李維 張衛(wèi)平 馬靜

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科300193

0 引 言

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，其早期隱匿性強(qiáng)，不易被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致病死率高。開展卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及可能機(jī)制的研究，對其診斷與治療有重要意義，已成為婦科惡性腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。miRNAs（micro RNA）是一類約21 nt的內(nèi)源性核苷酸小RNA，可作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子的靶向調(diào)節(jié)靶基因，對機(jī)體起調(diào)控的作用。miRNAs在腫瘤的生理和病理過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[2]。關(guān)于miRNAs相關(guān)靶點(diǎn)在卵巢癌轉(zhuǎn)移治療中的應(yīng)用研究是近年來的醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)[3-4]。miRNAs在卵巢癌的多藥耐藥發(fā)生過程中，以及在克服卵巢癌化療藥物耐藥性過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用[5]。miRNAs-1182是miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，在胃癌、腸癌、腎癌等惡性腫瘤中，及在細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移等方面起重要的調(diào)節(jié)作用[6-8]。但是，關(guān)于miRNAs在卵巢癌中的研究并不多見。本研究中，分析miRNAs-1182在卵巢癌組織中的表達(dá)，探討其對癌組織增殖與轉(zhuǎn)移的影響，及可能的調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2016～2019年在天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的81例卵巢癌患者，年齡范圍36～67歲，年齡（51.3±9.8）歲，其中年齡＜50歲患者 46例，年齡≥50歲患者35例。所有患者均經(jīng)病理確診為卵巢癌，且均為初治，既往未進(jìn)行放療及化療。

收集患者的卵巢癌組織及對應(yīng)的癌旁組織，并進(jìn)行病理分析。腫瘤分期采用2013年國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會的分期標(biāo)準(zhǔn)。81例卵巢癌患者中：Ⅰ期10例、Ⅱ期18例，Ⅲ期32例，IV期21例；高分化11例、中分化22例、低分化48例；上皮性卵巢癌41例、性索間質(zhì)卵巢癌22例、生殖細(xì)胞卵巢癌18例。

另選擇同時(shí)期在天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院行卵巢切除術(shù)的52例非卵巢癌患者，年齡范圍39～66 歲，年齡（53.3±11.4）歲。

1.2 主要材料與儀器

TrizolRNA提取試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 SYBR GREEN Premix Ex Taq（日本寶生物工程株式會社）、PCR擴(kuò)增引物序列[生工生物工程（上海）股份有限公司]，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）單克隆抗體（美國 ABCAM 公司），β-肌動(dòng)蛋白（βactin）多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（美國Santa Cruz公司），Transwell小室（美國Corning公司）

7900HT Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI Life Technologies公司），Thermo MK3酶標(biāo)儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)，IX71倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR檢測卵巢組織中miR-1182的表達(dá)水平

采用Trizol法，按照RNA提取試劑盒說明書提取組織的總RNA，采用miRNAs逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成cDNA。U6引物：5′-GACACGCA-AATTCGTG-3′,5′-GTGCAGGGTCCG-AGGT-3′。miR-1182 引物：5′-ACCTTCCTCAGGACCCTGGTCCGAGGT-3′，5′-CAACATCTACAAGATCCTCCTGCTGCAGG-3′。PCR 反應(yīng)體系為：cDNA 1.5 μl，miR-1182 或 U6 引 物 1 μl，SYBR GREEN premix Ex taq 10 μl，H2O 7.5 μl。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃、30 s，變性 95℃、5 s，退火延伸 60℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。使用7900HT Fast型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，根據(jù)2-ΔCt法計(jì)算miR-1182的表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取3次結(jié)果的均值±標(biāo)準(zhǔn)差為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.2 miR-1182病毒轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3用DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清）培養(yǎng)，以5×105密度接種于6孔板。正常對照組按照常規(guī)培養(yǎng)，病毒轉(zhuǎn)染組采用miR-1182 mimics（1.0 μg/ml）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，另設(shè)立空白病毒組，6 h后換常規(guī)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR方法見1.3.1節(jié)。

1.3.3 Western Blot檢測SKOV-3細(xì)胞hTERT蛋白的表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染48 h后收集各組SKOV-3細(xì)胞，SDS裂解液提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后每孔蛋白上樣量為30 μg，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，1∶500 hTERT單克隆抗體4℃下孵育過夜，1∶1000 二抗室溫孵育 1 h，以 1∶1000 的 β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.3.4 噻唑藍(lán)法檢測SKOV-3細(xì)胞增殖情況

將SKOV-3細(xì)胞以1×104密度接種于96板，按照1.3.2中的分組與病毒轉(zhuǎn)染方法，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后，以每孔加入5mg/ml的噻唑藍(lán)溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清液，每孔加二甲基亞砜150μl，振蕩溶解15 min，使用酶標(biāo)儀檢測各孔于450 nm處的吸光度（A450）值。

1.3.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測SKOV-3細(xì)胞穿膜情況

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，以1×105密度接種于Transwell小室內(nèi)，將小室至于含有常規(guī)培養(yǎng)基的48孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后取出小室，刮去室內(nèi)細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，雙蒸水清洗，顯微鏡下選取6個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，算平均值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-1182的表達(dá)情況

miR-1182在正常卵巢組織、卵巢癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平如圖1所示。結(jié)果顯示，miR-1182在正常卵巢組織（3.06±0.29）與癌旁組織（2.92±0.34）中的表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；miR-1182在卵巢癌組織中的表達(dá)水平（0.66±0.19）明顯低于正常卵巢組織（3.06±0.29）與癌旁組織（2.92±0.34）（均 P＜0.05）。

