秦智偉，張君鳴，辛 明，單寶成，周秀艷

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，哈爾濱 150030）

黃瓜產(chǎn)量是植物育種重要研究方向，通過雜種優(yōu)勢開展雜交育種可顯著提高黃瓜產(chǎn)量，研究黃瓜雜種優(yōu)勢調(diào)控機制對提高黃瓜產(chǎn)量具有重要意義。黃瓜產(chǎn)量受各種因素影響，如溫度、濕度、性狀分化、病蟲害等。其中高溫脅迫在黃瓜夏季栽培十分常見，在黃瓜幼苗耐熱性研究中，即使兩個親本為熱敏品種，通過雜交也會使子一代黃瓜體內(nèi)CAT、SOD 等酶活性顯著提高，在高溫脅迫方面表現(xiàn)出優(yōu)于親本的耐受力[1]，增加黃瓜產(chǎn)量。

黃瓜是夏季蔬菜大棚栽培中廣泛栽培的作物，在黃瓜生長過程中，高溫脅迫破壞植物細胞，影響植物代謝系統(tǒng)使其產(chǎn)生次生代謝物[2]。高溫脅迫影響植物生理過程，植物光合作用能力下降，加劇蒸騰，導致水分大量流失，嚴重影響黃瓜產(chǎn)量。當植物遭遇高溫脅迫時，信號傳導及分子伴侶轉(zhuǎn)錄能力增強，釋放活性氧，同時體內(nèi)與高溫脅迫相關(guān)蛋白大量合成應對高溫脅迫[3]。熱激蛋白（HSPs）是指當植物遭遇熱脅迫時，在植物體內(nèi)迅速大量誘導并合成的一類應激蛋白，可防止植物體內(nèi)其他蛋白質(zhì)發(fā)生變性，保證植物本身蛋白質(zhì)原有空間構(gòu)象不會因高溫脅迫而發(fā)生改變，所有生物均包含不同數(shù)量和類型熱激蛋白[4]。熱激蛋白又稱為“逆境蛋白”[5-6]，屬于保守的蛋白[7]。在植物正常成長發(fā)育中，植物體內(nèi)熱激蛋白數(shù)量較少，但當植物溫度過高，遇到熱脅迫刺激時，該蛋白快速且大量合成[8]，被稱為熱激反應（Heat shock response,HSR）[9]。Ritossa 在研究品種為黃猩猩的果蠅響應熱激過程中發(fā)現(xiàn)[10]，果蠅體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)，將受高溫脅迫時才被誘導并表達的該類蛋白質(zhì)命名為熱激蛋白。植物中不同熱激蛋白相對分子質(zhì)量不同，不同植物具有不同數(shù)量和類型熱激蛋白，可將熱激蛋白區(qū)分為20、60、70、100和小分子HSP家族（sHSPs）[11-12]。在多種類型的熱激蛋白中，小分子熱激蛋白是熱激蛋白大家族中的一部分，在植物中分布最廣，含量最高，主要應對植物高溫脅迫[13]。熱激蛋白家族通常還表現(xiàn)明顯的雜種優(yōu)勢，例如，在高溫條件下，陸地棉雜交子一代花粉表現(xiàn)耐高溫超親和中親優(yōu)勢，花粉活力有明顯雜交優(yōu)勢特性，而體內(nèi)HSP90 基因和sHSP2 基因大量表達還可顯著增加熱脅迫下花粉生存能力[14]。研究表明，水稻中OsHsp20 基因在水稻生長期差異表達，說明該基因參與水稻營養(yǎng)和生殖生長過程，該基因家族均存在明顯雜種優(yōu)勢[15]。小熱激蛋白不僅參與植物耐熱脅迫時調(diào)控機制且均具有較強雜種優(yōu)勢。熱激蛋白在植物耐熱性方面存在顯著的雜種優(yōu)勢，利用雜種優(yōu)勢增加黃瓜品種耐熱性和探索不同分子在黃瓜對熱脅迫的響應中的調(diào)控機制對提高黃瓜產(chǎn)量至關(guān)重要。

