唐瓊英 謝巨洪 夏正龍 蔡繆熒 吳云明 白鹿淮 杜厚寬李景芬 楊國梁,

(1. 湖州師范學院浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室, 中國水產科學研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點實驗室, 湖州 313000; 2. 江蘇數豐水產種業(yè)有限公司, 高郵 225654)

羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)原產于東南亞的熱帶和亞熱帶地區(qū), 是淡水蝦類養(yǎng)殖中個體最大的品種[1]。中國大陸自1976年引進以來, 已產生了可觀的經濟效益并擁有良好的發(fā)展前景。但長期以來, 由于人工養(yǎng)殖中親本管理不嚴謹(如近交等)導致種質衰退嚴重(如生長緩慢、病害頻發(fā)等)[2], 尤其是近年來發(fā)生的長不大、性成熟提前的“鐵蝦”, 使羅氏沼蝦產業(yè)遭受了巨大危害。因此,進一步培育滿足產業(yè)與市場需求的經濟性狀優(yōu)良的羅氏沼蝦新品種或新品系迫在眉睫。遺傳多樣性是物種進化的基礎, 與進化潛力和適應力呈正相關, 遺傳多樣性越高的群體, 其生產性狀如活力、生長速度、產卵量、環(huán)境適應力及抗病性能等提高的潛力越大[3]。因此, 遺傳多樣性水平不僅制約著生物的適應性進化, 也是選擇育種的前提。

微衛(wèi)星(Microsatellite)即短串聯重復序列(Short tandem repeats, STRs)或簡單重復序列(Simple sequence repeats, SSR), 是一種廣泛應用于群體遺傳多樣性檢測及親緣關系鑒定的分子標記[4,5]。線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)是一種核外的遺傳物質, 因具有結構簡單、進化速度適中、易擴增等優(yōu)點, 被認為是研究群體遺傳多樣性和遺傳結構的有力工具[6,7]。目前, 針對羅氏沼蝦不同野生或養(yǎng)殖群體, 已有一些采用微衛(wèi)星標記[3,8—12]或線粒體基因[13—15]進行遺傳多樣性的研究報道, 但這些研究多集中在不同的養(yǎng)殖群體上, 親本來源背景未知, 且部分研究采用的群體較少, 如鐘丹丹等[3]僅研究了2個群體。另外, 在已有的線粒體基因研究中, 各群體覆蓋的個體數極少, 如楊學明等[13]3個群體僅17個個體, 姚茜等[14]3個群體僅16個個體, 且研究采用的基因片段大多數較短, 約400—500 bp, 提供的信息量有限。目前羅氏沼蝦中還未見將微衛(wèi)星和線粒體基因相結合對群體遺傳多樣性進行研究的報道。微衛(wèi)星和線粒體分別是細胞核和細胞質遺傳, 將二者相結合進行研究, 能更全面地反映生物的遺傳多樣性, 應用較為廣泛, 如東北林蛙(Rana dybowskii)[16]、中華蜜蜂(Apiscerana cerana)[17]、梨小食心蟲(Grapholita molesta)[18]等物種的遺傳多樣性研究等。

本研究將微衛(wèi)星和線粒體基因相結合, 對羅氏沼蝦不同種質資源的育種群體進行遺傳多樣性研究, 期望全面了解國內已有種質資源的遺傳背景,為優(yōu)良品種選育提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為取自羅氏沼蝦育種基地(江蘇數豐水產種業(yè)有限公司)培育及收集的不同來源的4個育種群體, 包括: 選育3代的數豐核心群體(SF)、引進的正大群體(ZD)、正大和數豐雜交的群體(ZDS)、正大子代和數豐雜交的群體(ZD2S)。數豐核心群體因群體數量較大選取60個個體, 其他每個群體各取30個個體, 分別剪取蝦尾肌肉組織, 用95%的乙醇保存, 并凍存于-20℃冰箱, 供后續(xù)DNA提取。

