尹 菲,楊 洋,張徐波,張建珍,張建琴,*

(1.山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2.山西大學應用生物學研究所,太原030006)

飛蝗Locustamigratoria屬于植食性昆蟲，主要以禾本科植物為生，危害的農(nóng)作物涉及玉米、小麥、谷子和高粱，在極端環(huán)境下也可危害大豆和白菜等(尤其儆等,1958)。羽化后的成蟲在環(huán)境溫度達到 31～34℃時，開始聚集遷飛，所到之處農(nóng)作物大面積破壞，造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失(尤其儆等,2003;吳瑞芬等,2006)?；瘜W防治法是防治蝗災的一種有效方法，殺蟲劑的長期施用導致飛蝗對馬拉硫磷等殺蟲劑產(chǎn)生了抗性(Maetal.,2004)。羧酸酯酶是昆蟲體內(nèi)主要的一類代謝解毒酶系，其功能主要是參與包含酯鍵的殺蟲劑等外源性化合物的解毒，信息素的分解和神經(jīng)發(fā)育及調(diào)控(Heikinheimoetal.,1999)。一般情況下當羧酸酯酶與有機磷殺蟲劑相互反應時，去磷酸化反應的速率較慢，昆蟲體內(nèi)羧酸酯酶基因無法與底物快速分離，此時酶活性被抑制。但是在一些具有有機磷農(nóng)藥抗性的昆蟲體內(nèi)，存在著一種特殊的酶類，這種酶可以快速將馬拉硫磷分解為無毒的產(chǎn)物，從而使得昆蟲對馬拉硫磷的耐受性增強，進而使得昆蟲對該農(nóng)藥具有抗性(Heidarietal.,2004;Cuietal.,2007)。Yang等(2008)的研究表明野生型飛蝗馬拉硫磷抗性品系的羧酸酯酶活性提高。由此得知，羧酸酯酶在飛蝗對有機磷的抗性中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期采用RNA干擾(RNA interference,RNAi)結(jié)合殺蟲劑生物學測定實驗結(jié)果顯示處于A簇的直翅目昆蟲α酯酶基因LmCesA1和LmCesA2與有機磷農(nóng)藥的代謝解毒相關(guān)(Zhangetal.,2013)，但這兩個基因在飛蝗體內(nèi)的超表達是否會導致飛蝗對馬拉硫磷的抗性還不清楚。目前已有研究利用果蠅模型超表達非模式昆蟲的基因，借助轉(zhuǎn)基因果蠅技術(shù)優(yōu)勢研究非模式生物基因的功能(Riveronetal.,2013,2014)。因此，本研究利用果蠅模型，分析飛蝗羧酸酯酶基因LmCesA1和LmCesA2的超表達及其與對馬拉硫磷的抗性的關(guān)系，以期為飛蝗抗性的監(jiān)測和治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

果蠅品系：RB0006親本黑腹果蠅Drosophilamelanogaster品系，基因型為{y v;attP40,y+}，購買于北京清華大學醫(yī)學院果蠅實驗中心。tub-Gal4品系可啟動靶標基因的全身表達，該品系由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所姚愛玉老師友情提供；act-Gal4品系可啟動靶標基因的全身表達；c601-Gal4品系是腸道組織特異表達的果蠅品系，act-Gal4與c601-Gal4由山西大學應用生物學研究所友情提供。

果蠅飼養(yǎng)條件：溫度25±2℃，相對濕度60%～70%，光周期14L∶10D。

1.2 供試試劑

DEPC水購自Sangon公司；Trizol,DNA Marker,6×Loading Buffer,Olige(dT)12-18 Primer,5×M-MLV Buffer,dNTP Mixture,RNase Inhibitor,Ex Taq和RTase M-MLV均購自TaKaRa公司；2×Taq PCR Master購自Tiangen公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自Toyobo公司；馬拉硫磷購自Sigma公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)試劑。

