柏玉冰 李洪 權(quán)包敏

[摘要]目的 建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定決明子中綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸、原兒茶醛4種酚酸的含量。方法 決明子以50%甲醇超聲提取;采用Acclaim 120 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，以0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）為流動相系統(tǒng)梯度洗脫，流速為0.5 ml/min，柱溫為30℃，進樣體積2 μl。采用電噴霧離子源（ESI），進行負離子掃描。結(jié)果 綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸、原兒茶醛濃度分別在0.0200～3.2000、0.0230～3.6800、0.0230～3.6800、0.0280～4.4800 μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為96.8%、99.2%、96.3%、96.9%，所測決明子樣品中綠原酸含量為85.691～304.280 μg/g，阿魏酸為5048.3～139 69.0 μg/g，原兒茶酸為1458.2～9919.4 μg/g，原兒茶醛為15.108～22.956 μg/g。結(jié)論 本法可用于決明子藥材中上述4種酚酸含量的測定，為決明子的抗氧活性量效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;決明子;酚酸;含量測定

[中圖分類號] R917? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）8（b）-0004-06

[Abstract] Objective To establish an ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of four phenolic acid components （chlorogenic acid， ferulic acid， protocatechuic acid and protocatechualdehyde） in Cassia obtusifolia. Methods Cassia obtusifolia was extracted by ultrasound with 50% methanol. Chromatographic separation was performed on Acclaim 120 C18 （150 mm×4.6 mm， 5 μm） column by gradient elution with the mobile phase consisted of 0.1% formic acid （A） and acetonitrile （B）. The flow rate was 0.5 ml/min， the column temperature was 30℃， and the injection volume was 2 μl. The mass spectra was obtained by electron spray ionization （ESI） under negative ion mode. Results The linear ranges of chlorogenic acid， ferulic acid， protocatechuic acid and protocatechualdehyde fell into 0.0200-3.2000， 0.0230-3.6800， 0.0230-3.6800， 0.0280-4.4800 μg/ml， respectively. The average recovery of chlorogenic acid， ferulic acid， protocatechuic acid and protocatechualdehyde was 96.8%， 99.2%， 96.3% and 96.9%， respectively. The contents of chlorogenic acid， ferulic acid， protocatechuic acid and protocatechualdehyde were 85.691-304.280， 5048.3-139 69.0， 1458.2-9919.4 and 15.108-22.956 μg/g， respectively. Conclusion This method can be used for the determination of four phenolic acids in Cassia obtusifolia， which lays a foundation for the study on the dose-effect relationship of antioxidant activity of Cassia obtusifolia.

[Key words] Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Cassia obtusifolia; Phenolic acids; Content determination

決明子為豆科植物決明（Cassia obtusifolia L.）或小決明（Cassia tora L.）的干燥成熟種子[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性甘、苦、咸，歸肝、腎、大腸經(jīng)，具有清肝明目、潤腸通便的功效[2]。決明子含有蒽醌[3]、萘并吡喃酮[4]、多糖[5]、酚類[6]及多種微量元素[7]等成分，具有保肝[8]、降血脂[9]、降血壓[10]、抑菌[11]、抗氧化[12]、瀉下[13]等功效。

近年來，為開發(fā)其保健功能，關(guān)于決明子抗氧化及其產(chǎn)生的保健功能的研究逐漸增多[14-16]。如多糖[17]、揮發(fā)性成分[18]、蒽醌類[19]、水提物及醇提物[20]的抗氧化作用，多糖抗氧化作用可清除氧自由基，改善衰老，有抗衰老的保健作用[2]。但不管是抗氧化作用還是進一步的保健作用，其作用強弱均與抗氧化成分在決明子中的含量相關(guān)。且有多名學者對這些活性成分進行了含量測定。如：何保江等[18]測定揮發(fā)性成分的相對含量為0.63%～13.51%;龍遠春等[21]測定總蒽醌的含量為15.64～18.30 mg/g; Guo等[22]測定蒽醌單體的含量為0.40～9.18 mg/g;鄧施璐等[23]測定多糖含量為1.93～16.18 mg/g。

