孫亞蘭,呂琪卉,楊海博,胡鎮(zhèn)杰,李定旭,董鈞鋒

(河南科技大學(xué)林學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471023)

昆蟲通過嗅覺感受器(olfactory sensilla)感受外界環(huán)境中的揮發(fā)性化合物。嗅覺感受器壁與嗅覺受體神經(jīng)元(olfactory receptor neurons,OSNs)樹突間有極性淋巴液，其中充斥著大量的氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)。氣味分子進(jìn)入嗅覺感受器后需要穿過極性淋巴液屏障到達(dá)嗅覺神經(jīng)元樹突并最終激活嗅覺受體(odorant receptors,ORs)。在此過程中，OBPs起到了初步識(shí)別并運(yùn)輸氣味化合物的作用(王桂榮等,2002;修偉明等,2005;Pelosietal.,2006;Leal,2013)。

昆蟲中第一個(gè)被鑒定出來的氣味結(jié)合蛋白來自多音天蠶Antheraeapolyphemus(Vogt and Riddiford,1981)。研究者以氚[H3]標(biāo)記的多音天蠶性信息素(反，順)-6,11-乙酸十六烷基酯[(E,Z)-6,11-hexadecadienyl acetate]作為探針，放射性分析發(fā)現(xiàn)，此信息素與一種蛋白結(jié)合，將其命名為信息素結(jié)合蛋白(pheromone binding protein,PBP)。隨著分子克隆技術(shù)以及高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在隨后的近40年中，氣味結(jié)合蛋白在多種昆蟲中被鑒定出來，包括舞毒蛾Lymantriadispar(Vogtetal.,1989)、家蠶Bombyxmori(Kriegeretal.,1996)、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Galindo and Smith,2001;Graham and Davies,2002)、岡比亞按蚊Anophelesgambiae(Vogt,2002;Xuetal.,2003)、煙草天蛾Manducasexta(Vogtetal.,2002)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Wangetal.,2004;Liuetal.,2012;Sunetal.,2012)和大蠟螟Galleriamellonella(Zhaoetal.,2019)等。

一般來說，昆蟲OBPs含有6個(gè)半胱氨酸(cysteine,Cys/C)殘基，這些半胱氨酸殘基的位置在昆蟲各目中較保守。隨著越來越多的OBPs被報(bào)道，研究者發(fā)現(xiàn)一些OBPs中的半胱氨酸殘基位置及數(shù)目并不完全一致，并將昆蟲OBPs分為4種類型(Zhouetal.,2004;Pelosietal.,2006)：含有6個(gè)半胱氨酸殘基，分子量約為14 kD的經(jīng)典氣味結(jié)合蛋白(classical OBPs)；含有4個(gè)半胱氨酸殘基，分子量約為14 kD的minus-C OBPs；含有多于6個(gè)半胱氨酸殘基，分子量約為17～25 kD的Plus-C OBPs，以及含有多于6個(gè)半胱氨酸殘基，且分子量>35 kD的非典型氣味結(jié)合蛋白(atypical OBPs)。在黑腹果蠅體內(nèi)，共發(fā)現(xiàn)51個(gè)OBPs基因(Graham and Davies,2002;Vogtetal.,2002)，其中39個(gè)經(jīng)典OBPs具有6個(gè)半胱氨酸殘基。在岡比亞按蚊基因組中，共有37個(gè)經(jīng)典OBPs和35個(gè)Plus-C OBPs(Xuetal.,2003;Zhouetal.,2004)。研究者對(duì)棉鈴蟲觸角轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，所鑒定到的26個(gè)OBPs中共包括3個(gè)Plus-C OBPs(Liuetal.,2012)。

