毛毅 曾義嵐 吳桂輝 江智豪 范琳

機體的免疫功能低下是引起潛伏性結(jié)核感染及活動性結(jié)核病的因素之一[1]。宿主對結(jié)核分枝桿菌(MTB)免疫應(yīng)答主要由巨噬細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、淋巴細胞等完成，這些細胞可介導機體的固有及適應(yīng)性免疫應(yīng)答[2]，其中T淋巴細胞介導的適應(yīng)性免疫在結(jié)核病的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸起著關(guān)鍵性的作用[3]。肺結(jié)核患者由于存在著耐藥、并發(fā)癥、年齡、聯(lián)合用藥等復雜因素的影響，使得不同患者的免疫應(yīng)答可能存著較大差異，患者的免疫應(yīng)答差異可能影響患者的療效，因此研究肺結(jié)核患者臨床特征對于免疫應(yīng)答的影響也可能成為未來結(jié)核病免疫治療研究的切入點。本研究連續(xù)性收集同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院的1000例肺結(jié)核患者的臨床信息及流式細胞(T淋巴細胞亞群及NK細胞)檢測結(jié)果，通過統(tǒng)計學分析，以便能發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者的各種臨床特征與流式細胞亞群檢測結(jié)果之間是否存在相關(guān)性。

資料和方法

一、研究對象

回顧性、連續(xù)性收集同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院2019年1月1日至5月25日收治的確診及臨床診斷為肺結(jié)核的患者1000例。肺結(jié)核的診斷根據(jù)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[4]進行。

二、儀器和方法。

1.儀器：采用Epics XL型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

2.方法：抽取患者空腹靜脈血2 ml，肝素抗凝，進行熒光標記，100 μl全血與CD3-異硫氰酸熒光素(FITC)/CD16CD5藻紅蛋白(PE)熒光雙標記單克隆抗體(法國Immunotech公司)室溫反應(yīng)20 min，加入Optilyse C溶血素(法國Immunotech公司)500 μl充分混勻，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌重懸細胞，檢測血中CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD3-CD16+CD56+細胞(NK細胞)陽性表達率。

三、記錄與收集

記錄患者所有外周血流式細胞染色結(jié)果、性別、年齡、初/復治、有無并發(fā)癥、有無并發(fā)肺外結(jié)核、痰抗酸染色涂片、呼吸道標本(痰液和纖維支氣管鏡沖洗液)的BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)及藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)、MTB分子生物學檢測(包括GeneXpert MTB/RIF檢測和MTB DNA/RNA檢測)、胸部CT檢查(肺部病灶范圍、空洞數(shù)量、最大空洞直徑)。根據(jù)《中國耐多藥和利福平耐藥結(jié)核病治療專家共識(2019年版)》[5]的規(guī)定， MDR-TB(耐多藥結(jié)核病)是指結(jié)核病患者感染的MTB體外藥敏試驗證實至少同時對異煙肼和利福平耐藥的結(jié)核病。XDR-TB(廣泛耐藥結(jié)核病)是指結(jié)核病患者感染的MTB體外藥敏試驗證實同時對異煙肼和利福平耐藥，還對任何喹諾酮類藥品耐藥，以及3種二線注射類藥品(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少1種耐藥的結(jié)核病。初治肺結(jié)核：(1)尚未開始抗結(jié)核藥品治療的患者;(2)正進行標準化療方案用藥而未滿療程的患者;(3)不規(guī)則化療<1個月的患者。復治肺結(jié)核:(1)初治失敗的患者；(2)規(guī)則用藥滿療程后痰菌又復陽的患者;(3)不規(guī)律化療>1個月的患者;(4)慢性排菌患者。

四、納入患者的臨床特征

1.一般情況：1000例肺結(jié)核患者，男625例，女375例，年齡為11～92歲，中位年齡33歲，年齡分布以20～<40歲為主，占44.0%。確診肺結(jié)核(以病原學、病理學結(jié)果作為確診依據(jù))479例；臨床診斷[以病原學(包括細菌學、分子生物學)檢查為主，結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)和胸部影像學特征、相關(guān)的輔助檢查及鑒別診斷等，進行綜合分析做出診斷]521例。初治肺結(jié)核769例，復治肺結(jié)核231例；有1種或以上并發(fā)癥的患者170例，其中并發(fā)糖尿病123例、并發(fā)慢性阻塞性肺疾病(COPD)78例、并發(fā)支氣管擴張56例、并發(fā)乙型病毒性肝炎45例、并發(fā)肺外結(jié)核者320例。

