方順金,劉超平, 湖州市第三人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 浙江省湖州市313000

0 引言

急性重癥胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP) 是胰液對(duì)胰腺及其周?chē)M織自身消化而引發(fā)的胰腺炎性損傷性疾病.SAP發(fā)病率快且進(jìn)展速度驚人,病情較為兇險(xiǎn)[1,2],若治療不當(dāng)易引發(fā)臟器衰竭甚至致死,另因其治療時(shí)間長(zhǎng)及治療成本過(guò)高,給多數(shù)患者家庭及社會(huì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[3,4].目前對(duì)SAP的具體發(fā)生機(jī)制尚未完全清晰,幫助臨床醫(yī)師從多方面認(rèn)識(shí)SAP發(fā)生機(jī)制及提高對(duì)SAP的診斷效果也是當(dāng)前學(xué)者研究的重點(diǎn).SAP患者病發(fā)時(shí)體內(nèi)的炎癥因子會(huì)導(dǎo)致腸黏膜屏障受損,嚴(yán)重則引起腸源性感染,導(dǎo)致全身性炎癥及多個(gè)器官功能受損.而在此過(guò)程中,SAP患者的T細(xì)胞與腸黏膜功能障礙也存在相關(guān)性,為T(mén)LR9能夠介導(dǎo)SAP的發(fā)生與進(jìn)展,對(duì)其腸黏膜受損有一定的影響,但目前此類(lèi)研究較少.因此,筆者將52例SAP患者作為研究對(duì)象,旨在探究TLR9及T細(xì)胞亞群與SAP患者腸黏膜功能障礙的相關(guān)性,提高對(duì)于該疾病的相關(guān)診斷和認(rèn)知,為患者及臨床提供更加科學(xué)的客觀(guān)依據(jù),現(xiàn)將研究成果報(bào)告如下.

1 材料和方法

1.1 材料 前瞻性的選取2018-01/2020-01在我院診斷為SAP的52名患者作為研究對(duì)象.其中男性29例,女性23例,年齡25-71歲,平均年齡46.3歲±10.5歲.納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者均符合2015年《重癥急性胰腺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]; (2)發(fā)病至入院24 h之內(nèi); (3)無(wú)惡性腫瘤及傳染性疾病等; (4)無(wú)孕婦及哺乳期婦女; (5)近期未使用影響本文檢測(cè)的藥物; (6)臨床資料齊全; (7)家屬及患者均知情且同意.選擇同期來(lái)我院健康體檢的31例志愿者為健康組,男19例,女12例,年齡29-75歲,平均42.6歲±9.8歲.

1.2 方法

1.2.1 血清TLR9檢測(cè):分別在患者入院第1、2、3、7天使用促凝管抽取3 mL靜脈血,將其放置溫室內(nèi)靜置1-2 h,在4 ℃下3000 r/min離心15 min,而后放置零下80 ℃冷凍保存.采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試法測(cè)定TLR9水平,試劑盒產(chǎn)自武漢貝茵萊公司,操作過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格執(zhí)行.

