趙榮杰 , 趙 峰 , , 徐奎棟 ,

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生物分類與系統(tǒng)演化實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049; 3. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071)

真核微生物狹義上指原生生物, 廣義上還包括單細(xì)胞真菌和微型后生動(dòng)物[1-3], 其種類繁多、分布廣泛, 在海洋初級(jí)生產(chǎn)、微食物網(wǎng)和生物地球化學(xué)循環(huán)等生態(tài)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。海洋真核微生物多樣性的研究對(duì)于理解海洋生態(tài)環(huán)境的變化過(guò)程以及人類活動(dòng)和氣候變化對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響等至關(guān)重要。

近年來(lái), 環(huán)境DNA 結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于真核微生物多樣性研究中[6-8], 極大地拓展了對(duì)真核微生物多樣性及其分布的認(rèn)知, 檢獲了大量潛在新類群, 并為微型生物地理分布這一國(guó)際熱點(diǎn)爭(zhēng)論, 提供了大量新鮮素材和佐證[9-14]。近海因陸源輸入[15-17]等原因具有豐富的營(yíng)養(yǎng)鹽, 真核微生物豐度和生物量較高, 已有的關(guān)于近海水體中的真核微生物多樣性研究中, 采樣量為300 mL～40 L不等[9,12,18-19]。熱帶大洋多為寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境, 真核微生物的豐度和生物量明顯較近海低, 檢獲足夠的生物多樣性所需要的采樣量遠(yuǎn)大于近海。受限于采樣方法、采樣時(shí)間和成本, 大洋生物調(diào)查的采樣量差異巨大, 范圍為10～500 L[6,11,13]。

采樣量是影響海洋真核微生物多樣性評(píng)估的重要因素。 有關(guān)采樣量對(duì)真核微生物多樣性影響的研究多集中于沉積物。Fonseca 等人[20]關(guān)于海底沉積物中后生動(dòng)物多樣性的研究發(fā)現(xiàn), 8 個(gè)采樣站共24 個(gè)沉積物樣品所獲得的OCTU(Operational Clustering of Taxonomic units, 可操作聚類分類單元)稀釋曲線未達(dá)到飽和。由于底棲生物斑塊分布的特性, 即使高通量測(cè)序技術(shù)佐以大量的樣品, 真實(shí)的物種多樣性仍未可知。水體與沉積物不同, 潮汐和洋流等海洋現(xiàn)象增強(qiáng)了水體的連通性, 不同海域之間或不同深度水層之間得以產(chǎn)生化學(xué)和生物因素的交流[21], 從而使得水體中真核微生物的分布均勻度指數(shù)高于底棲群落, 但水體中真核微生物多樣性仍與采樣量存在正相關(guān)的關(guān)系。因此, 探究水體采樣量對(duì)檢獲的真核微生物多樣性的影響, 對(duì)真核微生物多樣性研究具有重要的指導(dǎo)意義。

呂宋海峽北起臺(tái)灣島南至菲律賓呂宋島, 是連接中國(guó)南海和西太平洋的重要通道[22]。呂宋海峽屬于寡營(yíng)養(yǎng)海域, 作為黑潮在沿太平洋西岸北上及進(jìn)入南海的過(guò)程中的必經(jīng)之地, 其水文環(huán)境和生物多樣性深受黑潮攜帶的西太平洋海流信號(hào)的影響[23-26]。該海區(qū)真核微生物群落交流密切, 且處于大洋與近岸的交匯區(qū), 基于該海區(qū)的研究, 對(duì)未來(lái)近岸和遠(yuǎn)洋的真核微生物多樣性分布研究均具有重要的參考價(jià)值。

本研究旨在探究不同采樣量對(duì)水體中真核微生物多樣性評(píng)估的影響, 回答水體中真核微生物多樣性是否隨采樣量的增加而增加, 多大采樣量能夠充分反映水體中的真核微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性分布特點(diǎn)等科學(xué)問題。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)的選擇和樣品的采集