近20年來，熒光結(jié)合分析法(fluorescence binding assay)被廣泛應(yīng)用在檢測(cè)OBPs的氣味化合物配體結(jié)合特性實(shí)驗(yàn)中(Campanaccietal.,2003)。通過大腸桿菌Escherichiacoli表達(dá)重組氣味結(jié)合蛋白，多種昆蟲OBPs的氣味化合物結(jié)合特性得到了解析。例如：熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小菜蛾P(guān)lutellaxylostella氣味結(jié)合蛋白PxylOBP31與醛、酮、萜品油烯以及鄰苯二甲酸二異丁酯相結(jié)合(覃江梅等,2016)。中紅側(cè)溝繭蜂Microplitismediator氣味結(jié)合蛋白MmedOBP18對(duì)多種低揮發(fā)性植物氣味化合物如2-十三酮等有較強(qiáng)的結(jié)合能力(宋玄等,2019)。二化螟Chilosuppressalis的一個(gè)minus-C OBP(CsupOBP1)與β-紫羅蘭酮的結(jié)合能力最強(qiáng)(魏丹等,2013)。但總體來說，現(xiàn)有的氣味化合物結(jié)合特性研究仍以經(jīng)典OBPs為主，而其他類型的OBPs，例如Plus-C OBPs，有待更進(jìn)一步發(fā)掘其生物學(xué)功能。

疆夜蛾P(guān)eridromasaucia又名絳色地老虎，是一種間歇性暴發(fā)為害的世界性農(nóng)業(yè)害蟲。疆夜蛾的寄主植物超過121種，包括煙草、玉米、馬鈴薯、高粱等(Ringsetal.,1976)。此害蟲長(zhǎng)期在北美和歐洲肆虐為害，20世紀(jì)70年代起作為入侵害蟲在日本和韓國(guó)開始蔓延并逐漸成為重要的農(nóng)業(yè)害蟲(Strubleetal.,1976;Simonetetal.,1981;Willsonetal.,1981;Inomataetal.,2002;Choietal.,2009)。在我國(guó)，疆夜蛾最初暴發(fā)于云南省和四川省(曠昌熾,1985)。隨后20多年中，此害蟲在多個(gè)省份中均有分布報(bào)道(嚴(yán)乃勝等,2000;李密等,2007;郭敏等,2010;宣善濱等,2012)。2015年疆夜蛾在河南省洛陽(yáng)市周邊縣區(qū)大豆田暴發(fā)為害，僅欒川縣受害面積已超過6 000 hm2，其中受害嚴(yán)重的大豆田減產(chǎn)30%～60%(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期工作中疆夜蛾成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)的一個(gè)Plus-C OBP(PsauOBP7)為研究對(duì)象，原核表達(dá)PsauOBP7重組蛋白；利用qRT-PCR和蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)PsauOBP7在疆夜蛾成蟲不同組織及不同齡期幼蟲頭部的表達(dá)情況；最后通過熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析了PsauOBP7對(duì)植物氣味化合物以及疆夜蛾性信息素組分的結(jié)合能力，以期了解PsauOBP7在疆夜蛾嗅覺感受過程中的作用，同時(shí)為鱗翅目非經(jīng)典氣味結(jié)合蛋白的研究方法及功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

疆夜蛾幼蟲采自河南省洛陽(yáng)市郊區(qū)農(nóng)田中，采回后在人工氣候箱飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：25±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期16L∶8D?；己髤^(qū)分性別，羽化后的成蟲飼以10%的蜂蜜水。將羽化后的疆夜蛾放入交配籠中交配產(chǎn)卵，幼蟲孵化后飼以人工飼料(主要配料為大豆粉和麥胚粉)。

1.2 PsauOBP7的克隆

選取羽化后3-4 d的疆夜蛾雌、雄成蟲各40頭，分別剪取其觸角、口器、足和翅。采用Trizol法(Invitrogen,Carlsbad,美國(guó))提取各組織總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄法把各組織中提取的總RNA合成cDNA:0.5 μg oligo-dT與1 μg總RNA混合均勻，隨后的合成體系:dNTPs (10 mmol/L) 1.25 μL,反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RT,TaKaRa,大連) 1.25 μL,M-MLV 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液5 μL,混合均勻后加無RNA酶去離子水至25 μL,37℃保溫60 min。合成的cDNA直接用于PCR反應(yīng)。