1.2.2 腸黏膜損傷參數(shù)檢測(cè):(1)外周血細(xì)菌DNA片段:患者入院后抽取外周血,制取血液樣本凍存,取血樣本invitrogen Trizol試劑盒(AMEKO,中國(guó))說(shuō)明書(shū)提取總RNA,以基因高變區(qū)通用引物上qPCR反應(yīng)體系,條件:94 ℃預(yù)變性、94 ℃變性,62 ℃退火,68 ℃延伸,12個(gè)循環(huán); 94 ℃變性,56 ℃退火,68 ℃延伸,28個(gè)循環(huán); (2)內(nèi)毒素檢測(cè):抽取患者外周血1 mL,通過(guò)2000 r/min的離心10 min,取上清液放置無(wú)熱源冷凝管,按1:10的比例加入100 μg肝素?zé)o熱源熱水稀釋,對(duì)顯色底物進(jìn)行鑒定,各孔吸光度405,在90 min內(nèi)每隔30 s進(jìn)行一次測(cè)試,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得出樣本的相應(yīng)內(nèi)毒素濃度值; (3)乳果糖與甘露醇之比(L/M)檢測(cè):使用離子色譜法檢測(cè)L/M值,將25 μL待檢測(cè)液體注入高壓液相離子色譜儀,對(duì)色譜圖形結(jié)果進(jìn)行分析處理,得出L/M參數(shù)值; (4)D-乳酸檢測(cè):使用氫氧化鉀及高錳酸鉀對(duì)患者的血清樣本進(jìn)行中和反應(yīng),對(duì)不含蛋白質(zhì)的血漿使用酶促分光光度測(cè)試; (5)CRP及PCT檢測(cè):抽取患者靜脈血5 mL,常溫下自然凝固兩小時(shí)后,13.5 cm離心半徑,2000 r/min離心十五分鐘,取上層血清,放置在-80 ℃的冰箱保存,另外使用乙二胺四乙酸真空采集患者外周靜脈血2 mL,參照上述過(guò)程備用于檢測(cè)WBC.CRP通過(guò)散射比濁法檢測(cè),選用購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特公司的全自動(dòng)特定蛋白分析儀器及配套試劑(CRM470); PCT通過(guò)免疫熒光法檢測(cè),選用購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司的全自動(dòng)酶聯(lián)熒光分析儀器及配套的試劑(BCR4700); WBC采用計(jì)數(shù)檢測(cè),選用購(gòu)自Sysmex公司的血細(xì)胞分析儀器及配套試劑(產(chǎn)品編號(hào):DWX-50107,DWX-50111,DWX-50112,DWX-50114).

1.2.3 T細(xì)胞亞群檢測(cè):采用流式細(xì)胞術(shù)在患者入院第1、2、3、7天測(cè)定其體內(nèi)T細(xì)胞亞群,分析CD3+、CD4+、CD8+水平的變化.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理,計(jì)量資料通過(guò)mean±SD表示,進(jìn)行t檢驗(yàn); 采用Pearson相關(guān)性分析TLR9水平及T細(xì)胞亞群分別與SAP患者腸黏膜損傷的關(guān)系,以P＜0.05存在差異且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 SAP外周血細(xì)菌DNA分析 52例SAP患者中細(xì)菌DNA陽(yáng)性43例,陽(yáng)性率82.69% (43/52),其中34例可見(jiàn)1-2條DNA條帶,9例可見(jiàn)2-4條DNA條帶,共87條DNA條帶,17種細(xì)菌,大腸桿菌(28條,38.89%)、凝結(jié)芽孢桿菌(24條,33.33%)、惡臭假單胞菌(10條,13.89%)、銅綠假單胞菌(7條,9.72%)、肺炎克雷伯菌(3條,4.17%)、肺炎鏈球菌(3條,4.17%)、金黃色葡萄球菌(2條,2.78%)及其他.

2.2 患者不同時(shí)點(diǎn)炎癥指標(biāo)比較 測(cè)量SAP患者WBC、CRP、PCT結(jié)果顯示,WBC、CRP有隨時(shí)間增加而下降的趨勢(shì),且在第3-7天較為明顯,PCT在1-3天上升,在第7天下降,組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),詳見(jiàn)表1.

2.3 兩組患者不同時(shí)點(diǎn)血清LIR9水平比較 血清TLR9檢測(cè)結(jié)果顯示,SAP組在第1、2、3、7天的指標(biāo)均高于健康組,且兩組在第2-3天指標(biāo)明顯上升,3-7 d間指標(biāo)下降,兩組指標(biāo)總體降低,組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).詳見(jiàn)表2.

2.4 SAP患者不同時(shí)點(diǎn)腸黏膜損傷參數(shù)比較 測(cè)量SAP患者腸黏膜受損各指標(biāo)結(jié)果顯示,內(nèi)毒素、L/M值與D-乳酸指標(biāo)均在第2天上升,在第3、4天有所下降,第2天時(shí)均較第1天測(cè)量時(shí)低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).詳見(jiàn)表3.

2.5 SAP患者T細(xì)胞亞群不同時(shí)點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果比較 測(cè)量SAP患者CD3+、CD4+、CD8+百分比結(jié)果顯示,CD3+、CD4+隨著時(shí)間的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì),CD8+在第2-3天有所下降,在第3-4天有所上升,組間差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).詳見(jiàn)表4.

2.6 SAP患者腸黏膜損傷與LIR9相關(guān)性分析 Person相關(guān)性結(jié)果顯示,TLR9水平與患者內(nèi)毒素、L/M值及D-乳酸水平均呈現(xiàn)顯著正相關(guān),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義(P＜0.05).詳見(jiàn)表5.