實(shí)驗(yàn)所用樣品系2018 年6 月搭載“華務(wù)號(hào)”科考船, 于呂宋海峽處獲取, 共計(jì)5 個(gè)采樣點(diǎn), 其中C08(124°E, 22.333°N)、C10(122.667°E, 21.667°N)和C12(124°E, 21.667°N)站位位于呂宋海峽東側(cè), 處于菲律賓海盆中; C14(120.5°E, 21°N)和C19(120.5°E,19.6°N)站位位于呂宋海峽及其西側(cè), 處于南海(圖1)。

圖1 采樣站位圖Fig. 1 Map of sampling sites

每個(gè)采樣點(diǎn)設(shè)4 個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)采10 L 表層海水。海水預(yù)先用孔徑為200 μm 的篩絹過(guò)濾, 再用孔徑為0.22 μm 的聚碳酸酯濾膜過(guò)濾, 將濾膜保存于無(wú)RNA 酶的2 mL 凍存管, 并立即放置到液氮中保存, 帶回實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)移至–80℃冰箱保存。采水及過(guò)濾所用的水桶、篩絹、塑料管等在每次使用后均用無(wú)菌蒸餾水沖洗2～3 遍, 排除樣品之間的交叉污染。

1.2 DNA 的提取和真核微生物18S rDNA的擴(kuò)增

所有樣品均采用凱杰 DNA/RNA 提取試劑盒(AllPrep DNA/RNA Mini Kit, Qiagen, Germany)并按照使用說(shuō)明進(jìn)行DNA 的提取。最終每個(gè)樣品得到1 份DNA(100 μL)。以DNA 為模板利用真核生物特異性引 物 F (5′-CCAGCA(G/C)C(C/T)GCGGTAATTCC-3′,565bp-584bp) 和 R (5′-ACTTTCGTTCTTGAT(C/T)(A/G)A-3′, 964bp-981bp)對(duì)樣品進(jìn)行18S V4 區(qū)的擴(kuò)增, 擴(kuò)增程序見文獻(xiàn)[27], 每份DNA 設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。為減少 PCR 過(guò)程中產(chǎn)生的誤差, 采用高保真酶Q5(BioLabs INC., NEW ENGLAND)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行濃度及擴(kuò)增片段準(zhǔn)確度的檢測(cè), 對(duì)在480bp 處有明顯亮帶的樣品采用Qubit 2.0 熒光定量?jī)x(Thermo Scientific)測(cè)定準(zhǔn)確濃度, 并用GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, USA)進(jìn)行純化, 3 個(gè)重復(fù)進(jìn)行合樣, 用于后續(xù)測(cè)序。

1.3 高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)處理

擴(kuò)增樣品由北京諾禾致源科技股份有限公司利用Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序, 并采用NEB Next Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB,USA) 建立樣品序列庫(kù), 添加barcode 序列。序列庫(kù)的質(zhì)量通過(guò)Qubit 2.0 熒光定量?jī)x (Thermo Scientific,USA) 和Agilent Bioanalyzer 2100 system 進(jìn)行測(cè)定。

對(duì)Illumina HiSeq 測(cè)序平臺(tái)得到的序列信息進(jìn)行拼接得到原始數(shù)據(jù)(Raw Data), 經(jīng)過(guò)質(zhì)控和去嵌合體得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。利用USEARCH(version9.2/10.0http://drive5.com/uparse/)對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行去冗余、去單一序列和97%相似度的OTU(Operational Taxonomic Units, 可操作分類單元)聚類分析, 根據(jù)OTU 聚類結(jié)果, 對(duì)每個(gè)OTU 的代表序列與SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)作物種注釋, 得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況, 即OTU Distribution Table(以下簡(jiǎn)稱OTU Table)。

利用EstimateS (EstimateS 9.1)對(duì)OTU Table 中各OTU 豐度信息進(jìn)行4 次隨機(jī)重抽樣, 重抽樣標(biāo)準(zhǔn)為10 000 條序列, 得到各站位在10 L、20 L、30 L和40 L 時(shí)的OTU 數(shù)目和ACE 指數(shù), 并以此為基礎(chǔ)在 Excel 中繪制物種累積曲線、在 SPSS 中利用ANOVA 功能計(jì)算各組之間的單因素方差值。

