王園園,王 濤,李 新,王 斌,江 魁

(華蘭基因工程有限公司,河南 新鄉(xiāng) 455200)

冰凍切片是一種在低溫條件下將生物組織快速凍結(jié)使組織達(dá)到一定硬度后進(jìn)行恒溫冷凍切片的實(shí)驗(yàn)技術(shù)[1],與石蠟切片相比,組織不需要脫水、透明等中間環(huán)節(jié),能較好地保存脂肪、類脂等成分,有利于組織抗原性和某些酶活性的保存,被廣泛應(yīng)用于免疫組化、免疫熒光、酶檢測(cè)、組織定位和原位雜交等研究中[2-5]。 近年來(lái),單抗類藥物因其廣闊的應(yīng)用前景逐漸成為新藥研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn),而組織交叉反應(yīng)作為評(píng)價(jià)單抗藥物非臨床安全性的重要手段,在藥物臨床前安全評(píng)價(jià)中有著非常重要的作用[6],因此冰凍切片技術(shù)逐漸被應(yīng)用到單抗類藥物非臨床研究中,這就要求廣大病理實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員能夠制作高質(zhì)量的冰凍切片,為藥物非臨床研究提供數(shù)據(jù)支持。 由于不同組織中水分、質(zhì)地、形態(tài)結(jié)構(gòu)和成分的多樣性等因素會(huì)直接影響冰凍切片的質(zhì)量[7],因此筆者分別從組織包埋、速凍方法選擇、切片溫度等方面對(duì)小鼠不同組織冰凍切片技術(shù)進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康NIH 小鼠10 只,雌雄各半,20 ～22 g,6 ～7周齡,清潔級(jí),來(lái)源于華蘭生物疫苗股份有限公司動(dòng)物中心[SCXK(豫)2020-0003],在華蘭基因工程有限公司動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[SYXK(豫)2018-0014]。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遵循了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的 “3R” 原則。

1.2 主要試劑與儀器

甲醛溶液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無(wú)水乙醇、二甲苯、中性樹膠(廣州市中南化學(xué)試劑有限公司);蘇木精-伊紅染液( 廣州市秀威貿(mào)易有限公司);冰凍切片OCT 包埋劑(日本櫻花);冷凍切片機(jī)(Leica,CM1950);麥克奧迪切片掃描系統(tǒng)(麥克奧迪, EasyScan1SE ); 倒 置 顯微 鏡( 蔡司, Axio VertA1);脈動(dòng)真空滅菌器( 山東新華醫(yī)療器械,XG1.DTF-1.5); pH 計(jì)( 賽多利斯科學(xué)儀器, PB -10); 高精密度電子天平( 賽多利斯科學(xué)儀器,GL224I-1SCN)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦組織采集

采用頸椎脫臼法處死小鼠,然后將其浸入75%乙醇中30 s ～1 min,對(duì)小鼠體表進(jìn)行消毒,不要讓75%乙醇進(jìn)入到小鼠口鼻耳中,將小鼠置于解剖板上,四肢固定,按照解剖順序依次采集脾、肝、腎、心、肺、腦組織,去掉多余的脂肪、結(jié)締組織,切取適當(dāng)大小組織進(jìn)行包埋。

肺和心臟采集時(shí)比較特殊,先在氣管靠近頭端位置剪一斜切口,取移液槍緩慢勻速灌注200 ～400 μL 50% OCT 包埋劑,使50% OCT 包埋劑置換肺泡中的氣體;用血管夾夾住氣管,然后用剪刀沿胸腔后壁分離肺和心臟;心臟和肺分離后用干紗布在組織表面輕輕按壓,將心腔和心、肺表面的血液和組織液拭掉;分別切取適當(dāng)大小心、肺組織進(jìn)行包埋。

1.3.2 組織包埋及速凍

將OCT 包埋劑擠滿包埋模具,避免產(chǎn)生氣泡,并用記號(hào)筆在四角標(biāo)上樣品名稱;將切好的臟器切面向下垂直放入OCT 包埋劑中,按以下兩種速凍方式處理后,-80℃保存或進(jìn)行冰凍切片。