1.2 基因組DNA提取、PCR擴增和測序

肌肉組織基因組DNA提取采用高鹽抽提法,用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的完整性,微量分光光度計檢測濃度和純度后, 用滅菌水稀釋至50 ng/μL供后續(xù)PCR擴增實驗。

采用7對熒光修飾標記(HEX或FAM)的微衛(wèi)星引物對各群體進行PCR擴增。微衛(wèi)星引物來自文獻[3, 8]及本團隊開發(fā)的引物。引物序列、目的片段大小及擴增條件見表 1。PCR反應體系為20 μL,包括: 2×TaqMix (TaKaRa) 10 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、滅菌水 7 μL和DNA 1 μL。PCR反應程序為: 95℃預變性3min, 然后94℃變性30s、54—62℃退火30s、72℃延伸45s, 重復35次循環(huán), 最后72℃延伸10min。

線粒體COⅠ和12S rRNA基因的引物根據羅氏沼蝦GenBank中的線粒體基因組全序列(登錄號為AY659990和NC006880)進行設計。PCR反應體系為50 μL, 其中包括: 滅菌水31 μL、10×buffer 5 μL、2.5 mmol/L的dNTP(TaKaRa) 4 μL、25 mmol/L的MgC12(TaKaRa) 3 μL、10 μmol/L的上下游引物分別為 1 μL、5 U/μL的Taq酶(TaKaRa) 0.2 μL和DNA 4.8 μL。PCR反應采用Touchdown程序: 95℃預變性5min; 然后95℃變性30s、56—62℃退火30s、72℃延伸30s, 重復10次循環(huán), 每次循環(huán)降低1℃; 然后再95℃變性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s, 重復25次循環(huán); 最后72℃延伸20min。

表1 用于本研究的微衛(wèi)星引物相關信息Tab. 1 Primers used in the present study

PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。微衛(wèi)星分型使用ABI3730XL全自動DNA測序儀進行, 獲得每個個體在不同微衛(wèi)星位點的等位基因數據, 采用軟件GeneMarker V2.2.0對擴增產物片段大小進行讀取。線粒體基因采用與PCR擴增相同的引物進行雙向測序。以上測序工作均由武漢天一輝遠生物科技公司完成。

1.3 數據處理

對獲得的微衛(wèi)星位點分型數據進行校正。利用Genepop 4.0軟件進行哈迪溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)檢驗。采用Cervus 3.0軟件計算等位基因數(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息量(PIC)。利用Arlequin 3.5軟件來估計各種群間遺傳分化指數(FST), 進行分子變異分析(AMOVA), 包括群體內以及群體間變異。

線粒體基因序列用Clustal X2.1軟件進行比對,并在Seaview中進行手工校正。采用MEGA7.0.26對序列的基本信息進行統(tǒng)計, 如序列長度、堿基組成、變異位點的數目和簡約信息位點數目等。利用軟件DnaSP 5.0和Arlequin進行單倍型數目(Number of haplotype,H)、單倍型多樣性(Haplotype diversity,Hd)和核苷酸多樣性(Nucleotidae diversity,π)等參數估計, 并采用最大似然 (ML)法對單倍型序列進行聚類分析。

2 結果

2.1 基于微衛(wèi)星位點的羅氏沼蝦育種群體遺傳多樣性

經檢驗, 7個微衛(wèi)星位點都極顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P<0.01)。所有群體所有微衛(wèi)星位點的等位基因數(Na)為14—24個, 平均每個位點為19.43個等位基因, 平均觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.615、0.898和0.887。在7個位點中, 座位29AG62的He和PIC都最高, 分別為0.919和0.910; 座位27AG62的He和PIC值均最低, 分別為0.878和0.864。4個群體中, SF群體平均每個座位的He和PIC都最高, 分別為0.874和0.854; ZD2S的其次,He和PIC分別為0.863和0.834;而ZDS群體的平均He和PIC都最低, 分別為0.798和0.761 (表 2)。

表2 各微衛(wèi)星位點在4個羅氏沼蝦育種群體中的遺傳多樣性參數Tab. 2 Genetic diversity parameters of each microsatellite locus in the four breeding populations of Macrobrachium rosenbergii