而植化成分中，關(guān)于抗氧化作用明確的酚酸類[24-25]含量測定的報道罕見，這在一定程度上影響決明子抗氧化量效關(guān)系評價。因此，本研究選擇酚酸類含綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸和原兒茶醛建立含量測定方法，以期為后期整體評價決明子抗氧活性量效關(guān)系提供補充。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品

決明子，采購于各大藥材市場，樣品信息具體見表1。所有批次藥材經(jīng)株洲市食品藥品檢驗所包敏主管藥師鑒定均為豆科植物決明（Cassia obtusifolia L.）的干燥成熟種子。樣本存放于株洲市食品藥品檢驗所中藥材樣品室。所有批次藥材均經(jīng)粉碎后過4號篩，備用。

1.1.2標準品

4種酚酸對照品均購自于中國食品藥品檢定研究院，分別為綠原酸（純度99.3%，批號：110753-201716）、阿魏酸（純度99.0%，批號：110773-201614）、原兒茶酸（純度99.9%，批號：110809-201205）、原兒茶醛（純度98.2%，批號：110810-201007）。

1.1.3主要試劑

乙腈、甲醇（色譜純，霍尼韋爾有限公司）。

1.1.4主要儀器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）;XSE 205DV電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）;QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜（上海愛博才思分析儀器有限公司）等。

1.2方法

1.2.1色譜-質(zhì)譜條件

1.2.1.1色譜條件? 采用Acclaim 120 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫（0～6 min，90%A→10%A;6～8 min，10%A;8～8.5 min，10%A→90%A;8.5～10.0 min，90%A），流速為0.2 ml/min，采集時間為10 min，柱溫為30℃，進樣量2 μl。

1.2.1.2質(zhì)譜條件? 電噴霧電離源（ESI），負離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM），離子源溫度：550℃，電噴霧電壓：-4500 V，氣簾氣：35.0 psi，離子源氣1：55 psi，離子源氣2：55 psi，碰撞氣：氬氣。各成分的質(zhì)譜分析參數(shù)具體見表2。

1.2.2溶液的制備

1.2.2.1混合對照品儲備溶液? 精密稱取不同質(zhì)量的綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸、原兒茶醛對照品，置25 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。經(jīng)含量折算后，上述各對照品的濃度分別為0.20、0.23、0.23、0.28 mg/ml。

1.2.2.2供試品溶液? 取決明子粉末（粉碎后過4號篩），置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液30 ml，稱量，超聲（100 W，35 kHz）提取50 min，靜置至室溫，再稱量，用50%甲醇溶液補足減失的量，搖勻。提取2次，合并提取液。精密量取1 ml轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶內(nèi)，用50%甲醇溶液稀釋至刻度線，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.3方法學考察

1.2.3.1線性關(guān)系考察? 精密量取混合對照品精密稱取細粉0.5 g儲備溶液適量，用甲醇稀釋得系列濃度的混合對照品溶液（綠原酸：0.0200、0.0400、0.0800、0.2000、0.4000、0.8000、2.0000、3.200 μg/ml;阿魏酸：0.0230、0.0460、0.0920、0.2300、0.4600、0.920、2.300、3.6800 μg/ml;原兒茶酸：0.0230、0.0460、0.0920、0.2300、0.4600、0.9200、2.300、3.6800 μg/ml;原兒茶醛：0.0280、0.0560、0.1120、0.2800、0.5600、1.1200、2.8000、4.4800 μg/ml），按“1.2.1”項下的條件進行測定，以質(zhì)量濃度（C）（ng/ml）為橫坐標（X），峰面積（A）為縱坐標（Y），計算4個成分的線性回歸方程。