1.3.3 干冰/ 無(wú)水乙醇混合物速凍法

在塑料方盒中裝入約2 / 3 的無(wú)水乙醇,向無(wú)水乙醇中緩慢加入干冰,并攪拌使二者混合成糊狀,將塑料方盒放入裝有干冰的泡沫盒中備用;將裝有組織樣品的包埋模具漂浮放于干冰/ 無(wú)水乙醇混合物表面直至OCT 完全凝固,將完全凝固的組織先放置干冰上一段時(shí)間,使表面的無(wú)水乙醇揮發(fā)干凈,-80℃保存或進(jìn)行冰凍切片。

1.3.4 液氮速凍法

將裝有組織樣品的包埋模具直接漂浮于液氮上,直至OCT 完全凝固,-80℃保存或冰凍切片。

1.3.5 冰凍切片

提前開機(jī),根據(jù)組織種類和大小的不同,調(diào)整冷凍箱溫度和樣品頭溫度,同時(shí)將刀片、鑷子、毛刷等放入箱體內(nèi)預(yù)冷;將樣品放置在切片機(jī)箱體中30 min 以上,使樣品溫度恢復(fù)至冷室溫度;在樣品托上擠上適量OCT 包埋劑,將樣品垂直固定在樣品托上,待包埋劑完全凝固將樣品托固定在樣品架上,使正方形樣品一角垂直于刀片;先調(diào)節(jié)樣品與刀頭的位置使之恰好能接觸,再調(diào)節(jié)切片厚度15 ～18 μm 連續(xù)修片,直至樣品表面平整且暴露完全;調(diào)整切片厚度,連續(xù)切3 刀,使刀頭跟樣品相適應(yīng);放下玻璃擋板并前后調(diào)節(jié)至合適位置,使切片能夠順利平展的通過(guò)擋板通道;打開玻璃擋板,用毛刷輕輕刷展切片OCT 部分,將防脫載玻片垂直壓在切片上,收取樣品。

1.3.6 HE 染色

10%中性福爾馬林固定液固定30 s,蒸餾水洗1～2 s,蘇木精染色30 s,蒸餾水清洗10 s,溫水返藍(lán)10 s,蒸餾水洗30 s,伊紅染色1 ～3 s,蒸餾水洗1 ～2 s,80%乙醇1～2 s,95%乙醇1～2 s,無(wú)水乙醇(Ⅰ)1～2 s,無(wú)水乙醇(Ⅱ)1 ～2 s,二甲苯(Ⅰ)2 ～3 s,二甲苯(Ⅱ)2～3 s,二甲苯(Ⅲ)2～3 s,中性樹膠封固,顯微鏡觀察拍照。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 組織速凍方法的選擇

取適當(dāng)大小健康小鼠肝組織,OCT 包埋劑包埋后,分別采用干冰/ 無(wú)水乙醇混合物和液氮速凍,結(jié)果發(fā)現(xiàn),液氮速凍的組織包埋塊在切片時(shí)組織和周圍的OCT 包埋劑容易斷裂,不易形成完整切片,干冰/ 無(wú)水乙醇混合物速凍時(shí)不存在這種情況,切片效果較好。

2.2 不同組織冷凍箱溫度、樣品頭溫度和切片厚度的選擇

將采集到的小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦組織用OCT 包埋劑包埋后,采用干冰/ 無(wú)水乙醇混合物速凍,速凍后保存于-80℃,或于冷凍切片機(jī)恒溫箱中平衡1 h 左右,直接進(jìn)行冰凍切片。 在進(jìn)行不同組織冰凍切片的過(guò)程中,不斷調(diào)整冷凍箱溫度、樣品頭溫度以及切片厚度,直至切出無(wú)褶皺、無(wú)刀痕、無(wú)破損的較高質(zhì)量的切片。

通過(guò)對(duì)不同組織冰凍切片所需冷凍箱溫度、樣品頭溫度以及切片厚度進(jìn)行調(diào)整,最終確定各臟器組織切片時(shí)最佳的冷凍箱溫度、樣品頭溫度及切片厚度(見表1)。 在這樣的條件下切出來(lái)的切片無(wú)褶皺、無(wú)刀痕、無(wú)破損、質(zhì)量較高,但該結(jié)果僅供同型號(hào)的冰凍切片機(jī)參考,該條件不是固定不變的,仍需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