2.患者的臨床特征：1000例患者中，呼吸道標本抗酸染色涂片陽性298例，陽性率29.8%。BACTEC MGIT 960培養(yǎng)陽性479例，陽性率47.9%；藥敏試驗結(jié)果提示MDR-TB/XDR-TB 77例，GeneXpert MTB/RIF檢測陽性339例，陽性率33.9%。呼吸道標本MTB的DNA/RNA檢測陽性423例，陽性率42.3%。

3. 胸部CT檢查重點觀察如下指標。(1)肺部病灶范圍：無病灶累及肺野55例，累及1個肺野197例，累及2個肺野129例，累及3個肺野173例，累及4個肺野88例，累及5個肺野37例，累及6個肺野321例。(2)肺部空洞數(shù)量：無空洞780例，1個空洞138例，2個空洞48例，3個空洞16例，4個空洞13例，5個空洞1例，6個及以上空洞4例。(3)最大空洞直徑：在肺部有空洞的220例患者中，收集每例患者肺部最大的空洞直徑進行分析，其中最大值為9.03 cm，最小值為0.10 cm，中位數(shù)為1.67 cm。

五、統(tǒng)計學處理

1.變量賦值標準：(1)呼吸道標本抗酸染色分級賦值。-=0；+=1；++=2；+++=3；++++=4。(2)病灶范圍分級賦值。0個肺野=0；1個肺野=1；2個肺野=2；3個肺野=3；4個肺野=4；5個肺野=5；6個肺野=6。(3)分子生物學檢測(包括GeneXpert MTB/RIF檢測、MTB DNA/RNA檢測)賦值。設(shè)定任何一項分子生物學檢測陽性=1；所有標本的分子生物學檢測陰性=0。(4)其他各項賦值。男性=1；女性=0。初治=1；復治=0。無肺外結(jié)核=0；并發(fā)肺外結(jié)核=1。無并發(fā)癥=0；有并發(fā)癥=1。藥敏試驗全敏感=0，MDR-TB/XDR-TB=1。為了解各年齡段患者與流式細胞亞群數(shù)量的相關(guān)性，將患者分為0～歲、20～歲、40～歲及≥60歲4個年齡組進行分析；引入4個啞變量：age1(0～<20歲=1，≥20歲=0)、age2(20～<40歲=1，<20歲及≥40歲=0)、age3(40～<60歲=1，<40歲及≥60歲=0)、age4(≥60歲=1，<60歲=0)。

2. 統(tǒng)計學方法:所有資料采用Excel 2013建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)采用Eviews 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析。分別以流式細胞亞群計數(shù)“CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD3-CD16+CD56+細胞(NK細胞)”為因變量；以各臨床特征“性別、年齡、初/復治、有無并發(fā)癥、并發(fā)肺外結(jié)核、呼吸道標本抗酸染色涂片、呼吸道標本的BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)及藥敏試驗、MTB分子生物學檢測(包括GeneXpert MTB/RIF檢測、MTB DNA/RNA檢測)、胸部CT檢查(肺部病灶范圍、空洞數(shù)量、最大空洞直徑)”為自變量。采用最小二乘法建立多元線性逐步回歸模型，通過逐一剔除無明顯影響的臨床特征，最終建立多元線性逐步回歸模型，分析以上臨床特征對外周血流式細胞計數(shù)的影響。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、 各項臨床特征與CD3+ T細胞的相關(guān)性分析

通過各項臨床特征與外周血CD3+T細胞檢測值進行多元線性逐步回歸分析，最終模型顯示肺部病灶范圍與CD3+T細胞數(shù)量呈負相關(guān)，回歸系數(shù)-0.255，P<0.05，有統(tǒng)計學意義；表明肺部病灶范圍越大，CD3+T細胞數(shù)量越低?？顾崛旧科栃耘cCD3+T細胞數(shù)呈負相關(guān)，回歸系數(shù)-0.499，P<0.05，有統(tǒng)計學意義；表明隨著抗酸染色涂片陽性程度越高，其CD3+T細胞數(shù)量越少(表1)。其余臨床特征經(jīng)過統(tǒng)計學檢驗P值均>0.05，無統(tǒng)計學意義，經(jīng)逐步回歸分析逐一剔除；證明這些臨床特征與CD3+T細胞的表達水平無明顯相關(guān)性。該項統(tǒng)計學檢驗的回歸模型R2=0.558，擬合度可，且模型的P<0.05，證明模型具有統(tǒng)計學意義。