各育種群體間及群體內分子變異分析(AMOVA)結果表明, 羅氏沼蝦各育種群體的變異主要來自群體內的變異, 占總變異的93.59%, 而來自群體間的變異較小, 僅占總變異的6.31% (表格未列出)。各群體間的遺傳分化指數(FST)見表 3, 群體間的遺傳分化均達極顯著水平。其中, ZD和ZDS群體間的遺傳分化最大,FST值為0.10438, 而SF和ZD2S間的分化最小,FST值為0.04166。ZD和ZD2S間及ZD和SF群體間的FST值分別為0.06539和0.07281。

表3 基于微衛(wèi)星位點的羅氏沼蝦各育種群體間遺傳分化指數Tab. 3 Genetic differentiation index (FST) of the breeding populations of Macrobrachium rosenbergii based on SSR

2.2 基于線粒體基因的羅氏沼蝦育種群體遺傳多樣性

共獲得4個群體117個個體的線粒體COⅠ基因及137個個體的12S rRNA基因序列。COⅠ基因比對長度為1247 bp, 12S rRNA基因比對長度為798 bp。COⅠ基因共檢測到21個變異位點, 其中14個為簡約信息位點; 117個個體共享9個單倍型, 單倍型多樣性(Hd)為0.425, 核苷酸多樣性(π)為0.00371(表 4)。在798 bp的12S rRNA基因中, 共檢測到10個變異位點, 其中9個為簡約信息位點; 137個個體共識別12個單倍型,Hd為0.660,π為0.0023(表 4)。

將兩個基因進行組合分析, 獲得149個個體2045 bp的組合序列, 含31個變異位點, 其中27個為簡約信息位點; 共識別27個單倍型,Hd值和π值分別為0.846和0.00313; 在4個群體中, ZD2S的Hd值最高(0.876), 其次為SF群體(0.835), ZDS的Hd值最低(0.594); 對于π值, SF群體的最高(0.00422), 其次為ZD2S(0.00349), ZD群體的最低(0.00044, 表 4)。

表4 羅氏沼蝦育種群體線粒體COⅠ、12S rRNA基因及兩個基因組合序列的遺傳多樣性參數Tab. 4 Genetic diversity parameters of mitochondrial COⅠ, 12S rRNA and their concatenated gene sequences in each breeding populationof Macrobrachium rosenbergii

在兩個基因組合序列獲得的27個單倍型中,Hap6包含的個體數最多, 有46個, 出現頻率為30.87%, 分布于ZD2S、SF和ZD三個群體中; 其次為單倍型Hap2, 包含29個個體, 出現頻率為19.46%,涵蓋了所有4個群體。Hap1和Hap9分別包含15和13個個體, 其他23個單倍型包含的個體數在1—9個,有17個單倍型只包含1個個體, 為特有單倍型。在各群體中單倍型數量不一, 其中ZDS群體29個個體定義了5個單倍型, ZD2S群體30個個體定義了11個單倍型, SF群體60個個體定義了19個單倍型, ZD群體30個個體定義了7個單倍型。各群體單倍型分布情況見表 5。

基于最大似然法構建的27個單倍型聚類關系見圖 1。所有單倍型聚為兩個分支, Clade A和Clade B。Clade A包含16個單倍型, 主要是來自SF群體的個體, 同時有部分ZD2S的個體及個別ZD和ZDS的個體; ZD群體的單倍型主要聚類在Clade B, 該分支也包含較多的SF和ZD2S群體及部分ZDS群體的單倍型。所有單倍型間的遺傳距離介于0.001—0.014,兩個分支Clade A和Clade B間的平均遺傳距離為0.009。從整體上看, 單倍型間的遺傳差異較小。