本研究選取黃瓜產(chǎn)量雜種優(yōu)勢表現(xiàn)顯著雜交組合“C15-114”（D1104-2-4×D0708-2），通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選得到關(guān)鍵基因并克隆，預測其蛋白質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系等，利用生物信息學分析和研究，找尋該基因與黃瓜產(chǎn)量雜種優(yōu)勢間關(guān)系，了解該基因功能，為開展該基因在黃瓜產(chǎn)量雜種優(yōu)勢中的調(diào)控機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)同親回歸法（c.p.r）[16]，父本統(tǒng)一為黃瓜品種“D0708-2”，分別與其他4 個母本“D1101-1-2、D0528-2、D1104-2-4、D1158-2”自交系雜交，試驗選取4 個雜交組合中產(chǎn)量雜種優(yōu)勢最為顯著品種“D1104-2-4×D0708-2”雜交種C15-114 為試驗材料。

1.2 試驗藥劑

Trizol 購自Invitrogen 公司，凝膠回收試劑盒、DNA 聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)公司，dNTP、T3克隆載體均購自TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 黃瓜C15-114RNA提取和檢測

將黃瓜品種C15-114葉子提取至干凈且無菌研缽中，添加液氮并快速充分研磨。Trizol 法提取總RNA。使用瓊脂糖電泳檢測提取的RNA純度。

①在滅菌的干凈研缽中加入液氮，將研缽預冷，選取約100 mg黃瓜葉片組織，置于研缽中加液氮并迅速研磨，將葉片組織制成粉末，轉(zhuǎn)入1.5 mL預冷無菌離心管中。

②加入1 mL Trizol，上下顛倒數(shù)次充分搖勻，在室溫內(nèi)存放5 min；

③加入0.2 mL 氯仿，劇烈搖蕩15 s，設置離心機參數(shù)為4 ℃，12 000 r·min-1，離心15 min；

④取0.45～0.55 mL 上層清液置于新無菌離心管中，加入與清液同等數(shù)量異丙醇，反復晃動搖勻，室溫下靜置10 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min；

⑤抽取棄掉上層清液，向離心管中放入1 mL 75%DEPC-乙醇，渦旋震蕩洗滌白色固體，4 ℃，7 500 r·min-1離心5 min（再重復操作1次此步驟）；

⑥棄掉上層清液，將無菌離心管放置在干燥濾紙上，室溫下靜置5～10 min干燥沉淀物；

⑦加入30 μL DEPC-水溶解RNA，-80 ℃冰箱保存待用；

⑧取1 μL RNA，利用紫外分光光度計（SMA 3000）檢測RNA濃度。

1.3.2 cDNA第一鏈合成

根據(jù)第一鏈合成Fast Super RT Kit cDNA 說明書，通過以下步驟將先前提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。

①在冰浴上，無菌微型離心管中配置RNA 消化反應混合液：gDNase 1 μL，10×Buffer 1 μL，總RNA約1 μg，Rnase-free H2O加至總體系 10 μL。

② 42 ℃水浴2 min。

③ 取出，加入1 μL Stop Buffer，65 ℃水浴2 min。

④在滅菌過微型離心管中制備反轉(zhuǎn)錄混合液，反轉(zhuǎn)錄體系包括：消化反應液內(nèi)總RNA 0.2～2 μg，Reverse transcriptase MIX 10 μL，Oligo（dt）Primer 1 μL，ddH2O 加至總體系 20 μL。在 PCR儀上50 ℃條件下反轉(zhuǎn)錄反應20～50 min，72 ℃，2 min。

⑤利用紫外分光光度計（SAM3000）測定cDNA濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物設計