2.3 冰凍切片HE 染色結(jié)果

在以上方法和技巧基礎(chǔ)之上,按照1.3.6 所述HE 染色條件進(jìn)行小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦組織冰凍切片的HE 染色,結(jié)果切片無(wú)褶皺、無(wú)刀痕、無(wú)破損,鏡下組織無(wú)過(guò)多冰晶,細(xì)胞形態(tài)清晰,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)顏色分明,染色良好(見圖1)。

3 討論

在藥物非臨床研究中冰凍切片后續(xù)需要進(jìn)行多種不同的分析,對(duì)切片質(zhì)量要求更高,這也是藥物非臨床研究中對(duì)病理技術(shù)人員的一大挑戰(zhàn)。 現(xiàn)有關(guān)于冰凍切片制作的文獻(xiàn)資料更多地是針對(duì)術(shù)中標(biāo)本的,關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠組織的冰凍切片制備方法報(bào)道相對(duì)較少[7], 而且影響冰凍切片質(zhì)量的因素較多,筆者通過(guò)自身的實(shí)踐,摸索出一些提高冰凍切片質(zhì)量的有效方法,現(xiàn)進(jìn)行以下討論。

3.1 包埋方法對(duì)切片效果的影響

目前,常用的包埋方法有直接包埋[8-9]、模具包埋[10]、浸透包埋[11]等。 黃小雨等[12]通過(guò)對(duì)常用的3 種包埋方法進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn),直接用OCT 包埋比較快捷,但是在切片時(shí)需要將組織周圍的OCT 包埋劑形狀進(jìn)行不斷修整,否則容易卷片;浸透包埋法不僅消耗OCT 較多,相對(duì)耗時(shí),而且在復(fù)水不充分的情況下容易出現(xiàn)背景過(guò)高的現(xiàn)象;而模具包埋時(shí)組織周圍的OCT 包埋劑形狀較規(guī)則,切片時(shí)不容易出現(xiàn)褶皺,同時(shí)能有效降低成本和節(jié)約時(shí)間,此外,該方法特別適用于一次大量取材、分次切片的情況,可以將組織和包埋模具一起保存。 本實(shí)驗(yàn)同樣采用的是模具包埋法進(jìn)行組織包埋,但是模具選用的是商品化的一次性冰凍切片包埋模具,相比于黃小雨等人使用的鋁箔紙?jiān)跇悠沸畔?biāo)記、樣品保存等方面更方便實(shí)用。

表1 不同組織冰凍切片的最佳冷凍箱溫度、樣品頭溫度及切片厚度Table 1 Optimum freezing chamber temperature, sample head temperature and slice thickness of frozen sections of different tissues

圖1 小鼠不同組織冰凍切片HE 染色結(jié)果Figure 1 The HE staining results of mice different tissues sections

3.2 組織速凍方法對(duì)切片效果的影響

組織速凍方法是影響冰凍切片效果的關(guān)鍵因素,不同的速凍方法對(duì)組織內(nèi)冰晶的形成影響不一。 因?yàn)榻M織在-1 ～-5℃溫度范圍內(nèi)會(huì)有80%的水分被凍結(jié),細(xì)胞液會(huì)形成冰晶,該溫度范圍稱為最大冰晶生成帶。 凍結(jié)速率不同,通過(guò)最大冰晶生成帶的時(shí)間是不同的,在速凍的過(guò)程中,組織內(nèi)會(huì)迅速形成大量的晶核,通過(guò)最大冰晶形成帶的時(shí)間短,晶核生長(zhǎng)的時(shí)間短,進(jìn)而形成小而均勻的冰晶,對(duì)細(xì)胞和組織破壞較小;相反,在緩凍的情況下,組織內(nèi)形成的晶核較少,通過(guò)最大冰晶形成帶的時(shí)間長(zhǎng),晶核生長(zhǎng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),就會(huì)形成較大的冰晶,對(duì)細(xì)胞和組織造成較大的破壞[13]。 此外,梯度降溫和組織表面與內(nèi)部同時(shí)降溫對(duì)減少冰晶形成有著至關(guān)重要的作用[14]。 因此,速凍方法選擇合適的話可以大大避免組織內(nèi)冰晶的形成,從而保證了組織和細(xì)胞形態(tài)的清晰性和完整性。