圖1 miR-1182在組織中的表達(dá)水平

2.2 卵巢癌組織中的miR-1182的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，對于卵巢癌組織中miR-1182的表達(dá)水平，不同腫瘤分期、組織分化程度患者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而患病年齡與腫瘤類型的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。（表1）

2.3 卵巢癌細(xì)胞miR-1182及hTERT蛋白的表達(dá)情況

在SKOV-3卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1182 mimics病毒后，轉(zhuǎn)染組的miR-1182表達(dá)水平較空白病毒組和對照組明顯升高（均P＜0.05），而對照組和空白病毒組的miR-1182表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖 2）

表1 卵巢癌組織中的miR-1182的表達(dá)水平與臨床病理特征間的關(guān)系

圖2 各組SKOV-3卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1182 mimics病毒后的miR-1182表達(dá)水平

Western Blot結(jié)果顯示，在SKOV-3卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1182 mimics病毒后，轉(zhuǎn)染組hTERT蛋白表達(dá)水平較空白病毒組和對照組明顯降低（均P＜0.05），而對照組和空白病毒組的hTERT蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖3）

圖3 各組SKOV-3卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1182 mimics病毒后的hTERT蛋白表達(dá)

2.4 miR-1182對卵巢癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組和空白病毒組在各時(shí)間點(diǎn)A450值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），轉(zhuǎn)染組在培養(yǎng)24、48、72 h后，A450值明顯低于對照組和空白病毒組（均P＜0.05）。

細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞穿膜數(shù)量結(jié)果顯示，對照組和空白病毒組穿膜細(xì)胞數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組和空白病毒組（均 P＜0.05）。（表 2）。

表2 各組SKOV-3卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1182 mimics后細(xì)胞的增殖與侵襲情況

3 討論與結(jié)論

miRNAs表達(dá)異常發(fā)生在很多常見的人類腫瘤組織中。由于miRNAs具有靶向基因的調(diào)控作用，對細(xì)胞生長、分化和凋亡的調(diào)控起重要作用，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密不可分[9-10]。因此，部分miRNAs在腫瘤的診斷與治療中，存在潛在的應(yīng)用價(jià)值[11-12]。

miRNAs-1182是miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)，miRNAs-1182對許多腫瘤發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[13]。circABCC4通過miR-1182促進(jìn)FOXP4的表達(dá)并促進(jìn)前列腺癌的惡性發(fā)展，circABCC4/miR-1182/FOXP4調(diào)節(jié)環(huán)可能是前列腺癌介入治療的一個(gè)潛在的理想靶點(diǎn)[14]。LINC00339與miR-1182相互作用促進(jìn)SKA1的表達(dá)，表明LINC00339/miR-1182/SKA1在肝癌進(jìn)展中起重要作用[15]。卵巢癌中高表達(dá)circWHSC1，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生，而通過調(diào)節(jié)miR-145和miR-1182其外顯子，作用于腹膜間皮，可誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移[16]。本研究中，檢測了正常卵巢組織、卵巢癌組織和癌旁組織中的miR-1182表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-1182在卵巢癌組織中表達(dá)明顯降低，這與Hou等[17]的研究結(jié)果一致。此外發(fā)現(xiàn)：對于卵巢癌組織中的miR-1182表達(dá)水平，不同腫瘤分期、分化程度的患者間有明顯差異；隨臨床分期的進(jìn)展及組織分化程度增加，miR-1182的表達(dá)水平逐漸降低。提示miR-1182可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

本研究中，通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究miR-1182在卵巢癌中的作用機(jī)制。在用miR-1182 mimics病毒轉(zhuǎn)染SKOV-3卵巢癌細(xì)胞后，檢測細(xì)胞中miR-1182和hTERT的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-1182病毒后，miR-1182的表達(dá)明顯升高，hTERT的表達(dá)明顯降低。提示在卵巢癌細(xì)胞中，miR-1182對hTERT蛋白有負(fù)調(diào)節(jié)作用。有研究結(jié)果表明，miR-1182通過與hTERT的開放讀碼框（open reading frame，ORF）結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后抑制 hTERT 的表達(dá)[4]。有研究者通過熒光素酶檢測證實(shí)，hTERT是miR-1182的直接靶點(diǎn)，miR-1182在卵巢癌中的抑制作用是通過miR-1182/hTERT軸實(shí)現(xiàn)的[17]。

本研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-1182的卵巢癌細(xì)胞在培養(yǎng)24、48和72 h后，細(xì)胞增殖受到明顯的抑制，且高表達(dá)miR-1182的卵巢癌細(xì)胞的穿膜數(shù)量明顯減少。該結(jié)果提示，miR-1182的表達(dá)可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲與浸潤能力。有研究結(jié)果表明，miR-1182的過度表達(dá)能顯著抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、集落形成和侵襲，miR-1182通過結(jié)合其3'UTR直接靶向hTERT[18]。hTERT是端粒酶催化亞基，具有調(diào)控端粒酶活性和促進(jìn)端粒延長的作用。端粒酶是細(xì)胞癌變過程中的重要調(diào)控因子，其無直接致癌作用，但是它具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期，延長腫瘤細(xì)胞生存時(shí)間，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤形成的作用。

綜上，miR-1182在卵巢癌組織中低表達(dá)，而過表達(dá)miR-1182可抑制卵巢癌的增殖與侵襲，其通過靶向調(diào)節(jié)hTERT表達(dá)實(shí)現(xiàn)調(diào)控作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突