通過軟件Primer Premier v6.0 在線設計克隆CsHSP20 全長所需引物，上游引物序列：CsH?SP20-F，5' TGAACCTGCTCCTACTCC 3'；下游引物序列：CsHSP20-R，5' GGAGTAGGAGCAGGT TCA 3'。以黃瓜EFla為內(nèi)參基因，EFla-F：5' CC AAGGCAAGGTACGATGAAA 3'；EFla-R： 5'AGA GATGGGAACGAAGGGGAT 3'，引物序列由哈爾濱華大科技有限公司合成。

1.3.4CsHSP20克隆

通過RT-PCR 擴增，反應體系20 μL：模板cDNA 2.5 μL；上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL；dNTP 2 μL；10×PCR Buffer 2 μL；Taq酶0.2 μL；加入 ddH2O 至總體系20 μL。PCR 反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。電泳檢測擴增產(chǎn)物，通過回收試劑盒將該目的片段回收。將目的片段連接到pGEM-T載體，感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，篩選白色菌落陽性產(chǎn)物測序。

1.3.5 生物信息學分析

在NCBI上用Blast分析該基因序列；通過Prot?param 預測氨基酸數(shù)量、理論等電點、脂肪系數(shù)、相對分子質(zhì)量及蛋白質(zhì)其他各項理化性質(zhì)；通過TMPRED 預測該蛋白質(zhì)是否存在明顯可跨膜區(qū)域；通過SignalP 4.1在線預測蛋白質(zhì)相關(guān)信號肽情況；利用WOLF PSORT Prediction 作亞細胞定位；通過Protscale 分析該蛋白質(zhì)親水性；通過SOPMA預測其二級結(jié)構(gòu)。登陸B(tài)AKER-ROSETTASERVER在線預測該蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；登錄NCBI 網(wǎng)站，使用Blast 查找蛋白質(zhì)中同源基因，并使用MEGA 在線軟件為基因構(gòu)建系統(tǒng)樹。研究確定該蛋白質(zhì)各項生物信息，了解該基因部分功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜總RNA提取及檢測

總RNA 提取檢測結(jié)果如圖1 所示，提取情況正常，無蛋白污染RNA，可用于后續(xù)試驗操作。

2.2 基因克隆

將PCR 擴增得到目的片段檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段長度為1 820 bp。通過測序，結(jié)果顯示與黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫中基因（Csa3G020080）編碼區(qū)序列相同，相似度為100%，無堿基發(fā)生突變，表明成功獲得該目的基因，克隆成功。

2.3 生物信息學分析

2.3.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)是蛋白質(zhì)研究過程中的關(guān)鍵和基礎。利用NCBI Blast對比，結(jié)果表明，該蛋白含有alpha-crystallin-Hsps_p23-like superfamily結(jié)構(gòu)域，將該蛋白基因命名為CsHSP20。登陸Prot?param（https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ prot?param）分析氨基酸理化性質(zhì)，結(jié)果表明，CsHSP20蛋白包括212個氨基酸，理論等電點為5.43，理論相對分子質(zhì)量為23796.60，原子組成：C1021H1650N306O335S7，原子總數(shù)：3 319，不穩(wěn)定系數(shù)：62.34（不穩(wěn)定系數(shù)大于40），說明屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)75.38（見圖3）。

2.3.2 CsHSP20蛋白跨膜區(qū)域

蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域通常為α螺旋，且跨膜區(qū)蛋白質(zhì)中大多數(shù)氨基酸為疏水性氨基酸。通過軟件TMPRED（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_from.html/）預測CsHSP20 蛋白是否存在跨膜區(qū)域，結(jié)果顯示CsHSP20蛋白不存在明顯跨膜區(qū)域，不是可跨膜蛋白（見圖4）。

2.3.3 蛋白質(zhì)信號肽

蛋白質(zhì)信號肽一般為一條短肽鏈，長度為5～30 個氨基酸，位于蛋白質(zhì)氨基酸序列N 端。信號肽主要功能為促進蛋白質(zhì)連續(xù)進入分泌途徑并將蛋白質(zhì)運送至細胞外。不存在跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)不是一種膜蛋白，無法穿過細胞膜，一般不會存在蛋白質(zhì)信號肽。利用Signalp 4.1（http://www.ge?nome.cbs.dtu.dk/servioes/signalp/）分析預測CsHSP20蛋白質(zhì)信號肽情況。結(jié)果表明該蛋白質(zhì)并不存在明顯信號肽（見圖5）。