組織速凍方法很多,科學(xué)研究中常見的有液氮速凍、液氮/ 異戊烷法速凍、干冰/ 無(wú)水乙醇混合物速凍等。 (1) 液氮速凍:將包埋后的組織直接浸入液氮速凍,該方法很容易造成過(guò)度冷凍,導(dǎo)致組織發(fā)脆甚至凍裂,對(duì)于初學(xué)者來(lái)說(shuō)有一定難度。 此外,使用液氮作為直接冷凍的冷凍劑,可能會(huì)造成白化等安全事故,因此從可操作性、技術(shù)和管理成本、安全性等因素考慮不推薦使用。 (2)液氮/ 異戊烷法速凍:先將異戊烷用液氮預(yù)冷,再將包埋后的組織放入預(yù)冷的異戊烷中速凍[15],該方法在速凍的時(shí)候組織周圍產(chǎn)生的氣泡較少,冷凍劑可以充分接觸組織,達(dá)到較好的速凍效果。 (3)干冰/ 無(wú)水乙醇混合物速凍:無(wú)水乙醇置于干冰中提前預(yù)冷,將干冰緩慢加入到無(wú)水乙醇至形成粘稠狀液體,再將包埋后的組織放入干冰/ 無(wú)水乙醇混合物中速凍,在保持低溫的同時(shí)能夠與組織充分接觸,有很好的速凍效果。 該方法與液氮/ 異戊烷法速凍方法相比,安全性較高,易操作,但該方法適用于較小體積的組織,組織體積大的推薦采用液氮/ 異戊烷法速凍。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)小鼠組織采用的是干冰/ 無(wú)水乙醇混合物速凍法,結(jié)果切片無(wú)褶皺、無(wú)刀痕、無(wú)破損,鏡下組織無(wú)過(guò)多冰晶,細(xì)胞形態(tài)清晰,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)顏色分明,染色良好(見3.3)。

3.3 切片溫度對(duì)切片效果的影響

切片溫度是冰凍切片過(guò)程中最為關(guān)鍵的部分,在進(jìn)行冰凍切片時(shí)根據(jù)不同組織不同情況調(diào)節(jié)冷凍箱溫度和樣品頭溫度以達(dá)到最佳的冰凍切片溫度。 由于小鼠不同部位的組織性質(zhì)不同,最佳的冰凍切片溫度(optimun cutting temperature,OCT) 也會(huì)有所不同,切片時(shí)組織在與刀刃接觸時(shí),由于摩擦使組織局部溫度升高發(fā)生局部融化,接著組織切片在冷凍箱被再次迅速冷凍,這中間的溫度變化是冰凍切片產(chǎn)生皺褶和斷裂的原因,同時(shí)切片的軟硬和厚薄也會(huì)對(duì)皺褶產(chǎn)生進(jìn)一步的影響。 因此,想要獲得高質(zhì)量的冰凍組織切片,冷凍箱、刀刃、組織包埋塊、OCT 包埋劑之間的溫度須平衡在最佳冰凍切片溫度附近。 如果溫度過(guò)低組織韌性會(huì)變小,變脆,切片時(shí)容易碎裂,可微調(diào)冷凍箱溫度和樣品頭溫度,稍等片刻再行切片,也可用手輕撫組織以便組織復(fù)溫;溫度過(guò)高會(huì)造成組織硬度不夠,切片會(huì)出現(xiàn)堆疊、厚薄不均、搓板狀現(xiàn)象,不易成片。

3.4 切片厚度對(duì)切片效果的影響

切片厚度也是影響切片效果的因素之一,如果切片太薄,就會(huì)造成切片容易破碎,不易成片;反之,切片太厚其斷面就會(huì)有多層細(xì)胞層疊,影響組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)的觀察。 經(jīng)過(guò)對(duì)小鼠不同組織進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn),小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦組織切片厚度約為6 ～8 μm,切片效果較好,鏡下觀察無(wú)褶皺、厚薄均勻、細(xì)胞形態(tài)較清晰。

綜上所述,在制作冰凍切片時(shí),我們應(yīng)該從取材、包埋、速凍、溫度選擇、恒溫冷凍切片等各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格控制,但是,不同組織根據(jù)自身特點(diǎn)會(huì)存在差異,應(yīng)區(qū)別對(duì)待。 此外,在掌握關(guān)鍵性技術(shù)要點(diǎn)的同時(shí)還應(yīng)該具有高度的責(zé)任心和耐心,制作出高質(zhì)量的冰凍切片,才能更好地服務(wù)于單抗藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)工作。