以各個(gè)站位4個(gè)重復(fù)的OTU 豐度信息為基礎(chǔ)利用R 語(yǔ)言的VEGAN 包的vegdist 功能(https://CRAN.Rproject.org/package=vegan)計(jì)算各個(gè)站位4 個(gè)重復(fù)和重復(fù)總和之間的Bray-Curtis 距離, 并以此為基礎(chǔ)利用R 語(yǔ)言的ggplot2 包(https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2)作物種組成和物種豐度的主坐標(biāo)分析(PCoA, Principal Co-ordinates Analysis)。

2 結(jié)果

2.1 物種豐富度與采樣量的關(guān)系

自5個(gè)站位共計(jì)20個(gè)樣品的分析中獲得2 066 528條有效序列, 97%相似度聚類后得到2 737 個(gè)OTU。5 個(gè)站位真核微生物的OTU 數(shù)量與采樣量之間均存在正相關(guān)關(guān)系, 且每個(gè)站位的物種累積曲線均未達(dá)到飽和。分析發(fā)現(xiàn), 假設(shè)各站位40 L水所獲得的OTU數(shù)量為100%,則10 L 水所獲得的平均OTU 數(shù)量為64.1%, 20 L 水為81.7%, 而30 L 水為92.3%(圖2, 表1)。采樣量越大, 可能獲得的OTU 數(shù)量就越多。

圖2 各站位真核微生物物種累積曲線Fig. 2 The accumulation curve of microeukaryotes collected from each station

所有站位不同采樣量下所獲的OTU 數(shù)量的單因素方差分析(one-way ANOVA, 方差齊性檢驗(yàn) P=0.108, 符合正態(tài)分布)顯示, 采樣量對(duì)OTU 數(shù)量存在顯著影響。10 L 水所獲得的OTU 數(shù)量顯著少于其他各組(P=0.00～0.02); 20 L 水所獲得的OTU 數(shù)量顯著少于40 L 水組(P=0.017), 但與30 L 組沒有顯著差異; 30 L 組與40 L 組沒有顯著差異, 采樣量對(duì)OTU數(shù)量存在顯著影響。

表1 各站位10 L、20 L 及30 L 水的OTU 數(shù)量占40 L水OTU 數(shù)量的百分比/%Tab. 1 Percentage of OTU number obtained from 10 L,20 L, and 30 L seawater samples in that obtained from 40 L seawater samples

所有站位的不同采樣量下的ACE 指數(shù)的單因素方差分析(方差齊性檢驗(yàn)P=0.930, 符合正態(tài)分布)顯示, 采樣量對(duì)ACE 指數(shù)存在顯著影響(表2)。10 L組的ACE 指數(shù)顯著少于30 L 和40 L 組(P=0.001～0.006); 20 L 組的ACE 指數(shù)與30 L、40 L 組沒有顯著差異; 30 L 組與40 L 組沒有顯著差異, 采樣量對(duì)ACE 指數(shù)存在顯著影響。

表2 各站位10 L、20 L、30 L 及40 L 水的ACE 指數(shù)Tab. 2 ACE index based on the sample sizes of 10 L, 20 L,30 L, and 40 L seawater samples

2.2 群落結(jié)構(gòu)與采樣量的關(guān)系

對(duì)每個(gè)站位4 個(gè)重復(fù)(即4 個(gè)10 L 組)和重復(fù)相加得到的總和(即40 L 組)的真核微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較, 以 Bray-Curtis 距離為基礎(chǔ)的主坐標(biāo)分析(PCoA)顯示, 10 L 組與40 L 組之間在物種組成上重合度很高, 無(wú)明顯差異(圖3)。多元方差分析(Adonis)顯示, 4 個(gè)10 L 組與40 L 組之間的群落差異P 值均大于0.05, 不存在顯著差異。

在 5 個(gè)站位的樣品中, OTUs 主要包括甲藻(Dinophyta)、纖毛蟲(Ciliophora)、不等鞭毛類(Stramenopiles)、有孔蟲類(Rhizaria)、Hacrobia (包括隱藻類Cryptophya 和定鞭藻類Haptophyta)、后鞭毛類(Opisthokonta)和原始色素體類(Archaeplastida)等主要類群以及其他豐度較低的OTUs(圖4, 圖5), 其中Dinophyta 和Ciliophora 同屬于囊泡類(Alveolata)。Alveolata、Stramenopiles 和Rhizaria(SAR 類群)為主要類群, 在所有樣品中的平均OTU 數(shù)量依次占總數(shù)量的63.3%、10.8%和10.0%, 平均序列數(shù)依次占總數(shù)量的70%、4.0%和11.4%。