根據(jù)本研究組前期工作中獲得的疆夜蛾觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，依據(jù)候選PsauOBP7序列(GenBank登錄號(hào):MN686214)，利用Primer Premier 6設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)克隆引物(正向引物序列:5′-ATGAAAACGTT TCTTGTGTTG-3′;反向引物序列:5′-TCACTGG TGACAAAACCGGTT-3′)和qRT-PCR引物(正向引物序列:5′-CGAAGAAGAGAATAGCAATTTG-3′；反向引物序列：5′-CCGAATGTAGTTCGACGCTCC-3′)。選擇PsauActin作為內(nèi)參基因，正向引物序列:5′-TCATCACCATCGGAAACGAAC-3′;反向引物序列:5′-GCGTACAAGTCCTTACGGAT-3′。

克隆PsauOBP7全長(zhǎng)基因的PCR反應(yīng)體系:LA Taq DNA聚合酶1 μL(TaKaRa,大連)，dNTPs (10 mmol/L) 1 μL;LA Taq DNA聚合酶緩沖液2.5 μL,雌蛾觸角cDNA 0.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，混勻后加去離子水至25 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃ 30 s,55℃ 1 min,72℃ 40 s,35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。將所獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM(Promega,Fitchburg,美國(guó))載體中，后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，并將適量菌液涂到含有氨芐霉素的LB平板上。陽(yáng)性菌斑在含有氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h后測(cè)序驗(yàn)證(生工生物工程上海股份有限公司)。

1.3 PsauOBP7的序列分析

通過ExPASy-ProtParam在線預(yù)測(cè)PsauOBP7的分子量及等電點(diǎn)，利用SWISS-MODEL在線模擬PsauOBP7的三維結(jié)構(gòu)(Waterhouseetal.,2018)，蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配的最佳三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模板為多音天蠶PBP(Zubkovetal.,2005)。

1.4 PsauOBP7在疆夜蛾成蟲中的組織表達(dá)譜qRT-PCR分析

以1.2節(jié)獲得的各組織cDNA為模版，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增PsauOBP7基因和PsauActin基因，每個(gè)組織樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)(每次生物學(xué)重復(fù)來自至少40頭疆夜蛾)和3次技術(shù)重復(fù)。qPCR反應(yīng)體系(25 μL):cDNA 0.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,Premix Taq酶12.5 μL(TaKaRa,大連),H2O 10 μL。反應(yīng)程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s,60℃ 1 min,72℃ 30 s,44個(gè)循環(huán)。

1.5 PsauOBP7的原核表達(dá)及純化

以去掉信號(hào)肽的PsauOBP7起始端和末端6個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，同時(shí)加上酶切位點(diǎn)(上游酶切位點(diǎn):NdeI;下游酶切位點(diǎn):EcoRI)，用于蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)(正向引物序列:5′-CATATGGAGTTCGTCTCACCCTTC-3′;反向引物序列:5′-GAATTCTCACTGGTGACAAAACCG-3′)(斜體處為酶切位點(diǎn))。反應(yīng)體系:LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa,大連)1 μL,dNTPs (10 mmol/L) 1 μL,LA Taq DNA聚合酶緩沖液2.5 μL,cDNA 0.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,混勻后加去離子水至25 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃ 30 s,55℃ 1 min,72℃ 40 s,35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。所獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM(Promega,Fitchburg,美國(guó))載體中，后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，之后將菌液涂到含氨芐霉素的LB平板上。陽(yáng)性菌斑在液體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h后測(cè)序(生工生物工程上海股份有限公司)。將測(cè)序正確的陽(yáng)性菌斑提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ及NdeⅠ雙酶切后連入pET-30b載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)2 h后將菌液涂到LB卡那霉素平板上，陽(yáng)性菌斑在液體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h后提取質(zhì)粒，電泳檢測(cè)后用于下一步表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

