王宏璐，黃文靜，黃志偉，原尚奇，解詩(shī)雨，吳楠

二維相關(guān)中紅外光譜判別牛奶中的四環(huán)素

王宏璐，黃文靜，黃志偉，原尚奇，解詩(shī)雨，吳楠通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384）

基于二維相關(guān)中紅外光譜法，建立一種快速判別牛奶中四環(huán)素的分析方法。分別配置20個(gè)純牛奶和20個(gè)摻雜四環(huán)素牛奶樣品（濃度區(qū)間為0.005～30 mg/L）。室溫下，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)采集牛奶樣品的常規(guī)一維譜數(shù)據(jù)。以牛奶中摻雜四環(huán)素濃度為外擾，分別在1 500～1 700 cm-1和3 250～3 450 cm-1波段區(qū)間內(nèi)構(gòu)建同步和異步二維相關(guān)譜，研究其相關(guān)譜特性。通過對(duì)同步譜中交叉峰的正負(fù)以及異步譜中相同位置是否存在交叉峰，推斷1 550 cm-1和1 640 cm-1處所對(duì)應(yīng)的基團(tuán)吸收峰來自于牛奶中的四環(huán)素，是由C＝＝N鍵和C＝＝O鍵的伸縮振動(dòng)引起的。同時(shí)，在3 310 cm-1處的波峰也來自于四環(huán)素，是由N－－H拉伸及彎曲振動(dòng)引起的。結(jié)果表明，對(duì)二維相關(guān)中紅外光譜特性的研究，可以定性判別牛奶中是否摻雜四環(huán)素。

牛奶；四環(huán)素；中紅外光譜；二維相關(guān)

近些年，人們對(duì)牛奶的需求日益增加，牛奶的質(zhì)量是消費(fèi)者挑選牛奶的首要因素。牛奶中摻雜的有害物質(zhì)會(huì)影響人類健康，降低牛奶品質(zhì)，所以，建立牛奶摻雜物質(zhì)準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法是必需的。紅外光譜分析法因具有方便快捷和在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)廣泛運(yùn)用在各種摻雜物質(zhì)的判別上[1]。例如，中紅外光譜法（Mid infrared，MIR）可以在不破壞樣品的情況下對(duì)牛奶中的微量物質(zhì)進(jìn)行有效提取分析[2]。但由于待檢測(cè)物成分復(fù)雜，外界條件等因素的影響，常規(guī)的一維光譜技術(shù)對(duì)摻雜物的解析及定性定量分析都存在一定的困 難[3]。二維相關(guān)光譜技術(shù)因具有更高的分辨率和圖譜解析能力，可以區(qū)分一些不明顯的、被覆蓋的波峰，通過交叉峰的正負(fù)對(duì)比和基團(tuán)吸收峰強(qiáng)度變化來判斷某純物質(zhì)中是否摻雜其他物質(zhì)。例如，當(dāng)濃度等因素影響樣品體系時(shí)，樣品的各種化學(xué)成分會(huì)“選擇性”的變化，從而得到特定的二維相關(guān)譜圖[4]。由于二維相關(guān)光譜法的良好解析能力，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于牛奶及其他物質(zhì)中各種摻雜物的判別分析[5-10]。隨著市場(chǎng)需求的不斷增長(zhǎng)，養(yǎng)殖戶使用的獸藥數(shù)量持續(xù)攀升，四環(huán)素是四環(huán)素類抗生素中最基本的化合物，也是牛奶中常見的抗生素之一[11-12]。四環(huán)素具有很好的抗菌作用，主要用于治療衣原體感染的疾病，其毒性不大，但副作用多見，如惡心、嘔吐，食欲減退，二重感染，影響骨骼和牙齒生長(zhǎng)等[12]。本文研究牛奶中四環(huán)素的二維相關(guān)中紅外（MIR－MIR）光譜特性，探討利用二維相關(guān)光譜鑒別純牛奶和摻雜四環(huán)素牛奶的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

本試驗(yàn)采用在超市購(gòu)買的某品牌同一批次的純牛奶。四環(huán)素標(biāo)品粉末購(gòu)自Solarbio（純度＞99%）。四環(huán)素母液由超純水制備（100 mg/L），并在4 ℃下儲(chǔ)存。用超純水稀釋母液制備不同濃度的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。在10 mL牛奶樣品中加入10 μL的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，所造成的牛奶樣品的體積變化忽略不計(jì)。共配制10個(gè)不同濃度梯度的四環(huán)素?fù)诫s牛奶，濃度分別為0.005、0.02、0.06、0.1、0.4、0.8、2、6、10和30 mg/L。每個(gè)濃度梯度設(shè)2個(gè)重復(fù)，共獲得20份四環(huán)素?fù)诫s牛奶樣品。同時(shí)，準(zhǔn)備了20份純牛奶樣品。用中紅外儀采集了40個(gè)樣品的光譜數(shù)據(jù)。