圖3 四個(gè)10 L 重復(fù)和40 L 之間的群落相似性Fig. 3 Similarities between communities obtained from the 40 L seawater and each of 10 L seawater samples

圖4 所有站位主要類群的相對(duì)豐度Fig. 4 The proportions of the OTUs and sequences of major taxonomic groups

圖5 所有站位主要類群的豐度Fig. 5 Number of OTUs and sequences of major taxonomic groups

2.3 優(yōu)勢(shì)種和稀有種與采樣量的關(guān)系

序列數(shù)占該樣品總序列數(shù)1%及以上的OTU 被劃為優(yōu)勢(shì)OTU, 序列數(shù)占該樣品總序列數(shù)0.1%及以下的OTU 被劃為稀有OTU。

在數(shù)量上, 優(yōu)勢(shì)OTU 數(shù)量隨采樣量的增加無(wú)明顯變化, 稀有OTU 的數(shù)量隨采樣量的增加而增加(表3)。在數(shù)量占比上, 總和(40 L)中優(yōu)勢(shì)OTU 占OTU 總數(shù)目的比值小于各個(gè)重復(fù)(10 L), 且優(yōu)勢(shì)OTU 占OTU 總數(shù)目的比值在各站位不同重復(fù)之間無(wú)顯著差異, 在各個(gè)重復(fù)與總和之間存在顯著差異(P=0.01～0.04); 總和中稀有OTU 占OTU 總數(shù)目的比值大于各個(gè)重復(fù), 且稀有OTU 占OTU 總數(shù)目的比值在同一站位不同重復(fù)之間無(wú)顯著差異, 但不同重復(fù)與總和之間均有顯著差異(P=0.00～0.02)。

表3 優(yōu)勢(shì)OTU 和稀有OTU 數(shù)量和數(shù)量占比Tab. 3 Number and proportion of abundant and rare OTUs among the total OTUs

2.4 采樣量對(duì)不同粒級(jí)生物多樣性的影響

選取鑒定到種且匹配度為100% 的OTUs, 根據(jù)對(duì)應(yīng)物種的個(gè)體大小對(duì)其分組(表4)。分析各組豐度與采樣量之間的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體大小的 OTU在不同重復(fù)和重復(fù)總和中均有分布且數(shù)量無(wú)明顯變化(圖6), 未檢獲到采樣量對(duì)不同個(gè)體大小的OTU 豐度的影響。

表4 OTU 及其對(duì)應(yīng)真核微生物類群(屬水平)粒徑Tab. 4 Body sizes of each OTU based on the best BLAST hit at the genus level

圖6 四個(gè)10 L 重復(fù)和40 L 不同粒級(jí)生物序列數(shù)Fig. 6 Sequence number of taxa with different body sizes obtained from the 40 L seawater and each of the 10 L seawater samples

3 討論

關(guān)于采樣量影響微生物多樣性的研究多集中于異質(zhì)化明顯的海底沉積物[28-29], 研究發(fā)現(xiàn), 采樣量對(duì)沉積物中的細(xì)菌、真菌以及小型底棲動(dòng)物的多樣性和群落組成有顯著影響[30-32]。在Nascimento 等人的研究中, 隨著采樣量的增加, 原生生物的群落組成趨于穩(wěn)定, 表明在評(píng)估沉積物中的生物 β-多樣性時(shí), 采樣量是關(guān)鍵影響因素[28]。

與沉積物不同, 關(guān)于采樣量對(duì)異質(zhì)性低的水體中真核微生物的影響的研究較少。已有的海洋水體真核微生物多樣性研究中, 近岸站位的采樣量多至40 L[19], 少則300 mL[9], 這與采樣地的水體渾濁度和真核微生物豐度有關(guān)[33]。通常情況下, 采樣量越大,可能獲得的真核微生物物種越多。本研究發(fā)現(xiàn), 隨著采樣量增加, 呂宋海峽水體中的真核微生物OTU 數(shù)量和ACE 指數(shù)顯著增加, 但當(dāng)采樣量達(dá)到20 L 時(shí),ACE 指數(shù)與采樣量之間不再存在顯著相關(guān)性, 20 L組的OTU 數(shù)量與30 L 組也無(wú)顯著差異, 而且隨采樣量增加, 主要類群的種類和相對(duì)豐富度比例即真核微生物群落結(jié)構(gòu)并無(wú)顯著變化。