1.3 轉(zhuǎn)基因果蠅的構(gòu)建

本研究轉(zhuǎn)飛蝗羧酸酯酶基因果蠅構(gòu)建委托清華大學醫(yī)學院果蠅模式中心完成，具體的研究方法如下：根據(jù)飛蝗羧酸酯酶基因LmCesA1和LmCesA2的核苷酸序列，采用在線軟件NEBcutter V2.0 (http:∥tools.neb.com/NEBcutter2/)分析這兩個基因的酶切位點，結(jié)合載體pVALIUM20多克隆位點內(nèi)切酶類型，設(shè)計構(gòu)建載體引物(表1)。后經(jīng)PCR擴增，克隆測序確定將目的基因克隆到pVALIUM20載體中。將一定濃度的重組載體注射到親本果蠅受精卵中，篩選到的轉(zhuǎn)基因果蠅再與balancer果蠅雜交，得到純合的、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因果蠅品系UAS-LmCesA1和UAS-LmCesA2，該轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用了定點轉(zhuǎn)座技術(shù)，目的基因以單拷貝的方式插入到果蠅2號染色體上。

表1 用于本研究的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 轉(zhuǎn)基因果蠅與3品系Gal4果蠅雜交試驗

分別挑取不同Gal4果蠅中的處女蠅，與轉(zhuǎn)基因果蠅品系UAS-LmCesA1和UAS-LmCesA2的父本果蠅以雌雄2∶1的比例進行雜交，按照標準挑取所需要的子一代果蠅，RB0006品系作為對照果蠅，具體步驟如下：

(1)act-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA1品系的雄蠅雜交，子一代基因型為act>LmCesA1；act-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA2品系的雄蠅雜交，子一代基因型為act>LmCesA2；act-Gal4品系的處女蠅與RB0006品系的雄蠅雜交，子一代基因型為act>attP40。act-Gal4果蠅帶有卷翅平衡子，因此，挑取子一代的直翅果蠅進行后續(xù)研究。

(2)tub-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA1品系的雄蠅雜交，子一代基因型為tub>LmCesA1；tub-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA2品系的雄蠅雜交，子一代基因型為tub>LmCesA2；tub-Gal4品系的處女蠅與RB0006品系的雄蠅雜交，子一代基因型為tub>attP40。tub-Gal4果蠅帶有TM6B平衡子，因此，挑取子一代帶有兩根簇剛毛的果蠅進行后續(xù)研究。

(3)c601-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA1品系的雄蠅雜交，子一代基因型為c601>LmCesA1；c601-Gal4品系的處女蠅與UAS-LmCesA2品系的雄蠅雜交，子一代基因型為c601>LmCesA2；c601-Gal4品系的處女蠅與RB0006品系的雄蠅雜交，子一代基因型為c601>attP40，c601-Gal4品系是腸道組織特異表達的果蠅品系，子一代全部為靶標基因超表達果蠅。

1.5 轉(zhuǎn)基因果蠅的分子鑒定

1.5.1轉(zhuǎn)基因果蠅品系DNA水平的鑒定：轉(zhuǎn)基因果蠅品系與tub-Gal4果蠅品系雜交，分別選擇4-6 d雜交子一代tub>LmCesA1，tub>LmCesA2和tub>attP40的雌性果蠅進行DNA提取，采用轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建引物(表1)進行PCR擴增。25 μL PCR反應體系:DNA(10×) 2 μL,TaKaRa Ex Taq (5 U/μL) 0.1 μL,10×Ex Taq Buffer 2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL,上下游引物各 0.5 μL,ddH2O 17.4 μL。反應條件:95℃ 1 min；95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 2 min,35個循環(huán)；72℃ 10 min,4℃保存，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，采用天根公司的膠回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物回收，T-A克隆測序。

