董正遠(yuǎn)，許河南，王文銳，楊清玲，陳昌杰

乳腺癌作為女性中最常見的癌癥，占女性癌癥死亡原因的第二位[1]，對女性健康造成了極大的威脅。目前乳腺癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、放療、化療及內(nèi)分泌治療等[2-5]。紫杉醇是一種從裸子植物紅豆杉的樹皮中分離的天然次生代謝產(chǎn)物，在多種癌癥中具有廣泛的活性，包括乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞肺癌[6]，但作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌一線化療藥物，仍然存在一些缺陷，如水溶性較差、生物利用度比較低以及較高的化療不良反應(yīng)等。納米藥物是使用納米微粒作為載體來搭載藥物，使藥物和納米顆粒結(jié)合而制成的藥物，相對于常規(guī)藥物具有粒徑較小、催化效率高、吸附能力較強(qiáng)、活性中心多等優(yōu)點(diǎn)。本研究分析紫杉醇長循環(huán)納米載藥膠束在乳腺癌耐藥細(xì)胞中的作用，并探討其聯(lián)合病毒巨噬細(xì)胞炎性蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)N端肽(NT21MP)的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7于中科院細(xì)胞庫購買；構(gòu)建耐藥細(xì)胞所用藥物為紫杉醇；PEG2000-DPE于艾韋特公司購買；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基于Hyclone公司購買；BAX、BCL-2、caspase3、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、snail、Slug、P-gp、BCRP、MRP抗體于Proteinteche公司購買；細(xì)胞凋亡試劑盒于Muse公司購買；細(xì)胞周期試劑盒于江蘇凱基生物公司購買；β-actin抗體于武漢博士德公司購買；維生素E-聚乙二醇琥珀酸酯1000(TPGS)于阿拉丁生化公司購買；BCA-試劑盒于碧云天生物公司購買。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用紫杉醇遞增濃度梯度誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，使MCF-7細(xì)胞處于10 μg/mL的紫杉醇濃度中穩(wěn)定生長。培養(yǎng)細(xì)胞均用含有10%的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，并在5%CO2、37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)。所有用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。當(dāng)細(xì)胞融合度至90%左右時，用0.25%的胰蛋白酶消化液消化離心并傳代。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)染色法檢測細(xì)胞增殖的活性，將對數(shù)生長期的細(xì)胞消化種在96孔板中，加藥處理24 h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入200 μL 10%的三氯乙酸(TCA)溶液固定，100 μL 0.4%的SRB溶液染色。用1%乙酸溶液反復(fù)洗滌，每孔分別加入150 μL 10 mmol/L的 Trisbase溶液，置于脫色搖床上劇烈搖動15 min。在515 nm波長下檢測吸光度。存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 檢測細(xì)胞遷移能力，收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，制備成單個細(xì)胞的混懸液，均勻的接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長至90%且細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，用10 μL無菌槍頭垂直地在6孔板內(nèi)劃兩道寬度均勻的直線，同時保證每孔內(nèi)直線的寬度一致。吸去6孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS輕柔洗滌細(xì)胞2次后，再進(jìn)行加藥處理，處理完后隨即拍照記錄0 h的直線寬度，將6孔板放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在24 h時觀察并拍照記錄直線寬度。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 檢測細(xì)胞侵襲能力，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞鋪在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時對細(xì)胞進(jìn)行處理，離心后重懸細(xì)胞。Transwell小室預(yù)先用60 μL的稀釋的Matrigel基質(zhì)膠處理好備用。向24孔板中加入600 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)基，在上室加入100 μL的細(xì)胞懸液，24 h后取出小室棄上清，用棉簽輕柔的擦去上室里未穿過的細(xì)胞。在下室中加入600 μL 4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min。瑞氏-吉姆薩染液染色后，用高倍鏡觀察細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化下來制成單細(xì)胞懸液，接種在6孔板中，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%進(jìn)行不同分組的加藥處理，繼續(xù)置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜。將細(xì)胞消化離心(1 000 r/min)5 min后棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，70%乙醇固定細(xì)胞，置于4 ℃冰箱過夜。1 000 r/min離心5 min后棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，繼續(xù)離心后棄上清。每組加入50 mg/mL碘化丙啶(PI)染液500 μL和100 μg/mL RNase A 2 μL，室溫避光染色30 min。用300目的尼龍網(wǎng)將細(xì)胞懸液過濾，上機(jī)檢測細(xì)胞周期情況。