除了考慮采樣量的大小, 野外采樣時(shí)還需考慮采樣時(shí)間對(duì)樣品質(zhì)量的影響。當(dāng)采樣地水體較混濁時(shí), 濾膜易被堵塞, 將極大地延長(zhǎng)過(guò)濾時(shí)間。而一旦過(guò)濾時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 會(huì)造成水體中DNA 和RNA 的過(guò)多降解, 因此, 野外采樣過(guò)濾時(shí)間一般控制在30 分鐘之內(nèi)[34]。在實(shí)際采樣過(guò)程中, 應(yīng)同時(shí)考慮樣品過(guò)濾時(shí)間, 根據(jù)采樣地水體的渾濁程度和真核微生物豐度確定合適的采樣量。

在本研究中, 各站位不同重復(fù)的豐富OTU 數(shù)量穩(wěn)定, 各重復(fù)中豐富OTU 數(shù)目占全部數(shù)目的比例隨采樣量的增加而降低, 而稀有種OTU 數(shù)占全部OTU數(shù)量的比例隨著采樣量增加而增加, 表明優(yōu)勢(shì)種更易檢獲, 小采樣量時(shí)已基本檢獲了全部的優(yōu)勢(shì)種, 隨著采樣量增加, 更多的稀有種被檢獲。微生物群落一般由少數(shù)優(yōu)勢(shì)種和大量稀有種構(gòu)成[19], 稀有種因其龐大的數(shù)量和高度的多樣性很難被全部檢測(cè)到[35]。

與傳統(tǒng)分類學(xué)方法相比, 高通量測(cè)序能夠高效地獲取環(huán)境中的微生物多樣性, 可檢測(cè)到因豐度較小而難以觀察到的稀有種[36]。鑒于其高度的靈敏性,PCR 過(guò)程和數(shù)據(jù)處理的細(xì)微差別能夠造成截然不同的分類結(jié)果, 因此, 在評(píng)估樣品的真核微生物多樣性時(shí), 選擇一個(gè)可信的實(shí)驗(yàn)流程和分類標(biāo)準(zhǔn)尤為重要[20]。首先, 本研究選用的擴(kuò)增引物為真核生物通用引物, 擴(kuò)增區(qū)域?yàn)榫幋a真核生物核糖體小亞基RNA V4 區(qū)的DNA, 該區(qū)域較為保守, 能夠保證屬級(jí)水平的精確鑒定[27]。其次, 為了獲得更全面的真核微生物物種信息, 每個(gè)重復(fù)樣品設(shè)置三個(gè)PCR 重復(fù), 擴(kuò)增完成后合并PCR 產(chǎn)物并送測(cè)。在后期數(shù)據(jù)處理時(shí), 選擇 97%相似度聚類[37], 以保證獲得真實(shí)物種信息,同時(shí)減少因更高相似度產(chǎn)生的單一序列比例, 由此提高了分類效率。

4 總結(jié)

增加采水量可檢獲更多的OTU, 但當(dāng)采水量達(dá)到20 L 時(shí), OTUs 增加的速率減緩, 與更大體積水樣檢獲的群落多樣性指數(shù)無(wú)顯著差異。隨著采水量增加, 更多的稀有OTUs 被檢獲, 而豐富的OTUs 數(shù)量變化不顯著, 采水量對(duì)真核微生物群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。綜合考慮樣品的可得性和現(xiàn)場(chǎng)處理時(shí)間的影響, 采集20 L 水所獲得的物種豐富度和群落構(gòu)成可基本反映這一寡營(yíng)養(yǎng)海域的真核微生物多樣性。

致謝: 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所南峰、任強(qiáng)和黃平平協(xié)助樣品采集, 謹(jǐn)致謝忱。