二、 各項臨床特征與CD4+ T細胞的相關(guān)性分析

通過各項臨床特征與外周血CD4+T細胞檢測值進行多元線性逐步回歸分析，最終模型顯示：0～<20歲年齡段(age1)與患者CD4+T細胞有相關(guān)性，回歸系數(shù)-4.710，P<0.05，有統(tǒng)計學意義，表明0～<20歲年齡段患者CD4+T細胞低于其他年齡段患者?；颊叩男詣e與CD4+T有相關(guān)性，回歸系數(shù)-2.150，P<0.05，表明在肺結(jié)核患者中男性患者CD4+T細胞數(shù)低于女性患者；此外，患者的呼吸道標本MTB的分子生物學檢測結(jié)果與CD4+T淋巴的檢測數(shù)值有相關(guān)性，回歸系數(shù)1.433，P<0.05，表明分子生物學檢測陽性的患者其CD4+T細胞比值高于分子生物學檢測呈現(xiàn)陰性的肺結(jié)核患者(表2)。其余臨床特征經(jīng)過統(tǒng)計學檢驗P>0.05，無統(tǒng)計學意義，經(jīng)逐步回歸分析逐一剔除，證明這些臨床特征與CD4+T細胞的表達水平無明顯相關(guān)性。該統(tǒng)計模型顯示回歸模型R2=0.334，模型的P<0.05，證明該項統(tǒng)計模型具有統(tǒng)計學意義。

三、 各項臨床特征與CD8+ T細胞的相關(guān)性分析

通過各項臨床特征與外周血CD8+T細胞檢測值進行多元線性逐步回歸分析，最終模型顯示：初治/復治與CD8+T細胞數(shù)量有相關(guān)性，回歸系數(shù)1.247，P<0.05，有統(tǒng)計學意義，即初治患者CD8+T細胞數(shù)量大于復治患者；抗酸染色涂片陽性同CD8+T細胞數(shù)量呈正相關(guān)，回歸系數(shù)0.442，P<0.05，有統(tǒng)計學意義，表明隨著抗酸染色涂片陽性程度越高，其CD8+T細胞數(shù)量越高(表3)。其余臨床特征經(jīng)過統(tǒng)計學檢驗P>0.05，無統(tǒng)計學意義，經(jīng)逐步回歸分析逐一剔除，證明這些臨床特征與CD8+T細胞的表達水平無明顯相關(guān)性。該統(tǒng)計模型顯示回歸模型R2=0.331，模型的P<0.05，證明該項統(tǒng)計模型具有統(tǒng)計學意義。

四、各項臨床特征與NK細胞的相關(guān)性分析

通過各項臨床特征與外周血NK細胞檢測值進行多元線性逐步回歸分析，最終模型顯示：是否并發(fā)肺外結(jié)核與NK細胞有相關(guān)性， 回歸系數(shù)0.375，P<0.05，有統(tǒng)計學意義，證明并發(fā)肺外結(jié)核患者NK細胞低于未并發(fā)肺外結(jié)核患者(表4)。其余臨床特征經(jīng)過統(tǒng)計學檢驗P>0.05，無統(tǒng)計學意義，經(jīng)逐步回歸分析逐一剔除，證明這些臨床特征與NK細胞的表達水平無明顯相關(guān)性。該統(tǒng)計模型顯示回歸模型R2=0.894，模型的P<0.05，證明該項統(tǒng)計模型具有統(tǒng)計學意義。

討 論

由于MTB是胞內(nèi)寄生菌，在結(jié)核病發(fā)病過程中宿主的T細胞(CD3+、CD4+、CD8+)及NK細胞在宿主免疫抵抗MTB感染中發(fā)揮著重要的作用[6]。MTB與宿主之間的相互作用決定著疾病的進展，由此導致不同的患者可有不同的臨床特征及免疫表達特征[7]。本研究旨在通過大樣本統(tǒng)計學分析肺結(jié)核患者的臨床特征與其外周血免疫細胞表達水平之間的相關(guān)性。