1.2.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種在6孔板中，5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育過夜。細(xì)胞密度達(dá)到80%時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，繼續(xù)孵育24 h。用不含EDTA的胰蛋白酶將細(xì)胞消化后離心(1 000 r/min)5 min，棄清液。預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，棄清液，調(diào)整細(xì)胞密度約5×105個/毫升，取細(xì)胞懸液50 μL，加入同等體積的細(xì)胞凋亡試劑，室溫避光30 min。300目的尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.7 Western blotting實(shí)驗(yàn) 配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠，在每孔中加入25 μg的蛋白。設(shè)置恒定電壓70 V，當(dāng)?shù)鞍着艿綕饪s膠與分離膠的交界處時將電壓調(diào)至100 V，直到溴酚藍(lán)條帶跑至分離膠邊緣時，停止電泳。PVDF膜浸泡在甲醇溶液中激活；200 mA轉(zhuǎn)膜1.5～2 h。將轉(zhuǎn)膜好后的PVDF膜放于封閉液中封閉2 h。將膜浸泡在對應(yīng)的一抗中4 ℃過夜。將PVDF膜浸泡在二抗中并置于37 ℃水浴2 h，用TBS洗膜3次后加入顯影劑上機(jī)曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌耐藥細(xì)胞增殖情況 空白納米膠束載體對乳腺癌耐藥細(xì)胞株沒有明顯細(xì)胞毒性，不同濃度紫杉醇膠束組的細(xì)胞存活率均低于紫杉醇組，紫杉醇膠束聯(lián)合NT21MP組的細(xì)胞存活率更低(P<0.01)(見表1)。

表1 不同藥物對乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/PR增殖的影響

2.2 乳腺癌耐藥細(xì)胞遷移、侵襲情況 與空白納米膠束組比較，NT21MP以及紫杉醇處理組細(xì)胞的遷移、侵襲能力下降，紫杉醇納米膠束較單獨(dú)紫杉醇處理的乳腺癌耐藥細(xì)胞的遷移、侵襲能力進(jìn)一步下降(P<0.01)，且以紫杉醇納米膠束聯(lián)合多肽NT21MP作用更加明顯(P<0.01)(見圖1、表2)。

表2 不同藥物對乳腺癌耐藥細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

2.3 乳腺癌耐藥細(xì)胞凋亡、周期情況 與空白納米膠束組比較，紫杉醇和NT21MP處理組乳腺癌細(xì)胞凋亡的數(shù)量和G2/M期細(xì)胞數(shù)量增加，紫杉醇納米膠束組較紫杉醇處理組乳腺癌細(xì)胞的凋亡率和G2/M期細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加(P<0.01)，且以紫杉醇納米膠束聯(lián)合NT21MP組更為顯著(P<0.01)(見圖2、表3、表4)。

表3 不同藥物對乳腺癌耐藥細(xì)胞凋亡的影響

表4 不同藥物對乳腺癌耐藥細(xì)胞周期的影響

2.4 乳腺癌耐藥細(xì)胞的耐藥及凋亡相關(guān)蛋白情況 與紫杉醇組相比，紫杉醇納米膠束可以明顯下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)水平，并促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase3的表達(dá)上升(P<0.01);紫杉醇納米膠束聯(lián)合多肽NT21MP進(jìn)一步下調(diào)乳腺癌耐藥細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)量，增加caspase3和Bax的蛋白表達(dá)(P<0.01)；紫杉醇納米膠束對耐藥蛋白P-gp、BCRP的抑制能力強(qiáng)于紫杉醇，且以紫杉醇納米膠束聯(lián)合NT21MP作用更顯著(P<0.01)(見圖3、表5)。

表5 不同藥物對乳腺癌耐藥細(xì)胞的耐藥及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 乳腺癌耐藥細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與紫杉醇組比較，紫杉醇納米膠束組EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，Vimentin、Slug蛋白表達(dá)水平下調(diào)，且以紫杉醇納米膠束聯(lián)合NT21MP作用更顯著(P<0.01)(見圖4、表6)。