為了表達(dá)PsauOBP7重組蛋白，將含有成熟蛋白序列的pET-30b載體轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)細(xì)胞，在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待OD值0.6～0.8時(shí)以體積比為1 000∶1加入0.4 mol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)2 h后離心菌液，收集細(xì)胞。將細(xì)胞超聲破碎后高速離心，SDS-PAGE檢測(cè)重組PsauOBP7蛋白表達(dá)于包涵體沉淀中。將回收的包涵體沉淀加入10 mL 8 mol/L尿素及100 μL 1 mol/L DTT(50 mmol/L,pH 7.4的Tris-HCl緩沖液為溶解液)徹底混勻，將上述溶液倒入透析袋中，并將透析袋放入50 mmol/L Tris-HCl(2 L,pH 7.4)緩沖液中進(jìn)行透析復(fù)性。所獲得的蛋白溶液用DE-52(Whatman,Salt Lake City,美國(guó))和QFF離子交換柱進(jìn)行純化，純化后的PsauOBP7重組蛋白用于制造多克隆抗體或熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

1.6 PsauOBP7在疆夜蛾成蟲各組織中表達(dá)的Western blot檢測(cè)

anti-PsauOBP7兔血清多克隆抗體由生工生物工程(上海)有限公司制作。剪取暴食期(4-6齡)幼蟲頭部以及羽化后3-4 d的疆夜蛾雌、雄成蟲觸角、口器、足和翅，用400～800 μL(視每種組織樣品多少)0.1%的三氟乙酸將各樣品充分研磨。4℃ 12 000 r/min，離心20 min后留上清。上清溶液進(jìn)一步超聲破碎，之后4℃ 12 000 r/min，離心30 min，上清液即為蛋白粗提物。各組織蛋白粗提物在15% SDS-PAGE變性膠上分離后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。同時(shí)，將與上述等量的各組織蛋白粗提物轉(zhuǎn)入硝酸纖維膜上(Kyhse-Andersen,1984)。轉(zhuǎn)膜后的蛋白經(jīng)抗體孵育后，利用氯萘酚和雙氧水顯色。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)來自至少5頭幼蟲或20頭成蟲。

1.7 熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)

根據(jù)疆夜蛾所取食的寄主植物種類以及雌蛾性信息素組分的報(bào)道(Ringsetal.,1976;Choietal.,2009)，我們選擇來自疆夜蛾寄主植物氣味、蜜源植物氣味及雌蛾性信息素組分等共39種化合物(表1)進(jìn)行熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)(Knudsen and Tollsten,1993;Loughrinetal.,1995;Yanetal.,2005;Yan and Wang 2006;Choietal.,2009)。實(shí)驗(yàn)所用儀器為Hitachi F-4500，激發(fā)波長(zhǎng)為337 nm，所檢測(cè)的發(fā)射光譜范圍為380～450 nm。實(shí)驗(yàn)中所用PsauOBP7重組蛋白溶解于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)至濃度為2 μmol/L，利用濃度為1 mmol/L的1-NPN滴定蛋白質(zhì)溶液，至1-NPN終濃度為16 μmol/L，記錄與蛋白的結(jié)合值，重復(fù)3次。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)：逐次加入1 mmol/L競(jìng)爭(zhēng)性氣味化合物配體，至終濃度為6～16 μmol/L。競(jìng)爭(zhēng)性配體的解離常數(shù)Scatchard方程計(jì)算公式為：Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)2-ΔΔCT法(Schmittgen and Livak,2008)計(jì)算PsauOBP7基因在各組織中的相對(duì)表達(dá)量，通過GraphPad Prism7軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA,Tukey氏多重比較)并繪制柱形圖。