1.2.3.2精密度試驗? 取混合對照品溶液，按照“1.2.1”項下條件連續(xù)進樣6次，記錄各成分峰面積并計算相對標準偏差（RSD）。

1.2.3.3重復性試驗? 取同一批樣品（1號樣品，河北安國，20190607），稱取6份，按照“1.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“1.2.1”項下條件進樣分析，記錄各成分峰面積并計算RSD。

1.2.3.4穩(wěn)定性試驗? 取同一批樣品供試品溶液（1號樣品，河北安國，20190607），分別于0、2、4、8、12 h，按照“1.2.1”項下條件進樣分析，記錄各成分峰面積并計算RSD。

1.2.3.5加樣回收試驗? 取已知含量的樣品（1號樣品，河北安國，20190607）6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入絕對含量接近0.25 g藥材所含量的對照品溶液后，按“1.2.2.2”項下方法分別制備供試品溶液，按照“1.2.1”項下條件進樣分析，計算加樣回收率。

1.2.4供試液制備條件優(yōu)化

1.2.4.1最佳提取溶劑考察? 比較不同的提取溶劑，包括水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、100%甲醇。以4種成分的含量大小為判斷依據(jù)，確定最佳提取溶劑。

1.2.4.2最佳提取時間考察? 比較不同的提取時間，包括10、20、30、40、50和60 min，以4種成分的含量不再增加為判斷依據(jù)，確定最佳提取時間。

1.2.4.3最佳提取體積考察? 比較不同的提取體積，包括10、20、30、40、50 ml，以4種成分的絕對含量最大為判斷依據(jù)，確定最佳提取體積。

1.2.4.4最佳提取次數(shù)考察? 比較不同的提取次數(shù)，包括1、2、3、4、5次，以每種酚酸成分經(jīng)最佳次數(shù)提取后的含量占5次提取后含量的95%以上且不再顯著增加為判斷依據(jù)，確定最佳提取次數(shù)。

1.2.5色譜條件優(yōu)化

1.2.5.1色譜柱的比較? 比較三款不同的色譜柱，包括Agela Venusil AS-TC18、Welch Xtimate C18、Acclaim 120 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），以4種成分的分子離子峰的保留性和峰型為判斷依據(jù)，確定最佳色譜柱。

1.2.5.2流動相的比較? 比較兩種不同的流動相系統(tǒng)，包括乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-含5 mmol/L的乙酸銨0.1%甲酸水，以4種成分的峰面積大小為判斷依據(jù)，確定最佳提取溶劑。

1.2.5.3不同流速和進樣體積的比較? 比較不同的流速，包括0.4、0.5、0.6 ml/min，以4種成分的峰型為判斷依據(jù)，確定最佳流速。同樣的條件下考察比較了不同的進樣體積，包括1、2、3 μl，以4種成分的峰型為判斷依據(jù)，確定最佳進樣體積。

1.2.6樣品測定

精密稱取6批次不同批號的決明子各2份，分別按照“1.2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按照“1.2.1”項下條件進樣測定，帶入線性回歸方程計算4個成分含量。

2結(jié)果

2.1方法學考察

2.1.1線性關(guān)系考察

按照線性關(guān)系試驗方法進行實驗，結(jié)果顯示，4種成分在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，具體見表3。

2.1.2精密度試驗

按照精密度試驗方法進行實驗，結(jié)果顯示，綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸、原兒茶醛峰面積的RSD分別為0.71%、0.64%、0.87%、0.92%，提示精密度良好。

2.1.3重復性試驗

按照重復性試驗方法進行實驗，結(jié)果顯示，綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸、原兒茶醛峰面積的RSD分別為1.44%、1.53%、1.25%、1.88%，提示該方法重復性良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗

按照穩(wěn)定性試驗方法進行實驗，結(jié)果顯示，各成分峰面積的RSD分別為2.34%、2.35%、1.76%、2.23%，提示供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5加樣回收試驗

