趙蘇鳴 ，趙 輝，顧濰煒，楊曉虎，顧祝新，陳曉陽，李華鐳，陶 霞

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院1 腫瘤介入科，2 醫(yī)學(xué)超聲科，3 泌尿外科，4 藥劑科，南通 226001)

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，是世界范圍內(nèi)的第六大常見癌癥[1]，死亡率高[2]。中國每年HCC發(fā)病和死亡患者約占全球的一半[3]。傳統(tǒng)手術(shù)治療對部分HCC患者的病情改善雖有明顯療效，但相當(dāng)數(shù)量的患者對治療不耐受，易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。目前對肝癌發(fā)生和進展的分子機制尚不完全清楚。因此，HCC相關(guān)調(diào)控機制成為目前研究的重點。

隨著高分辨率芯片及高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)不僅起轉(zhuǎn)錄干擾作用，而且是基因調(diào)控中不可或缺的部分。在HCC中，lncRNA的調(diào)控作用越發(fā)引起關(guān)注。LncRNA是一類長度＞200 nt的內(nèi)源性RNA，在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。HCC相關(guān)的lncRNA以多種形式參與HCC進展調(diào)控[4-6]，但由于lncRNA高級結(jié)構(gòu)和作用形式的復(fù)雜性和未知性，其在HCC中的調(diào)控作用尚需深入探討。

最近研究[7]發(fā)現(xiàn)，lncRNA可作為內(nèi)源竟?fàn)嶳NA(competing endogenous RNA,ceRNA)或稱為microRNA海綿，競爭結(jié)合于miRNA反應(yīng)元件(miRNA response elements,MREs)，抑制miRNAs的表達與功能，進而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)miRNAs靶基因——mRNAs的表達。生長抑制特異性基因5(growth arrest specific transcript 5,GAS5)位于1q25位點并含約630個核苷酸[8]，在多種常見的癌癥類型中具有腫瘤抑制功能，包括乳腺癌[9]、肺癌[10]、腎癌[11]和結(jié)直腸癌[12]等。然而，GAS5的作用和甲基化狀態(tài)及其在HCC發(fā)生中的作用尚未闡明。我們前期基于生物信息學(xué)的結(jié)果顯示，GAS5轉(zhuǎn)錄本中存在hsa-miR-221-3p互補結(jié)合位點，而前期研究[13]中證實了AXIN2可作為miR-221-3p的靶基因，因此猜測GAS5-miR-221-3p-AXIN2三者可能存在調(diào)控關(guān)系。本研究主要通過在肝癌細胞中過表達GAS5探討其對肝癌細胞增殖的影響，通過雙熒光素酶驗證其與miR-221-3p的結(jié)合情況，并從表觀遺傳角度初步了解其表達下降的機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源 肝癌及癌旁組織標本采集自南通大學(xué)附屬醫(yī)院。所有患者均簽署書面知情同意，實驗經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準。人肝癌細胞系(HCCLM3、HepG2和Huh7)和人正常肝細胞系LO2購自中科院細胞庫。5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-dC) 為Sigma產(chǎn)品；pcDNA3.1-GAS5質(zhì)粒及對照，引物由南京金斯瑞生物公司合成；Lipofectamine2000和TRIzol試劑為Invitrogen品牌；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；熒光定量PCR試劑盒為賽默飛產(chǎn)品；CCK-8檢測試劑盒購自碧云天公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人肝癌及正常肝細胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為檢測GAS5過表達對肝癌細胞株的影響，分對照組和pcDNA3.1-GAS5過表達組(GAS5組)。轉(zhuǎn)染步驟：細胞以1×106個/mL密度接種于6孔板，待細胞融合度約70%時進行轉(zhuǎn)染。將1 μg DNA溶于50 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，將2 μL Lipofectamine2000溶于50 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，混勻室溫放置5 min。將兩管混合，放置20 min。將上述復(fù)合物加入6孔板中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后，棄去并加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。將培養(yǎng)細胞分成4組(5-Aza-dC濃度分別為0、1、2、3 μmol/L)，并于加藥后48 h檢測。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRTPCR)檢測 根據(jù)操作說明書，用TRIzol試劑提取組織和細胞樣品的總RNA。用第一鏈cDNA合成試劑盒合成反向轉(zhuǎn)錄cDNA。采用SYBR green法進行qRT-PCR檢測。PCR反應(yīng)條件：先94 ℃5 min，后94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s共35個循環(huán)。以GAPDH的表達水平為內(nèi)參。結(jié)果采用定量PCR中的相對定量法，以2-△△Ct表示目的基因相對于對照組的變化倍數(shù)。引物序列如下：GAS5上游引物，5′-CTTGCCTGGACCAGCTTAAT-3′；下游引物，5′-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3′。GAPDH上游引物，5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′；下游引物，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3 CCK-8細胞增殖檢測 收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)節(jié)細胞密度，96孔板每孔加入100 μL約3 000個細胞，分別在轉(zhuǎn)染或刺激后24、48、72、96 h每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標儀以450 nm波長測量各孔的吸光度值，繪制細胞生長曲線。每組設(shè)定3個復(fù)孔，重復(fù)實驗3次，取其均值。