1.5.2轉(zhuǎn)基因果蠅品系RNA水平的鑒定：分別選擇各組羽化后第4-6天的子一代雌蠅提取總RNA，體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，以cDNA為模板，以表1設(shè)計的引物進行RT-PCR反應,rp49作為內(nèi)參基因。RT-PCR 反應體系：cDNA(10×)4 μL,上下游引物各0.8 μL,2×Taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O 6.9 μL。反應條件：94℃ 3 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s,72℃ 1 min (LmCesA1和LmCesA2基因28個循環(huán)，內(nèi)參rp49基因25個循環(huán));72℃ 5 min。RT-PCR實驗分組按照1.4節(jié)雜交分組，每個組別共設(shè)置3個生物學重復，5頭果蠅為一個生物學重復。

采用RT-qPCR法分別檢測靶標基因在c601-Gal4果蠅品系與UAS-LmCesA1品系和UAS-LmCesA2品系雜交子一代成蟲不同組織腦、腸和表皮等中的mRNA表達情況，rp49作為內(nèi)參基因。引物如表1。RT-qPCR反應體系:SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.8 μL,cDNA (10×) 4.0 μL,滅菌水4.4 μL。反應條件:95℃ 1 min;95℃ 5 s,55℃ 10 s,72℃ 15 s,40個循環(huán);95℃ 1 min,55℃ 1 min,97℃ 1 min,37℃ 30 s。至少50頭果蠅為一個生物學重復，共設(shè)置4個生物學重復。

1.6 轉(zhuǎn)基因果蠅對馬拉硫磷的耐受性測定

生物學測定采用的果蠅為c601>LmCesA1,c601>LmCesA2和c601>attP40。用純丙酮將馬拉硫磷配制成一系列濃度梯度。挑取羽化后4-6 d的子一代果蠅，并用CO2麻痹，將0.25 μL的農(nóng)藥點滴于果蠅的腹部，每組選用15頭雌性果蠅進行處理，每個組設(shè)置3個生物學重復。將果蠅置于培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為25±1℃，相對濕度為60%，24 h后記錄果蠅的死亡率，當果蠅輕觸不動則視為死亡。

1.7 數(shù)據(jù)分析

RT-qPCR數(shù)據(jù)利用ABI Prism 7500 SDS 1.1軟件進行分析，基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法，使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用Duncan氏多樣本間差異比較目標基因在各品系中的表達量的差異。生物測定數(shù)據(jù)用SPSS軟件的Probit方法計算LC50。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因果蠅品系DNA水平的鑒定結(jié)果

以DNA為模板進行PCR擴增，LmCesA1和LmCesA2的PCR產(chǎn)物的長度分別為1 648 bp和1 525 bp，由圖1可知，轉(zhuǎn)基因果蠅tub>LmCesA1和tub>LmCesA2中均能擴增到目的基因，而對照組果蠅tub>attP40中未擴增到目的基因。測序結(jié)果顯示插入的目的基因序列正確無誤。

圖1 轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅DNA水平的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of transgenic Drosophila melanogaster at the DNA levelM:DL5000 DNA Marker;tub>attP40:對照組果蠅Control Drosophila;tub>LmCesA1:過表達LmCesA1的轉(zhuǎn)基因果蠅Transgenic Drosophila overexpressing LmCesA1;tub>LmCesA2:過表達LmCesA2的轉(zhuǎn)基因果蠅Transgenic Drosophila overexpressing LmCesA2.

2.2 轉(zhuǎn)基因果蠅品系RNA水平的鑒定結(jié)果

將轉(zhuǎn)基因果蠅UAS-LmCesA1,UAS-LmCesA2和親本果蠅RB0006分別與3品系Gal4果蠅雜交。選擇其第4-6天的子一代提取總RNA，并體外反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA用于RNA水平的基因鑒定，結(jié)果顯示：靶標基因LmCesA1和LmCesA2在對照組(act>attP40;tub>attP40;c601>attP40)中均沒有表達；LmCesA1在不同Gal4品系與UAS-LmCesA1果蠅的雜交子一代act>LmCesA1(圖2:A)、tub>LmCesA1(圖2:B)和c601>LmCesA1(圖2:C)中均有表達；LmCesA2在不同Gal4品系與UAS-LmCesA2果蠅的雜交子一代act>LmCesA2(圖2:A)、tub>LmCesA2(圖2:B)和c601>LmCesA2(圖2:C)中均有表達。

