馬濤 梁佳春 師軍華

1天津市第五中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腎內(nèi)科300450；2天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院急診科300451

0 引言

目前，內(nèi)毒素休克已成為重癥監(jiān)護患者死亡的首要原因，其引發(fā)的多器官衰竭也成為患者死亡的主要原因[1-2]。醫(yī)學(xué)界對內(nèi)毒素休克引發(fā)的多器官衰竭機制已有多種觀點，如炎癥的級聯(lián)放大反應(yīng)、氧自由基毒性以及血管內(nèi)活性物質(zhì)的作用等[3]。腎臟損傷是內(nèi)毒素休克引發(fā)的器官衰竭損傷之一，嚴(yán)重威脅著患者的生命安全[4]。烏司他丁已廣泛用于多種危重疾病的治療，其在內(nèi)毒素休克引發(fā)的腎臟損傷治療進(jìn)程中也表現(xiàn)出良好的治療效果[5]。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stromal cells,ADSCs）作為一種源于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，近年來頗受醫(yī)學(xué)研究者的青睞[6]。ADSCs在修復(fù)心肌、肝臟等方面療效顯著，在治療多種器官缺血再灌注損傷方面亦具有較好的效果[7-8]。此外，ADSCs移植對多種腎臟損傷亦具有良好的緩解和治療作用[9]。本研究擬通過烏司他丁改善機體內(nèi)環(huán)境，ADSCs移植為組織功能修復(fù)提供“種子”細(xì)胞，探討烏司他丁與ADSCs移植聯(lián)合治療對內(nèi)毒素休克所致腎臟損傷的保護作用，以期為該病的治療提供借鑒和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

胰蛋白酶、脂多糖（美國Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（美國HyClone公司），TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司），兔抗人Bax、Caspase-3多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。健康清潔級8周齡Sprague-Dawley大鼠108只，雌雄各半，體質(zhì)量范圍200～250 g，購于天津醫(yī)科大學(xué)動物實驗室，許可證號SYXK（津）2014-0002。所有Sprague-Dawley大鼠于無特定病原體級環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，室溫（25．0±3．0）℃，相對濕度 60%～70%，自由進(jìn)食飲水。本研究所有的動物實驗均獲得天津市動物實驗倫理委員會的批準(zhǔn)。

HERAcell 150i二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），UVI凝膠成像系統(tǒng)（英國UVItec公司），Thermo Arktik-96孔PCR儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]，Olympus IX71顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的體外復(fù)蘇培養(yǎng)及CM-Dil標(biāo)記

將凍存的ADSCs置于37℃恒溫水浴箱中30 s快速復(fù)蘇；待細(xì)胞懸液完全融化后，對ADSCs進(jìn)行洗滌離心，重復(fù)此操作3次；用DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml，接種于培養(yǎng)瓶中置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；待細(xì)胞處于對數(shù)生長期后，收集細(xì)胞，向細(xì)胞懸液中加入5 μl CM-Dil，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育25 min，采用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及CM-Dil標(biāo)記情況。

1.2.2 內(nèi)毒素休克模型的建立及分組

從108只健康Sprague-Dawley大鼠中隨機選取20只作為正常組，尾靜脈注射2 ml氯化鈉注射液；剩余88只尾靜脈注射2 ml脂多糖（10 mg/kg），建立內(nèi)毒素休克模型。最終88只大鼠死亡8只，建模成功80只。將這80只模型大鼠隨機均分為4個處理組，每組20只。其中模型組大鼠尾靜脈注射20 μl氯化鈉注射液；ADSCs組大鼠尾靜脈注射20 μl濃度為2×107個/L的CM-Dil標(biāo)記的ADSCs懸液；烏司他丁組大鼠腹腔注射烏司他丁（1×105U/kg）；聯(lián)合組大鼠腹腔注射烏司他?。?×105U/kg），并尾靜脈注射 20 μl CM-Dil標(biāo)記的 ADSCs懸液（2×107個/L）。正常組亦尾靜脈注射20 μl氯化鈉注射液。每天治療1次，連續(xù)治療3 d。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色觀察大鼠腎臟組織的病理變化

干預(yù)治療3 d后，各組隨機選取4只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死大鼠，取其左側(cè)腎臟組織；用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定腎臟組織，梯度乙醇脫水后進(jìn)行石蠟包埋、切片（厚度為 5～8 μm）；切片脫蠟后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，于顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織的病理變化。