1.2.4 克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，形成細胞懸液。接種細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，按每皿含50、100和200個細胞的梯度密度，分別接種于含10 mL預(yù)溫37 ℃培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，然后以十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞分散均勻；在37 ℃，5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜止培養(yǎng)3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)液，用PBS小心浸洗2次。加甲醇固定15 min。棄固定液，加適量姬姆薩應(yīng)用液染色30 min，然后流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

1.2.5 劃痕實驗 先用記號筆在6孔板背后均勻劃橫線，約每隔1 cm一道，橫穿過孔，每孔穿過5條線。接種細胞，待細胞鋪滿板底后用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。本次實驗按0 h和48 h取樣，拍照。

1.2.6 細胞侵襲實驗 實驗前需先換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，清除血清的影響。將基質(zhì)膠進行適當(dāng)稀釋，鋪在上層Transwell小室中，置細胞培養(yǎng)箱中聚合過夜。下室培養(yǎng)基用含20% 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的培養(yǎng)基。胰酶消化細胞，制備細胞懸液，無血清培養(yǎng)基洗滌細胞并重懸。將上層小室放入下層小室，細胞計數(shù)后將細胞鋪在上層小室中。細胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36 h。用棉簽擦去上層小室里的細胞和基質(zhì)膠，后用甲醇固定細胞5 min，姬姆薩染液染細胞后拍照。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測 在用螢火蟲熒光素酶基因定量表達時，海腎熒光素酶報告基因作為對照。將構(gòu)建的pmiR-RB-ReportTM-GAS5野生型和突變型質(zhì)粒分別與miR-221-3p mimic和miR-con共轉(zhuǎn)進HCCLM3細胞系中，檢測熒光素酶基因表達，加入特定的熒光素酶底物，二者反應(yīng)產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以表示，兩組間比較采用Student t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GAS5在肝癌細胞株和肝癌組織中表達顯著下調(diào) 對GAS5在3種常見的肝癌細胞株中的相對表達量進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與人正常肝細胞LO2中的相對表達量相比，GAS5在肝癌細胞株中表達顯著下調(diào)(P＜0.05，圖1A)。同樣的，GAS5在肝癌組織中表達明顯較癌旁組低(P＜0.05，圖1B)。

2.2 過表達GAS5明顯抑制肝癌細胞增殖、遷移、侵襲及克隆形成 在GAS5過表達組，與對照組相比其相對表達量顯著升高(P＜0.05，圖2A)，說明轉(zhuǎn)染成功。CCK-8結(jié)果顯示，過表達GAS5后，HCCLM3細胞增殖明顯受到抑制(P＜0.05，圖2B)。劃痕實驗的結(jié)果表明，48 h后，GAS5組的劃痕愈合百分比比對照組顯著降低(P＜0.05，圖2A～B)。Transwell結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，GAS5組細胞數(shù)量顯著下降(P＜0.05，圖2C～D)。克隆形成實驗結(jié)果表明，與對照組相比，GAS5組細胞克隆數(shù)顯著減少(P＜0.05，圖2E～F)。提示GAS5具有抑制肝癌細胞增殖的效應(yīng)。

