孫樂妮，郭迎雪，侯雪婷，莊杰，楊章澤，陳兆進(jìn)，田偉

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥230036；2.南陽師范學(xué)院農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽473061；3.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京210042）

由于化肥、農(nóng)藥的大量施用，工業(yè)廢水污染、礦山開采以及重金屬大氣沉降增加，我國土壤重金屬污染日趨嚴(yán)重[1]。據(jù)2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，我國土壤污染以鎘（Cd）污染為主，Cd點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)7.0%[2]。土壤中的Cd不僅破壞農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，還會積累于植物體內(nèi)，威脅糧食和食品安全，最終嚴(yán)重危害人體健康。在我國人均耕地資源有限的情況下，可實(shí)現(xiàn)“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”的重金屬污染土壤原位鈍化修復(fù)技術(shù)已成為適合我國大面積中低污染土壤修復(fù)的最理想技術(shù)[3]。一些天然礦物材料、金屬及金屬氧化物、磷酸鹽類等人工材料在原位鈍化土壤重金屬中起到一定效果[4]。但繼續(xù)探尋能改善土壤生態(tài)環(huán)境、環(huán)境友好的新型生物類鈍化劑，對于修復(fù)重金屬污染土壤、保障農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)具有重要意義。

重金屬固定細(xì)菌是一類可通過吸附、富集、沉淀、氧化還原等多種機(jī)制降低土壤中重金屬的生物有效性，減少其在土壤中遷移的微生物[5-6]。某些根際細(xì)菌細(xì)胞壁含有的羧基、羥基、氨基、磷酸基團(tuán)等官能團(tuán)能與金屬離子配位絡(luò)合，這有利于吸附重金屬陽離子，降低土壤中重金屬的遷移和轉(zhuǎn)化[7-9]。關(guān)于重金屬吸附固定微生物的篩選及其固定重金屬、阻控作物吸收的研究已逐漸引起關(guān)注[10-13]，在盆栽條件下應(yīng)用重金屬固定微生物阻控辣椒[12]、水稻[13]、芥菜[14]、青菜[15]等對重金屬的吸收研究已見報道，但仍需繼續(xù)加強(qiáng)對重金屬吸附固定微生物的篩選，用來阻控多種植物吸收積累重金屬，以實(shí)現(xiàn)在中低污染土壤中安全生產(chǎn)農(nóng)作物。

小麥?zhǔn)俏覈蠹Z食作物之一，許多研究表明，Cd極易在小麥中積累，對小麥生長產(chǎn)生毒害作用，并使籽粒中Cd含量超標(biāo)[16-18]。重金屬脅迫下接種細(xì)菌對小麥耐受重金屬、吸收重金屬能力的研究已備受關(guān)注[19-21]。此外，Wang等[22]還發(fā)現(xiàn)接菌Ralstonia eutrophaQ2-8和Exiguobacterium aurantiacumQ3-11在Cd、As復(fù)合污染土壤中能夠降低小麥籽粒Cd含量12%～32%和As含量9%～29%。韓輝等[23]篩選出的重金屬固定細(xì)菌巨大芽孢桿菌N3和液質(zhì)沙雷氏菌H12，在水培條件下能顯著降低小麥根和地上部Cd、Pb含量。但目前關(guān)于重金屬固定細(xì)菌在土壤環(huán)境下阻控小麥籽粒吸收Cd的研究還甚少，此外缺少不同小麥品種和不同污染程度對細(xì)菌阻控小麥吸收重金屬效果的研究。因此，本研究從農(nóng)田根際土壤分離篩選Cd固定細(xì)菌，探究菌株在不同污染環(huán)境下阻控兩種低積累型小麥Cd轉(zhuǎn)運(yùn)及吸收積累Cd的效應(yīng)，為利用重金屬污染農(nóng)田安全生產(chǎn)小麥提供重要菌種資源和技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根際土壤樣品采自安徽省合肥市肥東縣電鍍工業(yè)園附近農(nóng)田（31°49′47.17″N，117°23′54.60″E）的玉米根際土壤，將采集的土壤樣品裝入無菌袋中，于4℃冰箱保存，并在24 h內(nèi)用于Cd抗性細(xì)菌的分離。