2 結(jié)果

2.1 PsauOBP7基因的克隆及序列分析

通過RT-PCR的方法，在疆夜蛾觸角中克隆得到PsauOBP7的cDNA序列。PsauOBP7共有190個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為21.69 kD，等電點(diǎn)為5.06。PsauOBP7共有8個(gè)半胱氨酸殘基，其羧基端比經(jīng)典OBPs多兩個(gè)半胱氨酸殘基。在線構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，PsauOBP7特有的2個(gè)半胱氨酸殘基位于羧基端的最后一個(gè)α螺旋末端，并不參與PsauOBP7結(jié)合腔的組成(圖1)。

圖1 疆夜蛾P(guān)sauOBP7氨基酸序列(A)以及模擬的三維結(jié)構(gòu)(B)Fig.1 Amino acid sequence (A) and three-dimensional modeling (B) of PsauOBP7 of Peridroma sauciaA圖中黃色標(biāo)注部分為經(jīng)典的6個(gè)半胱氨酸殘基，紅色標(biāo)注部分為PsauOBP7特有的2個(gè)半胱氨酸殘基。B圖中，藍(lán)色箭頭指向其羧基端特有的2個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基。Six typical cysteine residues are highlighted in yellow,and cysteine residues specific to PsauOBP7 are highlighted in red in figure A.The blue arrows in figure B indicate two cysteine residues specific to the carboryl terminus of PsauOBP7.

2.2 PsauOBP7在疆夜蛾成蟲中的組織表達(dá)譜

通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，PsauOBP7表達(dá)于疆夜蛾雌蛾和雄蛾的觸角、口器、足和翅中。除了在雄蛾觸角中的表達(dá)量顯著高于雌蛾翅(P=0.026)和雄蛾翅(P=0.032)中的外，其在所檢測(cè)的其他組織中的表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)PsauOBP7在疆夜蛾成蟲不同組織中的表達(dá)量Fig.2 Expression levels of PsauOBP7 in different tissues of Peridroma saucia adults detected by qRT-PCR圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；柱上不同字母表示基因表達(dá)量在不同組織間存在顯著差異(P<0.05,one-way ANOVA方差分析,Tukey氏多重比較)。Data in the figure are mean±SD.Different letters above bars indicate significant different in the gene expression level among different tissues (P<0.05,one-way ANOVA analysis,Tukey’s multiple comparison test).

2.3 PsauOBP7的重組表達(dá)及純化

PsauOBP7表達(dá)于原核細(xì)胞超聲破碎后的包涵體沉淀中，分子量大約為21 kD，通過離子交換柱純化后的PsauOBP7重組蛋白濃度約為0.3 mg/mL(圖3)。

圖3 疆夜蛾P(guān)sauOBP7重組蛋白的表達(dá)與純化Fig.3 Expression and purification of the recombinant PsauOBP7 of Peridroma sauciaM:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Protein molecular weight marker;1:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌Escherichia coli after induction with IPTG;2:未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌 E.coli before induction with IPTG;3:超聲破碎后的沉淀Pellets of E.coli after sonication;4:超聲破碎后的上清液Supernatant of E.coli after sonication;5:純化后的重組蛋白PsauOBP7 Recombinant protein PsauOBP7 after purification.箭頭示目的蛋白。The target protein is indicated by an arrow.

2.4 PsauOBP7在疆夜蛾成蟲不同化學(xué)感受器官中的表達(dá)

純化后的PsauOBP7重組蛋白能與anti-PsauOBP7多克隆抗體特異結(jié)合并顯色，表明anti-PsauOBP7多克隆抗體能滿足后續(xù)的Western blot檢測(cè)(圖4)。

圖4 純化后的疆夜蛾重組蛋白PsauOBP7的SDS-PAGE (A)和Western blot檢測(cè)(B)Fig.4 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of the purified recombinant protein PsauOBP7 of Peridroma saucia

通過對(duì)疆夜蛾雌蛾和雄蛾的觸角、口器、足和翅的蛋白粗提物進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PsauOBP7均表達(dá)于這些組織中，且在不同組織和不同性別間的表達(dá)量相近(圖5)。

圖5 SDS-PAGE (A)和Western blot (B)分析PsauOBP7在疆夜蛾成蟲不同組織中的表達(dá)Fig.5 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of PsauOBP7 expression in different tissues of Peridroma saucia adultM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker.FA:雌蛾觸角Female antennae;MA:雄蛾觸角Male antennae;FM:雌蛾口器Female mouthpart;MM:雄蛾口器Male mouthpart;FL:雌蛾足Female leg;ML:雄蛾足Male leg;FW:雌蛾翅Female wing;MW:雄蛾翅Male wing.紅色框部分為PsauOBP7在不同組織中的顯色條帶。Red box indicates the colored bands of PsauOBP7 in different tissues.