圖2 轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅RNA水平的鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of transgenic Drosophila melanogaster at the RNA levelact>attP40:act-Gal4品系與對照組果蠅RB0006品系的雜交子一代Hybrid offspring of act-Gal4 strain and the control RB0006 strain;act>LmCesA1:act-Gal4品系與UAS-LmCesA1品系的雜交子一代Hybrid offspring of act-Gal4 strain and UAS-LmCesA1 strain;act>LmCesA2:act-Gal4品系與UAS-LmCesA2品系的雜交子一代Hybrid offspring of act-Gal4 strain and UAS-LmCesA2 strain.tub>attP40:tub-Gal4品系與對照組果蠅RB0006品系的雜交子一代Hybrid offspring of tub-Gal4 strain and the control RB0006 strain;tub>LmCesA1:tub-Gal4品系與UAS-LmCesA1品系的雜交子一代Hybrid offspring of tub-Gal4 strain and UAS-LmCesA1 strain;tub>LmCesA2:tub-Gal4品系與UAS-LmCesA2品系的雜交子一代Hybrid offspring of tub-Gal4 strain and UAS-LmCesA2 strain;c601>attP40:c601-Gal4品系與對照組果蠅RB0006品系的雜交子一代Hybrid offspring of c601-Gal4 strain and the control RB0006 strain;c601>LmCesA1:c601-Gal4品系與UAS-LmCesA1品系的雜交子一代Hybrid offspring of c601-Gal4 strain and UAS-LmCesA1 strain;c601>LmCesA2:c601-Gal4品系與UAS-LmCesA2品系的雜交子一代Hybrid offspring of c601-Gal4 strain and UAS-LmCesA2 strain.

c601-Gal4在果蠅中腸上皮細胞中高表達，本研究采用RT-qPCR方法鑒定了目的基因LmCesA1和LmCesA2分別在轉(zhuǎn)基因果蠅c601>LmCesA1和c601>LmCesA2成蟲不同組織部位(腦、表皮和腸道)中的表達情況。由圖3可知，兩個目的基因LmCesA1和LmCesA2均在轉(zhuǎn)基因果蠅的腸道中高表達。LmCesA1在c601>LmCesA1果蠅腸道中的表達量分別是腦和表皮中的7.6和16.7倍。LmCesA2在c601>LmCesA2果蠅腸道中的表達量分別是腦和表皮中的5.4和10.9倍。

圖3 LmCesA1(A)與LmCesA2(B)基因在轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅成蟲不同組織中的表達譜Fig.3 Expression profiles of LmCesA1 (A) and LmCesA2 (B) in different adult tissues of transgenic strains of Drosophila melanogaster選擇腦、表皮和腸道3個組織部位進行分析；每組織設(shè)4個生物學重復，實驗采用3個技術(shù)重復；rp49 為內(nèi)參基因。數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；柱上不同字母代表不同組織之間基因表達量有顯著性差異(P<0.05,Duncan氏多重比較檢驗)。The analyses were conducted in three different tissues,including the brain,cuticle and gut,and rp49 was used as a reference gene.Data are mean±standard errors (SE) of four biological replications (n=4),each with three technical replications.Different letters above bars indicate significant differences in the gene expression level among tissues by Duncan’s multiple comparison test (P<0.05).

