poterioochromonas的系統(tǒng)發(fā)育分析

關(guān)于Poterioochromonas的系統(tǒng)發(fā)育研究, 以前的報(bào)道數(shù)據(jù)十分有限。此外, 由于Ochromonas個(gè)體微小, 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 且與Poterioochromonas形態(tài)極為相似, 主要區(qū)別在于后者具有囊殼結(jié)構(gòu)。由于在早期研究中, 囊殼結(jié)構(gòu)的染色方法沒有得到很好的應(yīng)用, 導(dǎo)致很多本應(yīng)屬于Poterioochromonas的物種被錯(cuò)誤鑒定為Ochromoanas。因此在進(jìn)化樹中Poterioochromonas常常與Ochromonas類群分布在一起[24,28],導(dǎo)致這兩個(gè)屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的混淆。本研究從NCBI收集了近緣物種的基因序列進(jìn)行分析, 結(jié)果證實(shí)所有的Poterioochromonas聚在一起(分支A+B+C)且與Ochromonas分開(圖 5和圖 6), 表明Poterioochromonas是單系發(fā)生的。在進(jìn)化樹中,Poterioochromonas分支先與3個(gè)來自環(huán)境樣品的未鑒定種聚為一支, 然后與Ochromonas分支聚在一起, 推測(cè)含環(huán)境樣品的分支可能是Poterioochromonas與Ochromonas的過渡階段。

如上所述, 依據(jù)形態(tài)特征, 目前Poterioochromonas屬只有三個(gè)有效種, 除了研究較多的P.malhamensis外,P. stipitata和P. nutans由于沒有模式標(biāo)本和模式株保存, 這兩個(gè)種的確鑿性仍值得懷疑。有趣的是, 在本研究中, SSU rDNA和rbcL基因樹的Poterioochromonas支中也顯示了三個(gè)明顯的分支(圖 5)。SSU rDNA樹中Poterioochromonas中的大部分株系聚在P. malhamensis模式株SAG933-1a所在的分支C, 表明已報(bào)道的Poterioochromonas株系大部分為P. malhamensis。意外的是, 本研究中基于兩種基因構(gòu)建的進(jìn)化樹均表明CMBB008和P. malhamensisSAG933-1a所在的分支有一定的距離, 且支持率較高(SSU rDNA樹中ML/BI = 86.1%/0.92,rbcL樹中ML/BI > 90%/0.95)。由于CMBB008和SAG933-1a在形態(tài)上很難區(qū)分, 雖然我們發(fā)現(xiàn)它們囊殼柄的長(zhǎng)度存在一定差異, 但是由于該結(jié)構(gòu)受環(huán)境因子影響較大, 而且針對(duì)SAG933-1a自身而言,其長(zhǎng)度變化也存在很大差異, 所以目前暫時(shí)不能作為區(qū)分兩者的標(biāo)志。此外, 兩者的SSU rDNA基因序列1769 bp中只有2個(gè)堿基差異, 相似度高達(dá)99.89%, 因此不建議鑒定為其他物種。本研究仍將分支C中的CMBB008鑒定為P. malhamensis, 后續(xù)需要更多基因標(biāo)記或基因組學(xué)信息進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。分支C中還包括幾株未定種, 例如分離自微囊藻的Poterioochromonassp. DO-2004[22]、ZX1[20]及UTEX-LB-2575, 還有一些分離自環(huán)境樣品的克隆。這些物種由于缺乏全面的形態(tài)特征描述, 以及缺乏模式株序列作為參考, 因此很難鑒定到種。本研究以P. malhamensis的模式株SAG933-1a作為參考, 由于它們的相似度非常高, 因此可以將上述未定物種鑒定為P. malhamensis。另一個(gè)物種P. stipitataCCMP1862位于分支A, 同Andersen[25]構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹一樣,P. stipitataCCMP1862總是與Poterioochromonassp. ACOI-1258聚為一支, 說明ACOI-1258可能為P. stipitata。然而,P. stipitataCCMP1862并不是分離自Poterioochromonas模式種P. stipitataScherffel的來源地, 所以不能確定CCMP 1862所在的分支A是否可以代表P. stipitata。因此后續(xù)有待于從模式種來源地收集P. stipitata并進(jìn)行詳細(xì)和準(zhǔn)確的鑒定, 以對(duì)P. stipitata的有效性進(jìn)行最終確認(rèn)。此外, 意外的是被鑒定為P. malhamensis的CCMP3181并沒有分布在分支C中, 而是與P.malhamensisHT-2和兩株P(guān)oterioochromonas的未定種形成另一分支(分支B)。結(jié)合CCMP3181在形態(tài)上不同于其他P. malhamensis的特性, 如單個(gè)葉綠體和頻繁產(chǎn)生胞囊(表 1), 認(rèn)為將該株系鑒定為P.malhamensis有待懷疑, 后續(xù)更多來自B類群的形態(tài)學(xué)和分子數(shù)據(jù)將有利于闡述這一疑點(diǎn)。

4 總結(jié)

本文對(duì)一株危害小球藻的P. malhamensis進(jìn)行了詳盡的光學(xué)和超微結(jié)構(gòu)描述以及分子系統(tǒng)發(fā)育研究。首次揭示該物種胞囊的掃描電鏡結(jié)構(gòu), 并推測(cè)胞囊結(jié)構(gòu)可作為Poterioochromonas屬種間區(qū)分的特征。此外, 囊殼是用來鑒定Poterioochromonas的重要特征, 建議將CW- Eb染色作為觀察囊殼的標(biāo)準(zhǔn)方法。SSU rDNA和rbcL基因構(gòu)建的進(jìn)化樹均表明Poterioochromonas屬是單系的, 且Poterioochromonas分支分為三支, 預(yù)示著這些類群可能涵蓋三個(gè)種。在下一步的工作中, 亟需獲得更多株系尤其是模式株的形態(tài), 分子序列以及基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 以對(duì)該類群的物種多樣性進(jìn)行全面厘清。

致謝:

感謝華盛頓大學(xué)Robert A. Andersen對(duì)本文提出寶貴的修改意見。