表1 1000例肺結(jié)核患者各項臨床特征與外周血CD3+ T細胞的多元線性逐步回歸模型

表2 1000例肺結(jié)核患者各項臨床特征與外周血CD4+ T細胞的多元線性逐步回歸模型

表3 1000例肺結(jié)核患者各項臨床特征與外周血CD8+ T細胞的多元線性逐步回歸模型

表4 1000例肺結(jié)核患者各項臨床特征與外周血NK細胞的多元線性逐步回歸模型

一、肺結(jié)核患者臨床特征與CD3+T細胞數(shù)量的相關(guān)性

1．肺部病變范圍越大，CD3+T細胞數(shù)量越少：Morais-Papini[8]的研究指出肺部病變的程度會影響保護性細胞因子的分泌水平。Fan等[9]的研究顯示重癥空洞性肺結(jié)核患者的CD3+CD4+T細胞數(shù)量下降。本研究顯示肺部病灶范圍與CD3+T細胞的數(shù)量呈負相關(guān)，肺部病灶范圍越大，則CD3+T細胞數(shù)量越少，與前面的研究結(jié)果一致。因此，肺結(jié)核患者肺部病灶的病理損傷程度越重，越不利于患者的保護性細胞免疫水平的發(fā)揮。 T淋巴細胞亞群在結(jié)核病患者外周血中分布失衡，可能與疾病的發(fā)展相關(guān)，兩者互為因果[10]。

2．呼吸道標本抗酸染色涂片陽性程度越高，其CD3+T細胞數(shù)量越低：以往很少有學者關(guān)注抗酸染色涂片與患者T淋巴細胞數(shù)量的關(guān)系，而抗酸染色涂片的結(jié)果一定程度上反映了肺結(jié)核患者體內(nèi)感染MTB的載荷。本研究發(fā)現(xiàn)抗酸染色涂片與CD3+T細胞數(shù)量呈負相關(guān)，表明隨著抗酸染色涂片陽性程度增加，其CD3+T細胞數(shù)量越低，患者免疫功能下降越明顯。因此研究痰抗酸染色與CD3+T淋巴細胞數(shù)量的相關(guān)性具有重要意義。

二、肺結(jié)核患者臨床特征與CD4+ T細胞數(shù)量的相關(guān)性

眾所周知，CD4+T細胞在控制結(jié)核感染中起著非常重要的作用，以CD4+T細胞特異性免疫應(yīng)答及其通過分泌γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)刺激負載MTB的巨噬細胞活化構(gòu)成了抗結(jié)核免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。

1.患者的年齡與CD4+T細胞表達有關(guān)：林俊錦等[11]報道老年人肺結(jié)核組CD4+T細胞及CD4+/CD8+比值低于與青壯年組及健康組。井楠等[12]通過40例肺結(jié)核患者的研究發(fā)現(xiàn)老年患者的血清CD4+T細胞明顯低于青年、中年患者。但本研究則顯示0～<20歲年齡段患者CD4+T細胞數(shù)量低于其他年齡段患者。分析其原因：青少年肺結(jié)核患者的肺部病灶及免疫受損的程度可能嚴重于成年人及中老年患者。

2.肺結(jié)核患者中男性患者CD4+T細胞數(shù)低于女性患者：Hussain等[13]通過50例患者研究表明性別差異并未影響T淋巴細胞亞群；但是本次研究通過大樣本數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者CD4+T細胞數(shù)量男性低于女性患者。

3.分子生物學檢測陽性肺結(jié)核患者的CD4+T細胞數(shù)量高于陰性者：本次研究還發(fā)現(xiàn)，分子生物學檢測陽性患者CD4+T細胞數(shù)量大于分子生物學檢測陰性患者，表明當機體被MTB感染，機體通過調(diào)節(jié)，提高CD4+T細胞數(shù)量，以增加IFN-γ的分泌抑制結(jié)核的免疫逃逸。因此分子生物學檢測陽性可能與機體的CD4+T細胞數(shù)量密切相關(guān)。

三、肺結(jié)核患者臨床特征與CD8+ T細胞數(shù)量的相關(guān)性

1.復治肺結(jié)核患者CD8+T細胞數(shù)量低于初治患者：黃麗靜等[14]對76例肺結(jié)核患者的研究發(fā)現(xiàn)復治患者的CD8+T淋巴細胞數(shù)量大于初治患者，但來自沈潔等[15]的研究顯示：初/復治患者CD8+T淋巴細胞無明顯變化。本次研究的數(shù)據(jù)顯示，復治肺結(jié)核患者CD8+T細胞數(shù)量低于初治患者；這與國外研究結(jié)論一致，CD8+T細胞在MTB感染初期肺中的細胞數(shù)量會出現(xiàn)升高[16]。從理論上分析，復治肺結(jié)核患者病情普遍偏重、耐藥結(jié)核病發(fā)生率高，且經(jīng)過初治治療失敗、復發(fā)等過程的因素可能引起體內(nèi)某種調(diào)控機制影響CD8+T細胞增殖，從而導致細胞數(shù)量下降。