按照回收率試驗方法進行實驗，結(jié)果如表4所示，綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸、原兒茶醛的平均回收率為96.8%、99.2%、96.3%、96.9%，RSD分別為2.66%、3.38%、2.34%、3.09%，提示本方法回收率良好。

2.2供試液制備條件優(yōu)化

2.2.1最佳提取溶劑考察

最佳提取溶劑考察結(jié)果具體見圖1和表5，結(jié)果顯示，當甲醇濃度為50%時，4種酚酸成分的含量均最大，因此選擇50%甲醇為最佳提取溶劑。

2.2.2最佳提取時間考察

最佳提取時間考察結(jié)果具體見圖2和表6，結(jié)果顯示，4種成分均在提取50 min時達到最大值。而當提取時間超過50 min時，含量不增反降，尤其是原兒茶酸，這可能是由于隨著超聲的時間增加，水溫升高，促使部分酚酸被空氣中的氧氣氧化，因此最佳提取時間為50 min。

2.2.3最佳提取體積考察

最佳提取體積考察結(jié)果具體見圖3和表7，結(jié)果顯示，當提取體積為30 ml時，其含量的絕對值已經(jīng)達到上限，因此最佳提取體積為30 ml。

2.2.4最佳提取次數(shù)考察

最佳提取次數(shù)考察結(jié)果具體見圖4和表8，結(jié)果顯示，當?shù)?次提取時，其4種成分的含量已經(jīng)占5次含量之和的95%以上，因此最佳提取次數(shù)為2次。

2.3色譜條件優(yōu)化

2.3.1色譜柱的比較

色譜柱比較結(jié)果顯示，當使用Agela Venusil AS-TC18色譜柱時，出峰時間較快，4個成分均在3 min以內(nèi)全部出峰，但是4個成分均有拖尾現(xiàn)象;當使用Welch Xtimate C18和Acclaim 120 C18色譜柱色譜柱時，4種化合物出峰時間相當，均為5～7 min;但是當使用Welch Xtimate C18時，4個成分均有拖尾現(xiàn)象;而當使用Acclaim 120 C18色譜柱，出峰時間為5～7 min，峰型均較好，因此選擇Acclaim 120 C18色譜柱較為合適。

2.3.2流動相的比較

流動相比較結(jié)果顯示，隨著乙酸銨的加入，4種成分的峰面積均減小，提示乙酸銨對酚酸類成分的離子化具有抑制作用。

2.3.3不同流速和進樣體積的比較

不同流速比較結(jié)果顯示，不同流速情況下出峰時間相差不大，而且峰型均較好，因此推測小范圍內(nèi)不同流速對于峰型并無明顯影響。和不同流速情況類似，不同流速對于峰型無明顯影響。因此，選擇流速0.5 ml/min和進樣體積2 μl為本次實驗的條件。

2.4樣品測試

基于上述優(yōu)化后的提取工藝和檢測條件，對收集的10批樣品進行測定，結(jié)果如表10所示。

3討論

根據(jù)供試液制備條件優(yōu)化，研究確定了供試液的最佳制備條件：提取溶劑為50%甲醇，提取時間為50 min，提取體積為30 ml，提取次數(shù)為2次;根據(jù)色譜條件的優(yōu)化，研究確定了較為合適的色譜條件：色譜柱為Acclaim 120 C18色譜柱，流動相為乙腈-0.1%甲酸水，流速為0.5 ml/min，進樣體積為2 μl。聯(lián)合儀器自動優(yōu)化得出的最佳質(zhì)譜條件，本研究建立了決明子中綠原酸、阿魏酸、原兒茶酸和原兒茶醛4種酚酸成分的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜含量測定方法。本方法的完成，可同時簡單、快速和高效地得出決明子中多種酚酸成分的含量，為決明子酚酸抗氧化的量效關(guān)系、質(zhì)量控制等進一步的研究奠定了基礎(chǔ)。