2.3.4 CsHSP20蛋白亞細胞定位

僅當?shù)鞍踪|(zhì)位于一個獨特的在亞細胞中的位置時，通過亞細胞定位軟件WOLF PSORT（http://www.genascriopt.com/psort.httpl/）預測亞細胞定位，結(jié)果表明，CsHSP20蛋白定位于線粒體中（見表1）。

表1 CsHSP20蛋白亞細胞定位預測Table 1 Subcellular localization of CsHSP20 protein

2.3.5 蛋白質(zhì)親水性與疏水性

通過 ProtScale（http://www.expasy.org/cgibin/prots cale.pl/）預測該基因編碼蛋白親疏水性，結(jié)果表明，CsHSP20 蛋白第29 個氨基酸處有最大疏水值1.533，第161個氨基酸處有最小疏水值-3.533，平均親水值為-0.646，是一種親水蛋白質(zhì)（見圖6）。

2.3.6 蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)預測

SPOMA（http://www.ibcp.fr/predict.html/）預測該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明CsHSP20 中有33 條延伸主鏈，共占多肽鏈15.57%；α 螺旋氨基酸有62個，占多肽鏈29.25%；還有9 個形成β-折疊，占多肽鏈4.25%；共有108 個氨基酸呈無規(guī)則卷曲，占比最多，占多肽鏈50.94%（見圖7）。

利用BAKER-ROSETTASERVER 在線軟件（http://www.srobetta.bakerlab.org/） 預測 CsHSP20 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型（見圖8）。

2.3.7 蛋白系統(tǒng)進化樹

登陸NCBI 網(wǎng)站下載15 個編碼蛋白為HSPs 家族蛋白不同物種基因作同源性比對，將下載的所有蛋白質(zhì)序列輸入MEGA5.0 軟件，通過Neighbor-Joining 法將16 個HSP 蛋白質(zhì)序列放入系統(tǒng)進化樹中。由圖9 可知，CsHSP20 與南瓜XP022923528.1屬于同一個分支，同源關(guān)系最近；與李子梅XP008238549.1、 辣 椒 PHU28444.1、 煙 草XP016503526.1 親緣關(guān)系較近； 與青蒿PWA77118.1 親緣關(guān)系最遠。說明CsHSP20 在葫蘆科相似物種間親緣關(guān)系更近。

3 討論與結(jié)論

大部分小分子熱激蛋白，其蛋白序列C端均存在一個α晶體蛋白（ACD）保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中含80～100個氨基酸序列[17-18]，參與細胞中多個生命活動進程，影響細胞正常生命活動。在高等植物體內(nèi)大概含有20種以上的sHSPs[19]。大部分小熱激蛋白具有保守性及反應短時性等特點[20]，植物在正常生長條件下無法檢測體內(nèi)小熱激蛋白含量，但遭遇逆境脅迫時小熱激蛋白被快速激活并大量表達。小熱激蛋白合成及表達受各類脅迫影響，在非生物脅迫中，熱脅迫與小熱激蛋白合成相關(guān)性最高[21]。在植物中小熱激蛋白屬于一種核基因編碼蛋白，存在于各類細胞器[22]。小熱激蛋白家族主要由以下大的亞家族組成：①定位于細胞質(zhì)或細胞核的 CI、CII、CIII、CIV、CV、CVI 和 CVII 亞家族；②定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的ER 亞家族；③定位于過氧化物的酶體中PO 亞家族；④定位于質(zhì)體的P 亞家族；⑤定位于線粒體的MI和MII亞家族[23-24]。植物中小熱激蛋白數(shù)量高于真核生物，植物種類和生存環(huán)境影響體內(nèi)小熱激蛋白數(shù)量和種類不同。目前在多種植物中均檢測得到不同數(shù)量小熱激蛋白，擬南芥中有19 個sHSPs 基因，水稻中有23 個sHSPs 基因，大白菜中鑒定得到27 個sHSPs 基因，番茄中至少鑒定有42 個sHSPs 基因，小麥中鑒定有至少27 個sHSPs 基因，大豆中鑒定有51 個sHSPs基因，在辣椒中鑒定有35個sHSPs基因。定位在不同細胞器中小熱激蛋白，其功能也不同。當植物遭遇熱脅迫時，相比于定位在其他細胞器中小熱激蛋白，線粒體的小熱激蛋白作用更顯著，會加快表達并發(fā)揮其功能。在線粒體中的小熱激蛋白遇到高溫脅迫時大量表達，確保光系統(tǒng)Ⅱ中蛋白質(zhì)復合物正常合成，細胞完成正常的電子傳遞及ATP 合成，保證植物正常生長。在黃瓜夏季栽培中，黃瓜產(chǎn)量與耐熱性密切相關(guān)，定位在線粒體中的小熱激蛋白使黃瓜植株易于應對高溫脅迫，保證黃瓜品質(zhì)，顯著增加產(chǎn)量。