2.呼吸道標本抗酸染色涂片陽性程度增加，其CD8+T細胞表達的數(shù)量增加：本研究的數(shù)據(jù)還顯示抗酸染色涂片陽性程度與CD8+T細胞數(shù)量呈正相關(guān)，即隨著抗酸染色涂片陽性程度增加，其CD8+T細胞表達的數(shù)量增加，這個結(jié)論與國外某些學者的研究相似。Guglielmetti等[17]觀察到肺結(jié)核患者CD8+T細胞的陽性數(shù)值較健康對照組增加。而Yang 等[18]的研究則認為，盡管在MTB感染期間CD8+T細胞反應(yīng)強烈且持續(xù)，但CD8+T細胞不能完全識別受感染的巨噬細胞，導致CD8+T細胞的免疫保護效應(yīng)受到影響。此外，活動性肺結(jié)核患者CD8+T細胞升高的原因還可能在于：(1)體內(nèi)的細胞毒性CD8+T細胞反應(yīng)性擴增以抵抗MTB的入侵；(2)CD4+T細胞數(shù)量下降導致的CD8+T細胞數(shù)量升高。以上研究結(jié)論及推測仍然需要進行深入研究予以證實。

四、肺結(jié)核患者臨床特征與NK細胞的相關(guān)性

NK細胞是CD3-CD16+CD56+的細胞亞群，可介導宿主的固有免疫反應(yīng)。Ye 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞在肺結(jié)核患者和健康對照組中差異無統(tǒng)計學意義。本次研究結(jié)果則提示，并發(fā)肺外結(jié)核患者NK細胞數(shù)量低于未并發(fā)肺外結(jié)核患者，證實了NK細胞數(shù)量降低可能導致MTB的全身播散，從而導致肺外結(jié)核的增加。

此外，雖然陸恩詞和朱穎蔚[20]的研究提示肺結(jié)核并發(fā)糖尿病患者T淋巴細胞亞群低于單純肺結(jié)核，但是本次研究中并未發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核的并發(fā)癥(本研究中170例患者發(fā)生并發(fā)癥，其中包括123例并發(fā)糖尿病)與CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞及NK細胞表達具有相關(guān)性。

本次研究雖然樣本量較大，分析具有很強的客觀性，但尚存在一定的局限性，回顧性研究分析指標較多，建立的多元線性回歸模型由于變量較多，變量間存在比較復雜的聯(lián)系和干擾，可能影響分析結(jié)果，亟待未來進一步優(yōu)化研究方案、進行更深入的研究來予以證實。

本次研究運用多元線性回歸模型將肺結(jié)核患者的臨床特征與T淋巴細胞亞群中的CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞進行了大樣本的研究，發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者的肺部病灶范圍及抗酸染色涂片與CD3+T細胞表達有關(guān)，肺部病灶范圍越大，CD3+T細胞數(shù)量越低；抗酸染色涂片陽性程度越高，CD3+T細胞數(shù)量越少。患者的年齡、性別、分子生物學檢測結(jié)果與CD4+T細胞表達有關(guān)，0～<20歲年齡段患者CD4+T細胞低于其他年齡段患者，肺結(jié)核患者中男性患者CD4+T細胞數(shù)低于女性患者；分子生物學檢測陽性患者的CD4+T細胞數(shù)量高于陰性患者?；颊叱踔?復治和抗酸染色涂片結(jié)果與CD8+T細胞表達有關(guān)，初治患者CD8+T細胞數(shù)量大于復治患者；抗酸染色涂片陽性程度越高，CD8+T細胞數(shù)量越高。是否并發(fā)肺外結(jié)核與NK細胞的表達有關(guān)，并發(fā)肺外結(jié)核患者NK細胞低于未并發(fā)肺外結(jié)核患者。這些臨床特征相關(guān)性的免疫差異性表達可能成為未來免疫治療研究的切入點。

志謝本文統(tǒng)計學分析由上海外國語大學經(jīng)濟管理學院張耿教授指導，在此表示衷心感謝。