2.5 PsauOBP7在疆夜蛾幼蟲頭部中的表達(dá)

PsauOBP7在疆夜蛾4-6齡幼蟲頭部均有分布，且表達(dá)量相近(圖6)。

圖6 SDS-PAGE (A)和Western blot (B)分析PsauOBP7在不同齡期疆夜蛾幼蟲頭部的表達(dá)Fig.6 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of PsauOBP7 in heads of different instar larvae of Peridroma sauciaM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker.4th:4齡幼蟲4th instar larva;5th:5齡幼蟲5th instar larva;6th:6齡幼蟲6th instar larva.紅色框住部分為PsauOBP7在不同齡期幼蟲頭部組織中的顯色條帶。Red box indicates the colored bands of PsauOBP7 in heads of different instar larvae.

2.6 熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析重組蛋白PsauOBP7的配體結(jié)合特性

1-NPN與PsauOBP7重組蛋白的解離常數(shù)為3.79 μmol/L (圖7)。熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，PsauOBP7重組蛋白與反-2-己烯醛的結(jié)合能力最強(qiáng)，Ki值為1.4 μmol/L。此外，PsauOBP7與乙酸月桂酯、順-3-己烯乙酸酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸己酯和肉桂酸甲酯這5種酯類化合物有一定的結(jié)合能力，Ki值分別為5.7,6.5,8.9,9.5和10.2 μmol/L。兩種醇類化合物順-3-己烯-1-醇(Ki=5.8 μmol/L)和法尼醇(Ki=5.9 μmol/L)也與PsauOBP7有較強(qiáng)的結(jié)合能力(表1)。

表1 PsauOBP7與候選氣味化合物的結(jié)合能力Table 1 Binding capability of PsauOBP7 to candidate odorants

圖7 1-NPN和疆夜蛾重組蛋白PsauOBP7的結(jié)合曲線及Scatchard方程Fig.7 Binding curve and Scatchard plot of 1-NPN to the recombinant protein PsauOBP7 of Peridroma saucia

3 討論

昆蟲經(jīng)典的氣味結(jié)合蛋白有6個(gè)半胱氨酸殘基，在固定位置形成二硫鍵(C1-C3,C2-C5,C4-C6)(Lealetal.,1999;Braidetal.,2001)。本研究中的疆夜蛾P(guān)sauOBP7有8個(gè)半胱氨酸殘基，分子量約為21 kD，屬于Plus-C OBPs亞家族中的一員。序列分析以及三維結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明，與經(jīng)典氣味結(jié)合蛋白相比，PsauOBP7羧基端多出的30多個(gè)氨基酸(包括2個(gè)半胱氨酸殘基)位于結(jié)合腔外。根據(jù)鱗翅目昆蟲氣味結(jié)合蛋白釋放氣味化合物的分子機(jī)制(Lealetal.,1999,2005;Xu and Leal,2008;Xuetal.,2011)，我們推測(cè)，PsauOBP7在中性的感受器淋巴液中運(yùn)輸氣味分子，到達(dá)pH值較低的嗅覺受體神經(jīng)元樹突膜附近后，其三維構(gòu)象發(fā)生改變，羧基末端的氨基酸伸入結(jié)合腔中，促使蛋白將氣味分子釋放出來。