表6 不同藥物對乳腺癌耐藥細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

紫杉醇在臨床上是治療乳腺癌和卵巢癌的一線藥物，雖然效果顯著，但其難溶于水，且藥物利用率較低[7-10]。隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，納米技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。納米藥物是使用納米微粒作為載體搭載藥物，使藥物和納米顆粒結(jié)合而制成的藥物。與常規(guī)藥物相比，納米材料搭載的藥物具有提高藥物的效率、穩(wěn)定性，增強(qiáng)藥物的靶向作用、溶解度以及藥物控釋等優(yōu)點(diǎn)。由于納米載體修飾藥物方式的多樣化，使藥劑型具有更大的發(fā)展空間和巨大潛能。

PEG2000-DSPE載藥膠束是一種高分子化合物，膠束粒徑均一，能夠增加細(xì)胞攝取，且具有抗腫瘤活性，對正常組織毒性作用較小。同時PEG2000-DSPE載藥膠束制劑實(shí)現(xiàn)了靶向、緩釋給藥，延長了血循環(huán)時間，還可以提高化療藥物溶解性和藥效，保護(hù)藥物免于降解[11]。因此，PEG2000-DSPE納米膠束常被應(yīng)用于難溶或不溶性藥物的增溶劑，是一種良好的抗腫瘤藥物納米膠束載體。TPGS是一種新型生物材料，在抗多重耐藥和促進(jìn)藥物吸收方面具有重要作用[12]。TPGS作為一種非離子表面活性劑，具有乳化藥物、生物相容性和穩(wěn)定的理化性質(zhì)，因此TPGS可作為一種輔助穩(wěn)定劑，使藥物的性質(zhì)更加穩(wěn)定[13]。甲氨蝶呤與金-白蛋白納米粒子結(jié)合后，使甲氨蝶呤的穩(wěn)定性更好,對乳腺癌細(xì)胞的殺傷能力更強(qiáng)[14]。納米脂質(zhì)體搭載阿霉素后大大地降低了藥物的心臟毒性，并且能提高阿霉素對腫瘤細(xì)胞的抑制作用[15]。PEG-DSPE搭載吉西他濱，增加了小鼠多種免疫細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)吉西他濱治療膽管癌的效果[16]?；赥PGS的抗腫瘤藥物納米制劑具有更好的抗腫瘤效果，循環(huán)時間長以及生物利用度高，設(shè)計(jì)了基于TPGS修飾的納米膠束系統(tǒng)(PEG2000-DSPE-TPGS)，并聯(lián)合NT21MP對乳腺癌的影響。所以本研究以納米載體為切入點(diǎn)，使PEG2000-DSPE-TPGS搭載紫杉醇制成紫杉醇納米膠束。通過比較紫杉醇、紫杉醇納米膠束及其聯(lián)合多肽NT21MP對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、周期等生物學(xué)活性的影響，并探討紫杉醇納米膠束及其聯(lián)合多肽NT21MP對乳腺癌耐藥細(xì)胞的作用機(jī)制。本研究結(jié)果表明，紫杉醇納米膠束對乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡的抑制作用明顯強(qiáng)于紫杉醇，紫杉醇納米膠束聯(lián)合多肽NT21MP后抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)，且細(xì)胞存活率隨著濃度的升高，抑制能力進(jìn)一步增強(qiáng)。

此外，在本研究中，紫杉醇納米膠束及其聯(lián)合多肽NT21MP處理乳腺癌耐藥細(xì)胞后，EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin、Slug表達(dá)下調(diào)，而紫杉醇納米膠束聯(lián)合多肽NT21MP的效果更加明顯。本研究還發(fā)現(xiàn)，紫杉醇納米膠束抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)凋亡蛋白Bax、caspase3的表達(dá)。紫杉醇納米膠束聯(lián)合多肽NT21MP效果更明顯，同時對耐藥蛋白P-gp、BCRP的作用也是如此。

綜上所述，紫杉醇通過與TPGS-PEG2000-DSPE結(jié)合制成紫杉醇納米膠束，可以改善紫杉醇藥物原有的缺陷，提升藥效。紫杉醇納米膠束在體外可有效抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及逆轉(zhuǎn)耐藥和EMT的作用，通過聯(lián)合多肽NT21MP可以更有效地抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞的生物學(xué)活性以及逆轉(zhuǎn)EMT和耐藥。