基于COⅠ和12S rRNA基因組合序列的各群體兩兩間遺傳分化指數(FST)結果表明, 群體間遺傳分化較小,FST值為-0.02226—0.07310。ZD2S群體和ZDS群體間遺傳分化最大,FST值為0.07310, 且分化顯著; ZDS和ZD群體間及ZDS和SF群體間的FST值分別為0.03899和0.01419, 遺傳分化較小, 且分化不顯著; ZD和ZDS群體間、ZD和SF群體間及ZD2S和SF群體間的FST值為負值(表 6), 暗示群體間幾乎不存在分化。

3 討論

3.1 基于微衛(wèi)星位點的多態(tài)性及群體遺傳分化

在本研究中哈迪溫伯格平衡(HWE)檢驗結果顯示, 7個微衛(wèi)星座位都顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P<0.05), 這與羅氏沼蝦的其他微衛(wèi)星研究結果類似[3]。這可能是因為研究對象為人工選育群體, 群體間存在非隨機交配等導致偏離哈迪溫伯格平衡[19]。另一方面, 這也可能與無效等位基因相關[20]。

表5 羅氏沼蝦各育種群體COⅠ和12S rRNA基因組合序列單倍型在各群體中的分布Tab. 5 Distribution of combined COⅠ and 12S rRNA sequence haplotypes in each breeding population of Macrobrachium rosenbergii

多態(tài)信息含量(PIC) 能反映群體的遺傳變異程度和位點多樣性等[21]。根據Botstein等[22]的劃分標準,PIC≥0.5為高度多態(tài)性; 0.25≤PIC<0.5為中度多態(tài)性;PIC< 0.25為低度多態(tài)性。在本研究結果中, 7個微衛(wèi)星位點的PIC值除ZDS群體27AG62位點為0.499外, 其余各群體每個位點的PIC值均大于0.5, 為高度多態(tài)性。在4個群體中, SF群體平均每個座位的PIC最高(0.854), ZD2S的其次(0.834)。

雜合度是衡量群體遺傳多樣性的重要參數。本研究中的4個羅氏沼蝦群體均表現出較高的雜合度, 其中SF群體平均每個位點的期望雜合度(He)最高, 為0.874, ZD2S群體的其次, 為0.863。從整體上,所有群體所有位點的平均觀測雜合度(Ho0.615)小于平均期望雜合度(0.898), 表明這4個群體可能因選育丟失了部分雜合子。雜合子缺失將導致純合子增加, 提高有害等位基因純合的幾率, 近交衰退幾率升高, 從而降低物種對環(huán)境變化的適應性[23]。因此, 在缺乏外來優(yōu)勢野生型群體作為育種親本時,選擇雜合子較多的群體進行育種可以降低近交衰退幾率。

遺傳分化指數(FST)是反映各群體間遺傳分化的重要指標[24]。本研究基于7個微衛(wèi)星位點分析的結果表明, 除SF與ZD2S群體的FST值稍低于0.05外,其余兩兩群體間,FST值都在0.05—0.15, 為中度分化[24], 且分化均達極顯著水平, 這與孫成飛等[8]的研究結果類似。選擇遺傳分化指數大的群體間進行雜交, 可發(fā)揮雜種優(yōu)勢, 減緩育種群體之間近親繁殖帶來的影響。

3.2 基于線粒體基因的遺傳多樣性及群體遺傳分化

在本研究中, 線粒體COⅠ、12S rRNA及兩個基因的組合序列分析結果一致表明, 羅氏沼蝦SF群體的核苷酸多樣性(π)和ZD2S群體單倍型多樣性最高(Hd), 與微衛(wèi)星位點分析的結果較為一致。4個育種群體COⅠ基因的單倍型多樣性(Hd)為0.080—0.603, 核苷酸多樣(π)為0.00006—0.00512, 12S rRNA基因的Hd為0.500—0.637,π為0.00078—0.00293,兩個基因組合序列的Hd為0.594—0.876,π為0.00044—0.00422, 均高于Thanh等[15]中羅氏沼蝦越南2個野生種群及中國10個養(yǎng)殖群體16S rRNA基因的Hd(0—0.303)和π(0—0.0008), 但類似于其COⅠ基因的Hd(0.129—0.694)和π(0.0003—0.0073)。在本研究中, SF群體是通過收集國內包括羅氏沼蝦“南太湖2號”在內的不同種質資源進行選育3代的群體, 親本來源較為豐富。引進的ZD群體與SF群體雜交后也獲得較高的遺傳多樣性, 這在本研究的微衛(wèi)星和線粒體基因分析結果中得到進一步證明。另一方面, Thanh等[15]的研究采用的16S rRNA及COⅠ基因片段較短(分別僅395和498 bp), 提供的信息量有限。