一般來說，OBPs表達(dá)于觸角感受器的淋巴液中。在早期的研究中，識(shí)別鱗翅目昆蟲氣味結(jié)合蛋白的一個(gè)主要依據(jù)就是該蛋白專一表達(dá)于觸角中(Pelosi and Maida,1995)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)多數(shù)OBPs表達(dá)于不止一種組織中，除觸角外，還包括下顎須、喙、足、翅等嗅覺或味覺器官中(Guoetal.,2012;Leal,2013)。在本研究中，我們通過qRT-PCR以及Western blot的方法，發(fā)現(xiàn)PsauOBP7表達(dá)于疆夜蛾成蟲多種化學(xué)感受器官中，包括雌蛾和雄蛾的觸角、口器、足和翅(圖2和5)，說明PsauOBP7不僅參與了疆夜蛾的嗅覺感受過程，也可能結(jié)合味覺信息化合物，參與味覺感受過程。此外，我們還發(fā)現(xiàn)PsauOBP7表達(dá)于疆夜蛾4,5及6齡幼蟲頭部(圖6)，說明PsauOBP7可能與幼蟲的嗅覺或味覺識(shí)別功能有關(guān)，在疆夜蛾幼蟲對(duì)寄主植物的識(shí)別過程中發(fā)揮作用。

續(xù)表1 Table 1 continued

在隨后的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，我們共檢測(cè)了包括酯類、醛類、醇類以及疆夜蛾信息素組分等39種氣味化合物，結(jié)果表明PsauOBP7重組蛋白與3種化合物反-2-己烯醛、順-3-己烯-1-醇和順-3-己烯乙酸酯有較強(qiáng)的結(jié)合能力(表1)。作為綠葉氣味物質(zhì)(green leaf volatiles,GLVs)，這3種化合物在玉米、棉花和煙草等多種植物中釋放(Loughrinetal.,1995;Yanetal.,2005;Yan and Wang,2006)，說明PsauOBP7在疆夜蛾識(shí)別寄主植物過程中起到重要作用。同時(shí)，PsauOBP7與酯類化合物，包括乙酸月桂酯、苯甲酸己酯、肉桂酸甲酯、乙酸苯乙酯有一定的結(jié)合力(表1)。已知開花植物的花朵或被害蟲取食后的植物枝葉中均可釋放此類氣味化合物(Knudsen and Tollsten,1993;R?se and Tumlinson,2004)，推測(cè)疆夜蛾成蟲可通過PsauOBP7感受此類化合物從而尋找合適的產(chǎn)卵或蜜源地，而幼蟲可由此尋找合適的寄主植物。此外，PsauOBP7還可結(jié)合法尼醇，這種化合物低揮發(fā)性的特點(diǎn)暗示其可能在疆夜蛾近距離識(shí)別寄主植物過程中起重要作用。

此外，鑒于PsauOBP7廣泛表達(dá)于本研究中所檢測(cè)的幼蟲頭部和成蟲的多種化學(xué)感受器官中，一方面說明PsauOBP7的功能具有多樣性，也可能說明PsauOBP7功能很保守，不同組織都需要。因此，在今后的實(shí)驗(yàn)中，如果能檢測(cè)PsauOBP7在其他非化學(xué)感受器官的表達(dá)情況，同時(shí)廣泛篩選PsauOBP7對(duì)味覺相關(guān)的氣味化合物以及其他體內(nèi)代謝物的結(jié)合能力，會(huì)對(duì)我們更深一步了解PsauOBP7的功能提供更多的參考。

綜上所述，作為Plus-C氣味結(jié)合蛋白家族中的一員，PsauOBP7表達(dá)于疆夜蛾幼蟲和成蟲的化學(xué)感受器官中，結(jié)合多種植物氣味化合物，該研究結(jié)果對(duì)我們進(jìn)一步開展疆夜蛾幼蟲和成蟲的行為實(shí)驗(yàn)有指導(dǎo)意義。此外，本結(jié)果對(duì)我們研究其他Plus-C氣味結(jié)合蛋白的功能有一定的參考價(jià)值。