2.7 SAP患者腸黏膜損傷與T細(xì)胞亞群相關(guān)性分析 采用Person相關(guān)性結(jié)果表明,腸黏膜損傷(內(nèi)毒素、L/M值、D-乳酸)與T細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+百分比)相關(guān)性顯著,組間差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).詳見(jiàn)表6.

3 討論

SAP容易引發(fā)身體多器官損傷,是消化系統(tǒng)中較為嚴(yán)重的疾病,其表現(xiàn)為病情較嚴(yán)重、發(fā)病較急、進(jìn)程較快、并發(fā)癥較多且病死率高[6-8].要提高臨床治療效果,在于盡早診斷并及時(shí)對(duì)癥處理,因此,尋找合適的評(píng)估指標(biāo)對(duì)于早期預(yù)測(cè)SAP患者的病情具有重要的臨床價(jià)值[9].SAP患者在早期就會(huì)出現(xiàn)腸黏膜屏障受損的癥狀,通過(guò)腸黏膜屏障受損程度可平局SAP病情.目前可用于評(píng)價(jià)其屏障功能的參數(shù)指標(biāo)包括內(nèi)毒素、L/M值及D-乳酸等,當(dāng)患者腸黏膜損傷之后,腸道內(nèi)細(xì)菌會(huì)使其指標(biāo)水平升高,故可以作為反映其損失程度的參考指標(biāo)[10].T細(xì)胞作為腸道的免疫細(xì)胞,已有多個(gè)研究表明[11,12],T細(xì)胞對(duì)于維護(hù)腸黏膜內(nèi)穩(wěn)定有著重要作用,且T細(xì)胞指標(biāo)水平對(duì)于SAP患者的恢復(fù)有所幫助.

本研究結(jié)果顯示,TLR9與腸黏膜損傷多個(gè)指標(biāo)呈現(xiàn)正相關(guān)性,提示血清TLR9可能作為腸道屏障損害和感染的重要指標(biāo),故今后臨床中可以將此指標(biāo)作為判斷其病情的依據(jù).嚴(yán)蘋(píng)等[13]在對(duì)急性胰腺炎患者血清中的TLR9等水平變化及意義的研究中表示,SAP患者在入院48 h時(shí)TLR9水平達(dá)到峰值,在72 h下降,其認(rèn)為T(mén)LR9是一種促炎性細(xì)胞介質(zhì),與SAP的腸黏膜屏障受損有關(guān),提示血清TLR9的表達(dá)水平與SAP嚴(yán)重程度相關(guān); 另其研究表明TLR9水平與腸黏膜受損指標(biāo)中的D-乳酸呈正相關(guān),表示其可以作為SAP患者腸黏膜損傷的參考指標(biāo),與本文研究結(jié)果一致.腸黏膜受損是SAP的重要因素,因此減輕其損傷程度對(duì)于臨床治療次此疾病十分重要.

本研究中,CD3+、CD4+、CD8+指標(biāo)與腸黏膜損傷的指標(biāo)都顯著相關(guān),這可能是因?yàn)門(mén)細(xì)胞激活中需要CD4+分子直接參與,而CD8+分子與SAP患者疾病的病情程度、病情及預(yù)后都有著密切的關(guān)系,當(dāng)其細(xì)胞百分比增大時(shí),反應(yīng)機(jī)體免疫功能上升,本研究結(jié)果說(shuō)明SAP患者存在細(xì)胞免疫功能障礙,容易增加患者全身感染的機(jī)會(huì).通過(guò)觀(guān)察T細(xì)胞中的這幾項(xiàng)免疫指標(biāo)能夠很好地觀(guān)察其損傷程度,在今后對(duì)于SAP患者的腸黏膜屏障受損時(shí),調(diào)節(jié)T細(xì)胞能夠一定程度上抑制免疫系統(tǒng)的活性,對(duì)于早期治療SAP患者的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用,對(duì)患者全身的抗炎有很好的效果,進(jìn)一步還能夠減少細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn).徐娟等[14]在對(duì)SAP患者的治療效果及對(duì)免疫功能研究中表明,細(xì)胞免疫主要是依靠T淋巴細(xì)胞發(fā)揮其免疫功能,而CD3+、CD4+、CD8+指標(biāo)能夠很好反應(yīng)SAP患者的免疫功能,通過(guò)營(yíng)養(yǎng)治療SAP能夠增強(qiáng)患者機(jī)體免疫能力.杜姍等[15]研究腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)治療SAP患者的治療結(jié)果中顯示,營(yíng)養(yǎng)支持是目前治療SAP患者最重要的方式,對(duì)患者攝入充足的營(yíng)養(yǎng),可以避免其體內(nèi)環(huán)境的惡化,最大程度上滿(mǎn)足患者的機(jī)體需求,其研究成果與本文一致.