在多種植物中耐熱脅迫與產(chǎn)量性狀之間具有顯著的雜種優(yōu)勢現(xiàn)象，相比于親本，雜種子一代耐熱性顯著提高，雜交種更利于應對高溫脅迫，提高雜交種果實品質(zhì)，產(chǎn)量也高于親本。研究表明棉花產(chǎn)量存在十分明顯雜種優(yōu)勢，雜交種產(chǎn)量往往比兩個親本高，葉片光合作用強弱影響棉花產(chǎn)量。棉花葉片光合作用與溫度關(guān)系密切，高溫脅迫導致葉片光合作用能力下降，棉花產(chǎn)量也因此受影響[25]。且不同小麥品種之間也存在明顯耐熱性差異，而小麥耐熱性狀（膜熱穩(wěn)定性）同樣存在較高雜種優(yōu)勢，雜交種F1耐熱性普遍強于雙親[26]，通過雜交可顯著提高小麥品種耐熱性，提高小麥品質(zhì)和產(chǎn)量。耐熱脅迫與植物產(chǎn)量雜種優(yōu)勢間存在密切聯(lián)系，而小熱激蛋白主要參與植物耐熱脅迫，通過研究小熱激蛋白在黃瓜夏季栽培中的功能，可有效預防黃瓜夏季栽培面臨的高溫脅迫，提高黃瓜產(chǎn)量。CsHSP20編碼的蛋白質(zhì)是一種定位在線粒體上不具有跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白，作為小熱激蛋白家族中一員，在黃瓜植株遭遇高溫脅迫時可能發(fā)揮重要作用，但當植株遭遇高溫脅迫時，CsH?SP20 具體調(diào)控機制尚不明確。后續(xù)可探究CsH?SP20 在黃瓜耐熱脅迫中發(fā)揮的重要作用及其調(diào)控機制，以及CsHSP20 在黃瓜植株雜種一代耐熱性遺傳特點。

本文從黃瓜雜種優(yōu)勢顯著組合材料轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，篩選出影響黃瓜產(chǎn)量相關(guān)基因，通過PCR 技術(shù)成功獲得該蛋白基因，利用生物信息學研究發(fā)現(xiàn)該基因所編碼蛋白屬于sHSPs 蛋白家族，確定為一種小熱激蛋白，將其命名為CsHSP20。明確該蛋白由212 個氨基酸組成，分子式為C1021H1650N306O335S7，屬于一種親水蛋白，亞細胞定位于線粒體中，不存在明顯信號肽且不具有跨膜結(jié)構(gòu)，與南瓜親緣關(guān)系最為接近，屬于一個分支。本研究為后續(xù)開展CsHSP20基因在黃瓜產(chǎn)量雜種優(yōu)勢中的具體調(diào)控機制研究奠定基礎。