2.3 轉(zhuǎn)基因果蠅對馬拉硫磷的耐受性

轉(zhuǎn)基因果蠅對馬拉硫磷的耐受性研究結(jié)果顯示：與對照組果蠅(c601>attP40)相比，超表達LmCesA1的轉(zhuǎn)基因果蠅(c601>LmCesA1)和超表達LmCesA2的轉(zhuǎn)基因果蠅(c601>LmCesA2)抗藥性均提高，抗性倍數(shù)分別為1.06和1.67(表2)。

表2 分別超表達LmCesA1和LmCesA2的黑腹果蠅品系對馬拉硫磷的耐受性Table 2 Tolerance of Drosophila melanogaster strains overexpressing LmCesA1 or LmCesA2 to malathion

3 討論

本研究通過轉(zhuǎn)基因果蠅技術(shù)闡明飛蝗羧酸酯酶基因(LmCesA1和LmCesA2)與有機磷農(nóng)藥代謝解毒的關(guān)系。當前，研究者可采用多種方法鑒定與農(nóng)藥解毒或抗性相關(guān)的昆蟲羧酸酯酶。例如，Wei等(2016)通過RT-qPCR技術(shù)對朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus羧酸酯酶基因(CarE)進行分析，結(jié)果顯示，相比于敏感品系，有8個羧酸酯酶基因(CarE3,CarE6,CarE7,CarE9,CarE10,CarE13,CarE15和CarE18)參與了甲氰菊酯的解毒過程，有4個羧酸酯酶基因(CarE4,CarE5,CarE14和CarE19)參與了氟甲氰菊酯的解毒過程；Wang等(2017)采用RNAi以及異源表達和細胞毒性實驗，證明了桔小實蠅Bactroceradorsalis的羧酸酯酶基因BdB1參與了對馬拉硫磷的解毒過程；Feng等(2018)基于家蠅Muscadomestica轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫對比黑腹果蠅D.melanogaster和岡比亞按蚊Anophelesgambiae，構(gòu)建羧酸酯酶的系統(tǒng)發(fā)育樹，最終在家蠅中共鑒定出39個不同功能分支的羧酸酯酶基因。上述研究技術(shù)可初步篩選到與抗藥性相關(guān)的基因，但無法進一步深入探究和驗證哪些候選基因具體參與了哪種殺蟲劑的代謝。果蠅因其獨特的生理特征，如易于室內(nèi)培養(yǎng)、染色體數(shù)目少、表型易于觀察以及發(fā)育繁殖快且繁殖量大等，被廣泛應用于遺傳學、發(fā)育生物學、醫(yī)學病理學等研究。果蠅用于經(jīng)典遺傳學領(lǐng)域以揭示真核生物染色體結(jié)構(gòu)，染色體遺傳連鎖等(Nüsslein-Volhard and Wieschaus,1980)。近年來，許多學者嘗試將其他昆蟲外源基因轉(zhuǎn)到果蠅基因組上，以研究這些基因的功能(常海靜,2011;朱昱璇,2016;Stinchfieletal.,2019;張徐波等,2019)。Zhu等(2010)首次在國際上報道了將轉(zhuǎn)基因果蠅成功應用于赤擬谷盜Triboliumcastaneum抗性基因 P450與溴氰菊酯代謝解毒關(guān)系的研究中。黑腹果蠅因其體內(nèi)具備完善的Gal4/UAS體系，可以實現(xiàn)外源基因在其體內(nèi)的超表達，進而對靶標基因進行生物測定、生物化學與分子生物學研究，可更深入地闡明該基因的功能?；蛉笔怨δ苎芯亢突颢@得性功能研究是研究基因功能的兩種重要的方法。但就目前的實驗技術(shù)，在飛蝗體內(nèi)難以實現(xiàn)基因的獲得性功能研究。因此，本研究采用Gal4/UAS系統(tǒng)，實現(xiàn)了飛蝗羧酸酯酶基因(LmCesA1和LmCesA2)在黑腹果蠅體內(nèi)的超表達，以期在果蠅體內(nèi)完成基因獲得性功能研究。