2.3 GAS5可與miR-221-3p互補結(jié)合 通過在線網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/mirLncRNA.php)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)GAS5轉(zhuǎn)錄本中存在hsa-miR-221-3p互補結(jié)合位點(圖3A)。本研究構(gòu)建了pmiR-RB-ReportTMGAS5質(zhì)粒，并將其與miR-221-3p mimic共轉(zhuǎn)進HCCLM3細胞系中。雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，在野生型中轉(zhuǎn)染miR-221-3p mimic后相對熒光素酶活性顯著降低，提示兩者直接可互補結(jié)合(圖3B)。

2.4 GAS5啟動子CpG島甲基化水平可能參與調(diào)控GAS5表達 通過在線網(wǎng)站(http://www.urogene.org/methprimer/)對GAS5啟動子區(qū)域的CpG島進行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域附近富集了多個CpG島(圖4A)。因此猜測，GAS5在腫瘤中低表達與GAS5啟動子區(qū)域附近的CpG島甲基化狀態(tài)有關(guān)。通過肝癌細胞株中加入不同劑量的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC進行了初步驗證。結(jié)果表明，隨著5-Aza-dC濃度逐漸變大，GAS5相對表達量呈現(xiàn)顯著上調(diào)(圖4B)，提示腫瘤中GAS5低表達與其啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平有關(guān)。

3 討論

HCC是人類最常見和最具侵襲性的惡性腫瘤之一[1]。盡管臨床診療手段不斷進步，但HCC的預(yù)后仍很差，特別是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或晚期患者。HCC診斷和治療缺乏合適的分子標記是主要原因[14-15]。

LncRNA在HCC的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移中的重要作用越來越被重視。Lnc FTX在HCC組織中的表達與正常肝組織相比明顯下調(diào)。高Lnc FTX表達的患者表現(xiàn)出較高的生存率，提示Lnc FTX是HCC患者的預(yù)后因素[16]。Lnc GAS5在多種癌癥中表達下調(diào)，可調(diào)控細胞周期，影響細胞進程，通常發(fā)揮抑癌功能[9-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達GAS5抑制肝癌細胞的體外增殖，證實GAS5在HCC中也起著抑癌作用。

雖然GAS5已被證明是一種腫瘤抑制因子，但其潛在的分子機制尚不完全清楚。Lnc RNAs具有二級結(jié)構(gòu)，促進它們與DNA和RNA的相互作用。因此，Lnc RNAs通常以序列特異性的方式通過與DNA或RNA結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的表達[17-18]。Lnc RNAs通過與miRNAs的相互作用影響靶蛋白的表達。如Lnc MALAT1可作為HCC中miR-146-5p的分子海綿。過表達MALAT1與miR-146-5p結(jié)合，抑制miR-146-5p的表達，即miR-146-5p下游靶基因上調(diào)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6的表達，從而激活絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路促進HCC的進展[19]。在體外和體內(nèi)，Lnc FTX可通過競爭性海綿吸附miR-374a抑制Wnt/β-catenin信號活性，抑制肝癌細胞上皮間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化和侵襲[16]。Lnc HAGLROS在HCC組織中在HCC中高表達，通過miR-5095/ATG12軸和PI3K/AKT/mTOR信號通路參與細胞增殖、凋亡和自噬的過程[20]。本研究首先通過在線生物信息學(xué)預(yù)測了GAS5轉(zhuǎn)錄本中存在miR-221-3p互補結(jié)合位點，隨后通過雙熒光素酶實驗驗證了兩者之間的相互結(jié)合，提示GAS5可作為分子海綿吸附miR-221-3p，進而影響下游靶基因的表達或相關(guān)腫瘤信號通路。

為從表觀遺傳角度解釋GAS5在腫瘤中低表達，我們首先預(yù)測到GAS5啟動子區(qū)附近存在多個甲基島，進而通過在肝癌細胞系中加入不同劑量的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC進行了初步驗證。實驗結(jié)果證實了GAS5低表達與其啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平有關(guān)。由此初步明確了在肝癌細胞中由于GAS5啟動子甲基化導(dǎo)致其表達量下調(diào)。通過5-Aza-dC的去甲基化處理，GAS5表達上調(diào)后作為分子海綿吸附miR-221-3p能力增強，進而抑制了肝癌細胞的增殖。

總之，本研究初步表明GAS5在肝癌組織和細胞系中的表達顯著下調(diào)，與其CpG島甲基化水平有關(guān)。GAS5可作為分子海綿吸附miR-221-3p抑制肝癌細胞增殖。