1.2 光譜采集

采用美國(guó)PerkinElmer公司的傅里葉變換中紅外光譜儀，在室溫下對(duì)牛奶樣品進(jìn)行光譜采集。樣品池為儀器自配的衰減全反射附件。中紅外光譜的掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為 4 cm-1，掃描間隔為8 cm-1，掃描次數(shù)為 8次，每個(gè)濃度樣品測(cè)量2次。

1.3 分析方法

利用unscrambler分析程序，對(duì)輸入的摻雜牛奶光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元散射校正，采用Savitzky－ Golary方法對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑預(yù)處理，減少對(duì)判別模型的干擾。利用2D－shige軟件構(gòu)建二維相關(guān)譜。以平均譜作為參考，得到二維紅外相關(guān)圖。在同步譜等高線圖中，若有來源相同的兩個(gè)物質(zhì)，則在譜圖中交叉峰體現(xiàn)為正相關(guān)，若兩物質(zhì)來源不相同，交叉峰顯示為負(fù)相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 純牛奶和摻雜四環(huán)素牛奶的中紅外光譜圖

圖1是20個(gè)純牛奶和20個(gè)摻雜不同濃度四環(huán)素牛奶樣品在全波段的中紅外光譜圖。由圖1可以發(fā)現(xiàn)，純牛奶和摻雜四環(huán)素牛奶樣品的中紅外光譜圖有較好的重合度，峰值都大致出現(xiàn)在 1 068、1 540、1 640、1 740、2 916 cm-1和3 450 cm-1左右。這表明簡(jiǎn)單地通過一維譜形狀和譜峰位置很難判別牛奶中是否摻雜四環(huán)素。

圖1 純牛奶（a）和摻雜四環(huán)素牛奶（b）樣品的中紅外光譜圖

2.2 二維相關(guān)譜1 500～1 700 cm-1波段區(qū)間

以牛奶中摻雜的四環(huán)素濃度為外擾，隨著濃度的增大，在1 500～1 700 cm-1波段內(nèi)有明顯的光譜信息變化，因此選取這一波段來研究摻雜四環(huán)素牛奶的二維相關(guān)光譜特性。在此區(qū)間構(gòu)建同步二維相關(guān)中紅外譜和其對(duì)應(yīng)的自相關(guān)譜（圖2）。同時(shí)構(gòu)建摻雜四環(huán)素牛奶的異步二維相關(guān)譜（圖3）。同步二維相關(guān)譜是關(guān)于對(duì)角線對(duì)稱的，在對(duì)角線上出現(xiàn)的交叉峰為自相關(guān)峰且總是正的，表明牛奶中四環(huán)素濃度變化引起的光譜強(qiáng)度變化的程度。之前文獻(xiàn)報(bào)道過在1 200～1 700 cm-1，摻雜牛奶與純牛奶間可能存在細(xì)微差別，其中包含有摻雜物的光譜信息；而在900～1 200 cm-1，其光譜信息主要由純牛奶的固有組分所引起[7]。圖2顯示，在1 550 cm-1處出現(xiàn)自相關(guān)峰，這主要是由四環(huán)素中C＝＝N鍵的伸縮振動(dòng)引起的[4]。而在1 640 cm-1處出現(xiàn)的自相關(guān)峰是由于四環(huán)素中的C＝＝O伸縮振動(dòng)引起的[13]。

在圖2a中，可以觀察到在對(duì)角線外有3個(gè)較強(qiáng)的交叉峰出現(xiàn)，分別在（1 550，1 640），（1 640，1 590）和（1 550，1 590）cm-1處。進(jìn)一步判斷交叉峰的正負(fù)可知，在（1 550，1 640）cm-1處交叉峰為正值，表明1 550和1 640 cm-1處的2個(gè)波峰所對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)都來自于同一物質(zhì)。而在異步譜 1 550和1 640 cm-1處并未出現(xiàn)交叉峰（圖3），進(jìn)一步說明1 550和1 640 cm-1處的波峰來自于同一物質(zhì)，即牛奶中的四環(huán)素。此外，圖2a顯示，在（1 640，1 590）和（1 550，1 590）cm-1處的交叉峰為正值，異步譜（圖3）進(jìn)一步顯示，在（1 640，1 590）和（1 550，1 590）cm-1處均出現(xiàn)了交叉峰，表明所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)的變化速率不同。說明1 640和1 590 cm-1處，以及1 590和1 550 cm-1處的波峰分別來自于不同的物質(zhì)。綜上，1 550和1 640 cm-1處所對(duì)應(yīng)的基團(tuán)吸收峰來自牛奶中的四環(huán)素，而 1 590 cm-1處所對(duì)應(yīng)的吸收峰可能來自純牛奶中的物質(zhì)。