4 結(jié)論

綜上所述,SAP患者通過(guò)檢測(cè)血清TLR9水平能反映其病況,與腸黏膜屏障受損程度存在正相關(guān),T細(xì)胞亞群是反映SAP患者的免疫功能指標(biāo),與腸黏膜屏障受損程度顯著相關(guān),在日后臨床治療時(shí),可以通過(guò)觀(guān)察一系列指標(biāo)更好了解患者病情,為其預(yù)后良好提供科學(xué)參考.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

既往研究在動(dòng)物模型、臨床資料中均發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)的改變與急性重癥胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)病情密切相關(guān),且認(rèn)為免疫功能與腸道屏障功能障礙之間存在一定的關(guān)聯(lián)性,而TLR9激活固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,與自身免疫性疾病相關(guān),則TLR9可能與SAP腸道屏障功能障礙存在相關(guān).

表1 患者不同時(shí)點(diǎn)炎癥指標(biāo)比較結(jié)果(n=52)

表2 兩組患者不同時(shí)點(diǎn)血清TLR9水平結(jié)果

表3 急性重癥胰腺炎患者不同時(shí)點(diǎn)腸黏膜損傷參數(shù)結(jié)果(n=52)

表4 患者T細(xì)胞亞群不同時(shí)點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果(n=52)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

目前已有研究對(duì)Thl/Th2比、免疫球蛋白等水平與SAP患者腸黏膜屏障功能之間的關(guān)系加以研究,本研究則從TLR9水平出發(fā),以期為全面理解SAP發(fā)生、進(jìn)展的發(fā)生機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探究TLR9及免疫功能指標(biāo)對(duì)SAP患者腸黏膜屏障功能障礙的影響.

實(shí)驗(yàn)方法

前瞻性的選取符合入選標(biāo)準(zhǔn)SAP患者,動(dòng)態(tài)分析患者入院不同時(shí)點(diǎn)的腸黏膜屏障功能參數(shù)及免疫功能指標(biāo)、TLR9水平,并采用Pearson分析TLR9水平及免疫功能指標(biāo)與腸黏膜屏障功能參數(shù)之間的關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

TLR9及免疫功能指標(biāo)與SAP患者腸黏膜屏障受損程度顯著相關(guān),且腸黏膜屏障障礙可能是多種細(xì)胞因子共同作用下所導(dǎo)致的.

表5 急性重癥胰腺炎患者腸黏膜損傷參數(shù)與LIR9相關(guān)性結(jié)果(n=52)

表6 急性重癥胰腺炎患者腸黏膜損傷與T細(xì)胞亞群相關(guān)性結(jié)果(n=52)

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

結(jié)合前人經(jīng)驗(yàn),SAP患者腸黏膜屏障受損是在多種T細(xì)胞亞群下共同下所導(dǎo)致的結(jié)果,SAP患者免疫失衡可能與TLR9表達(dá)異常而影響抗自身DNA抗體、病理性免疫球蛋白及促炎性因子的產(chǎn)生,這提示,臨床對(duì)于TLR9表達(dá)異常的患者,可能通過(guò)干擾其信號(hào)通路使患者獲益,但這需要通過(guò)后續(xù)工作者嚴(yán)謹(jǐn)、可靠的動(dòng)物模型及臨床研究.

展望前景

SAP患者病情變化快是臨床治療的難點(diǎn),從多方面探討其發(fā)病機(jī)制有利于臨床醫(yī)師更快的把握病情并及早做好預(yù)防措施,除腸黏膜屏障外,腹腔高壓、全身炎癥等都是臨床研究的重點(diǎn),則TLR9是否參與了這些過(guò)程,是今后的研究方向之一.