1.2.4 血清中生化指標(biāo)測定

干預(yù)治療3 d后，各組隨機選取4只大鼠，取尾靜脈血。離心提取血清，采用一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）試劑盒分別測定大鼠血清中的NO和NOS含量。

干預(yù)治療3 d后，各組隨機選取5只大鼠，采集內(nèi)眥靜脈血，離心收集血清，采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中的肌酐和尿素氮含量。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄PCR測定Bax和Caspase-3基因的mRNA表達(dá)

干預(yù)治療3 d后，各組隨機選取5只大鼠，取雙側(cè)腎臟組織于液氮中保存?zhèn)溆?。取?0 mg腎臟組織于冰上充分研磨后迅速加入TRIzol試劑裂解細(xì)胞抽提總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成相應(yīng)的cDNA并進(jìn)行擴增。Bax正向引物為5'-ACACCTGAGCTGACCTTGGA-3'，反向引物為5'-CCGTGTCCACGTCAGCAATC-3'，引物長度為 133 bp；Caspase-3正向引物為5'-AGAGCTGGACTGCGGTATTGAG-3'，反向引物為 5'-GAACCATGACCCGTCCCTTG-3'，引物長度為148 bp；β-肌動蛋白正向引物為 5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，反向引物為 5'-GGAAGGTGGACAGTGAGGC-3'，引物長度為 444 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。將擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus 7.0軟件分析條帶灰度值。以β-肌動蛋白基因為內(nèi)參，計算Bax、Caspase-3的mRNA相對表達(dá)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法測定Bax和Caspase-3基因的蛋白表達(dá)

提取各組雙側(cè)腎臟組織的總蛋白并測定蛋白濃度，每組取蛋白40 μg，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（70V、30 min，100 V、90 min）；將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上（200 mA、3 h）；加入質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶，室溫封閉2 h；分別加入兔抗人Bax、Caspase-3多克隆抗體（稀釋比例為 1∶500），室溫孵育 2 h，四聚丙烯（烷基）苯磺酸鹽洗滌3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體，室溫孵育0.5 h，四聚丙烯（烷基）苯磺酸鹽洗滌3次，磷酸鹽緩沖液洗滌1次；按ECL說明書，將液體A和液體B等體積混合，滴加于膜正面，反應(yīng)1 min；立即置于暗室中曝光、顯影、定影，室溫晾干后掃描拍照，分析各蛋白條帶灰度值，計算Bax、Caspase-3的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs存活及其CM-Dil標(biāo)記情況

顯微鏡下可見復(fù)蘇培養(yǎng)24 h后，ADSCs開始貼壁并呈現(xiàn)纖維細(xì)胞樣；48 h后細(xì)胞充分伸展為梭形，并逐漸聚集；6 d后開始形成細(xì)胞集落（圖1A）。CM-Dil標(biāo)記后熒光顯微鏡下可見紅色熒光陽性細(xì)胞（圖1B），表明CM-Dil標(biāo)記成功。

2.2 蘇木精-伊紅染色

由圖2可知，干預(yù)治療3 d后，模型組大鼠腎小球擴張充血，間質(zhì)中炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞明顯腫脹與空泡變性，胞質(zhì)深染，偶見壞死病灶；與模型組相比，ADSCs組和烏司他丁組大鼠腎臟損傷明顯減輕，聯(lián)合組大鼠腎臟損傷最輕。

2.3 CM-Dil標(biāo)記ADSCs在大鼠腎臟組織中的分布情況

圖1 顯微鏡觀察脂肪干細(xì)胞形態(tài)及CM-Dil標(biāo)記情況（×100）

如圖3所示，干預(yù)治療3 d后，正常組、模型組和烏司他丁組大鼠腎臟組織中均未見CM-Dil標(biāo)記的ADSCs，而ADSCs組和聯(lián)合組大鼠腎臟組織中可見CM-Dil標(biāo)記的ADSCs，且聯(lián)合組CM-Dil標(biāo)記的ADSCs數(shù)量明顯多于ADSCs組。

2.4 大鼠血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量

由表1可知，干預(yù)治療3 d后，與正常組相比，模型組大鼠血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量均明顯升高（均P＜0.05）；與模型組相比，ADSCs組、烏司他丁組和聯(lián)合組大鼠血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量均明顯降低（均P＜0.05），且聯(lián)合組較ADSCs組和烏司他丁組進(jìn)一步降低（均P＜0.05）。