圖2 1 500～1 700 cm-1波段下?lián)诫s四環(huán)素牛奶的二維相關(guān)中紅外（a）同步譜與（b）自相關(guān)譜

圖3 1 500～1 700 cm-1波段下?lián)诫s四環(huán)素牛奶的異步二維相關(guān)中紅外譜

2.3 二維相關(guān)譜3 250～3 450 cm-1波段區(qū)間

以牛奶中摻雜的四環(huán)素濃度為外擾，在3 250～3 450 cm-1區(qū)間構(gòu)建同步二維相關(guān)中紅外同步譜和其對(duì)應(yīng)的自相關(guān)譜（圖4）。從圖4可以看出，在3 310 cm-1處出現(xiàn)自相關(guān)峰，這個(gè)自相關(guān)峰主要來自于四環(huán)素中N－－H拉伸振動(dòng)及其彎曲振動(dòng)[13]。Qin等[14]在利用中紅外光譜研究四環(huán)素類抗生素粉末樣品過程中，也發(fā)現(xiàn)四環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素、金霉素等均在3 310 cm-1附近有特征峰，這可能是由于四環(huán)素類物質(zhì)具有相同的分子結(jié)構(gòu)。根據(jù)上述對(duì)摻雜四環(huán)素牛奶的二維相關(guān)中紅外光譜特性的研究，可以定性判定牛奶中是否摻雜四 環(huán)素。

圖4 3 250～3 450 cm-1波段下?lián)诫s四環(huán)素牛奶的二維相關(guān)中紅外同步譜與（a）自相關(guān)譜（b）

3 結(jié)論

本研究利用二維相關(guān)中紅外光譜法對(duì)純牛奶中摻雜的四環(huán)素（所摻四環(huán)素濃度為0.005～ 30 mg/L）進(jìn)行判別分析。研究發(fā)現(xiàn)，在1 500～ 1 700 cm-1波段中，1 550和1 640 cm-1處所對(duì)應(yīng)的基團(tuán)吸收峰來自于牛奶中的四環(huán)素中C＝＝N鍵和C＝＝O鍵的伸縮振動(dòng)。在3 250～3 450 cm-1波段，3 310 cm-1處的自相關(guān)峰來自于N－－H拉伸振動(dòng)及其彎曲振動(dòng)。這一結(jié)果表明，二維相關(guān)光譜法彌補(bǔ)了一維譜技術(shù)的不足，能將更弱的變化信息體現(xiàn)出來。對(duì)二維相關(guān)光譜圖的分析，可以有效區(qū)分純牛奶和摻雜四環(huán)素牛奶。未來，也可將二維相關(guān)光譜法的結(jié)果與化學(xué)計(jì)量法結(jié)合，進(jìn)一步對(duì)牛奶中的四環(huán)素進(jìn)行定量分析。

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Identification of tetracycline in milk by two-dimensional correlation mid infrared spectroscopy

WANG Hong-lu, HUANG Wen-jing, HUANG Zhi-wei, YUAN Shang-qi, XIE Shi-yu, WU NanCorresponding Author

（College of Engineering and Technology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

Based on the two-dimensional correlation mid infrared spectroscopy, a rapid method for the identification of tetracycline in milk was established. 20 pure milk samples and 20 tetracycline adulterated milk samples（0.005～30 mg/L）were prepared respectively. At room temperature, the conventional one-dimensional spectral data of milk samples were collected in the range of 400～4 000 cm-1. Taking the concentration of tetracycline in milk as the external perturbation, synchronous and asynchronous two-dimensional correlation spectra were constructed in the range of 1 500～1 700 cm-1and 3 250～3 450 cm-1, respectively. The absorption peaks at 1 550 cm-1and 1 640 cm-1were supposed to come from the tetracycline in milk, which were caused by the stretching vibration of C＝＝N and C＝＝O bonds. At 3 310 cm-1, the peak also came from tetracycline, which was caused by the stretching and bending vibration of N－－H bond. The results showed that the analysis of two-dimensional correlation mid infrared spectral characteristics can qualitatively determine whether the milk is adulterated with tetracycline.

milk; tetracycline; mid infrared spectroscopy; two-dimensional correlation

1008-5394（2020）03-0079-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.018

O657.33

A

2019-12-10

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201910061090）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21607114，41771357）

王宏璐（2000-），女，本科在讀，主要從事環(huán)境與新能源方面的研究。E-mail：809048865@qq.com。

吳楠（1984-），女，副教授，博士，主要從事環(huán)境污染物方面的研究。E-mail：nwu@tjau.edu.cn。

責(zé)任編輯：楊霞