圖1 羅氏沼蝦COⅠ和12S rRNA基因組合序列單倍型間的聚類分析Fig. 1 Phylogenetic tree for the combined COⅠ and 12S rRNA sequence haplotypes of Macrobrachium rosenbergii

表6 基于COⅠ和12S rRNA基因組合序列的羅氏沼蝦育種群體間遺傳分化指數Tab. 6 Genetic differentiation index (FST) of the breeding populations of Macrobrachium rosenbergii based on the combined COⅠand 12S rRNA sequences

從兩個基因組合序列的單倍型分布來看, 27個單倍型中具有優(yōu)勢單倍型Hap6, 包含46個個體, 出現頻率為30.87%, 分布于除ZDS群體以外的3個群體; 其次占優(yōu)勢的單倍型為Hap2, 包含29個個體, 出現頻率為19.46%, 4個群體中均有出現; 其他各單倍型包含的個體數1—15不等。由此說明, 單倍型在各群體中分布不均, 優(yōu)勢單倍型與其他單倍型包含的個體數量相差極大。從各群體的單倍型多樣性來看, SF群體包含的單倍型數目最多, 共有19個單倍型, ZD2S群體次之, 共11個。通常來說, 優(yōu)勢單倍型的個體適應能力強, 擁有更大的繁殖群體, 而低頻率的單倍型則因環(huán)境適應能力差, 擁有的繁殖群體較小, 更容易對整個種群的遺傳多樣性造成不利影響[25]。另一方面, 優(yōu)勢單倍型體現了前期人工選擇過程中的育種方向, 定向選育過程中保留了成活率高、生長性狀優(yōu)良的個體, 從而使優(yōu)勢單倍型包含的群體數量逐漸擴大。另外, 單倍型的聚類分析結果顯示, SF和ZD2S群體擁有的單倍型, 在兩個分支中均有較多的分布, 也體現出這兩個群體具有豐富的多樣性。

3.3 微衛(wèi)星和線粒體基因的群體遺傳多樣性及遺傳分化比較

本研究基于微衛(wèi)星位點的等位基因數目(Na)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)等遺傳多樣性參數估計結果表明, 在4個育種群體中, SF群體的遺傳多樣性最高, 其次為ZD2S群體。該結果與基于線粒體COⅠ和12S rRNA基因組合序列的單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)及單倍型聚類分析等結果較為一致, 均表明SF和ZD2S群體的遺傳多樣性較為豐富, 具有進一步選育的潛力。

從群體間的遺傳分化來看, 微衛(wèi)星位點分析結果顯示各群體兩兩間均存在極顯著的遺傳分化, 且?guī)缀蹙鶠橹械瘸潭确只? 而兩個線粒體基因組合序列分析則顯示群體間的遺傳分化較小, 除ZD2S群體和ZDS群體的FST值(0.07310)大于0.05屬于中度分化外, 其余均較小或為負值, 幾乎不存在分化。這表明微衛(wèi)星標記用于檢測近緣種群間的遺傳分化時比線粒體基因具有更高的靈敏度。

綜合微衛(wèi)星和線粒體基因分析結果, 在羅氏沼蝦4個育種群體中, SF和ZD2S兩個群體具有較高的遺傳多樣性, 可作為良好的選育材料。但已有的這4個群體間遺傳分化不大, 若能引進遺傳多樣性更為豐富的、與這4個群體具有高度分化的種質資源,將更有利于優(yōu)良品種的選育。