轉(zhuǎn)基因黑腹果蠅RNA水平的鑒定結(jié)果顯示，3品系Gal4(act-Gal4,tub-Gal4和c601-Gal4)果蠅與轉(zhuǎn)基因果蠅雜交的子一代均可檢測出目的基因的表達(圖2)，表明3品系Gal4果蠅均可啟動兩個靶標基因的表達，且針對單一基因的mRNA的表達量無顯著差異。c601-Gal4在果蠅中腸上皮細胞中高表達，為驗證c601-Gal4果蠅與轉(zhuǎn)基因果蠅雜交后代中靶標基因表達部位，本研究采用RT-qPCR方法，進一步驗證了靶標基因在轉(zhuǎn)基因果蠅成蟲腦、表皮和腸道等不同組織部位的表達情況。結(jié)果顯示，LmCesA1和LmCesA2在果蠅腸道中高表達，且在果蠅腸道中的表達量分別是表皮中表達量的16.7和10.9倍(圖3)。因本課題前期研究顯示這兩個羧酸酯酶基因(LmCesA1和LmCesA2)主要在飛蝗的中腸和胃盲嚢表達。為盡可能模擬目的基因在飛蝗體內(nèi)環(huán)境，在后續(xù)研究中我們采用c601-Gal4果蠅與轉(zhuǎn)基因果蠅雜交后代。

本課題組前期研究結(jié)果顯示，與對照組飛蝗相比，LmCesA1基因沉默的飛蝗對馬拉硫磷的敏感性提高30.9%。而在本研究中，與對照組果蠅(c601>attP40)相比，轉(zhuǎn)入飛蝗羧酸酯酶基因LmCesA1果蠅對馬拉硫磷的抗性沒有顯著變化(表2)。這個結(jié)果與前期研究結(jié)果存在差異，可能有兩個原因：(1)LmCesA1在轉(zhuǎn)基因果蠅中的蛋白水平較低；(2)LmCesA1對馬拉硫磷的解毒作用較弱。與對照組果蠅(c601>attP40)相比，轉(zhuǎn)入飛羧酸酯酶基因LmCesA2 果蠅對馬拉硫磷的抗性顯著升高。這可能是插入了外源羧酸酯酶基因增加了果蠅體內(nèi)目的基因拷貝數(shù)，使得羧酸酯酶活性升高，而產(chǎn)生了抗藥性。本課題組通過RNAi結(jié)合殺蟲劑生物測定實驗表明LmCesA2 可能參與飛蝗對馬拉硫磷的代謝解毒過程(Zhangetal.,2011)。本研究轉(zhuǎn)基因果蠅對馬拉硫磷代謝解毒的研究結(jié)論與通過RNAi方法研究LmCesA2 與對馬拉硫磷的解毒關(guān)系的結(jié)論一致。據(jù)此我們推測飛蝗LmCesA2極有可能參與飛蝗對馬拉硫磷的代謝解毒。

本研究通過轉(zhuǎn)飛蝗羧酸酯酶基因果蠅生物學測定實驗結(jié)果表明飛蝗LmCesA2極有可能參與飛蝗對馬拉硫磷的代謝解毒。但該實驗結(jié)果僅具有參考意義，并不能完全認定LmCesA1和LmCesA2基因參與飛蝗生物體內(nèi)殺蟲劑代謝解毒過程，其原因有：(1)基因在體內(nèi)的表達水平和空間分布在黑腹果蠅和飛蝗之間存在差異；(2)在果蠅中，對照品系和抗性品系之間只有一個遺傳差異，而在飛蝗體內(nèi)可能有其他抗性基因影響靶標基因的表達(Dabornetal.,2012)。因此，為進一步確定該基因與農(nóng)藥代謝關(guān)系，我們可以在今后的研究中建立飛蝗超表達體系或采用靶標基因的體外表達系統(tǒng)從多維角度全面解析基因與殺蟲劑代謝解毒的關(guān)系。