2.5 Bax和Caspase-3的mRNA表達(dá)

由圖4可知，干預(yù)治療3 d后，與正常組相比，模型組大鼠腎臟組織中Bax和Caspase-3的mRNA相對表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05）；與模型組相比，ADSCs組、烏司他丁組和聯(lián)合組Bax和Caspase-3的mRNA相對表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05），且聯(lián)合組較ADSCs組和烏司他丁組進(jìn)一步降低（均P＜0.05）。

2.6 Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)

由圖5可知，干預(yù)治療3 d后，與正常組相比，模型組大鼠腎臟組織中Bax和Caspase-3的蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05）；與模型組相比，ADSCs組、烏司他丁組和聯(lián)合組Bax和Caspase-3的蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05），且聯(lián)合組較ADSCs組和烏司他丁組進(jìn)一步降低（均P＜0.05）。

圖2 蘇木精-伊紅染色觀察干預(yù)治療3 d后各組大鼠腎臟組織的病理變化（×40）

圖3 熒光顯微鏡觀察干預(yù)治療3 d后各組大鼠腎臟組織中CM-Dil標(biāo)記ADSCs的分布情況（×100）

表1 干預(yù)治療3 d后各組大鼠血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量（Mean±SD）

圖4 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測干預(yù)治療3 d后各組大鼠腎臟組織中Bax和Caspase-3的mRNA表達(dá)

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測干預(yù)治療3 d后各組大鼠腎臟組織中Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)

3 討論與結(jié)論

內(nèi)毒素休克引發(fā)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及毒性反應(yīng)等可引起機體多器官衰竭，其中對腎臟損傷尤為嚴(yán)重[4]。腎臟損傷導(dǎo)致腎小管結(jié)構(gòu)及腎臟過濾功能異常，從而引起血液中肌酐、尿素氮等代謝產(chǎn)物含量激增[10]。ADSCs移植可顯著緩解腎臟損傷，并改善腎臟的結(jié)構(gòu)和功能[11]。干細(xì)胞可旁分泌或內(nèi)分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)節(jié)免疫、抗凋亡和抗炎癥等作用[12-13]。然而目前關(guān)于ADSCs移植對擠壓傷所致腎臟損傷的療效研究并不多。烏司他丁可緩解腎臟病理性損傷，抑制炎癥反應(yīng)，緩解腎臟細(xì)胞凋亡，從而保護腎臟組織免受損傷[14]。

本研究中模型組大鼠的腎間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，胞質(zhì)深染，偶見壞死病灶，表明內(nèi)毒素休克模型建立成功。治療后與模型組相比，ADSCs組和烏司他丁組大鼠腎臟組織的病理損傷均明顯減輕，而聯(lián)合組腎臟損傷進(jìn)一步減輕。由此可知，ADSCs移植和烏司他丁干預(yù)均可顯著緩解內(nèi)毒素休克所致的腎臟損傷。血清NOS和NO含量升高是機體發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)，而血清肌酐和尿素氮含量升高是腎臟病理變化的臨床標(biāo)志。本研究中與正常組相比，模型組大鼠血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量均明顯升高；與模型組相比，ADSCs組、烏司他丁組和聯(lián)合組血清中的NOS、NO、肌酐和尿素氮含量均明顯降低，且聯(lián)合組較ADSCs組和烏司他丁組進(jìn)一步降低。該結(jié)果表明，ADSCs移植和烏司他丁注射可通過緩解炎癥反應(yīng)來減輕腎臟損傷，兩者聯(lián)合可顯著改善腎臟功能。此外，ADSCs組和聯(lián)合組大鼠腎臟組織鏡下均可見CM-Dil標(biāo)記的陽性細(xì)胞，且聯(lián)合組陽性細(xì)胞數(shù)多于ADSCs組；而正常組、模型組和烏司他丁組腎臟組織中均未見CM-Dil標(biāo)記的ADSCs，表明烏司他丁可促進(jìn)ADSCs在機體內(nèi)的存活和分布。

在調(diào)控細(xì)胞代謝中，Bax蛋白可激活線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔的開放，引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂；而Caspase-3可激活蛋白外流，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠腎臟組織中Bax及Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高；與模型組相比，ADSCs組、烏司他丁組和聯(lián)合組Bax及Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低，且聯(lián)合組較ADSCs組和烏司他丁組進(jìn)一步降低。上述結(jié)果表明，烏司他丁聯(lián)合ADSCs移植對大鼠內(nèi)毒素休克所致腎臟損傷具有明顯的保護作用，其可能與緩解腎臟細(xì)胞損傷有關(guān)，這為兩者聯(lián)合用于臨床治療內(nèi)毒素休克所致腎臟損傷提供了新的思路和方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突