小麥品種為文獻(xiàn)報道的Cd低積累型小麥品種揚(yáng)麥158（紅麥）和西農(nóng)979（白麥）[24-25]，購自安徽春澤種業(yè)有限公司。

盆栽供試土壤為安徽省合肥市安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)萃園區(qū)土壤，基本理化性質(zhì)為：速效鉀0.23 mg·kg-1，有效磷38.86 mg·kg-1，銨態(tài)氮10.30 mg·kg-1，水溶態(tài)Cd 0.02 mg·kg-1，總Cd 0.28 mg·kg-1。

LB培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，瓊脂20.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7.0，121℃高壓滅菌25 min。固體培養(yǎng)基需加2.0%的瓊脂后滅菌。

1.2 Cd耐性固定細(xì)菌菌株的分離篩選

稱取10 g土壤樣品，無菌操作下于已滅菌的100 mL生理鹽水三角瓶中制備成土壤懸液，150 r·min-1、28℃搖床振蕩2 h后，將土壤懸液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4不同濃度。吸取100μL土壤懸液涂布在含100 mg·L-1Cd2+（CdCl2·2.5H2O）的LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落劃線接種到LB平板上，直至獲得純菌株。菌株用40%甘油保存于-20℃冰箱中備用。

將分離菌株接種于LB培養(yǎng)液（pH 7.2）培養(yǎng)至對數(shù)期后，按5%接種量接入含50 mg·L-1Cd2+的LB培養(yǎng)基，28℃搖床150 r·min-1培養(yǎng)3 d[10]。同時設(shè)置不接菌處理作為對照，每個處理3次重復(fù)。收集樣品于8 000 r·min-1離心10 min，上清液過0.22μm濾膜后，測定溶液殘余Cd2+濃度。Cd2+去除率（R）：

式中：C0為未接菌處理上清液Cd2+濃度，mg·L-1；Ce為接菌處理上清液Cd2+濃度，mg·L-1。

將菌株劃線接種到含不同濃度Cd2+（100、175、200、225、300 mg·L-1）的固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3～5 d，觀察菌株能否生長，以判斷菌株對Cd2+的耐受性。

1.3 菌株鑒定

參照《生工細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒》方法提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA片段。PCR體系及擴(kuò)增方法參考Sun等[26]方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序，用Genbank數(shù)據(jù)庫中的模式菌株16SrDNA序列進(jìn)行相似性比對分析，并用軟件Clustal X和MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 細(xì)菌YM4對Cd的吸附及其重金屬分布

將分離菌株接種于LB培養(yǎng)液（pH 7.0）中培養(yǎng)至對數(shù)期后，按5%接種量接入含不同濃度Cd2+（Cd2+終濃度為50、75、100 mg·L-1）的LB培養(yǎng)基中，28℃搖床150 r·min-1培養(yǎng)3 d。同時設(shè)置不接菌處理作為對照組，每個處理3次重復(fù)。細(xì)胞體內(nèi)積累和表面吸附的重金屬含量參照文獻(xiàn)[27-28]方法進(jìn)行。將菌液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，10 000 r·min-1離心10 min取上清。向離心的菌體樣品中加入2.5 mL 0.5 mol·L-1的EDTA洗脫液，混勻后，10 000 r·min-1離心10 min取上清，反復(fù)用EDTA洗滌菌體細(xì)胞3次，合并的上清液中Cd2+即為菌體胞外吸附。將菌體重懸浮在稀HNO3和0.1%TritonX-100中，95℃水浴2 h，待細(xì)胞裂解完全，溶液變澄清后，12 000 r·min-1離心10 min取上清，上清液中Cd2+即為菌體胞內(nèi)富集。洗脫樣品與消解液用去離子水定容后用原子吸收分光光度儀測定Cd2+含量。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

式中：C0為未接菌處理上清液Cd2+濃度，mg·L-1；Ce為接菌處理上清液Cd2+濃度，mg·L-1；V為離心培養(yǎng)液的體積，L；W為離心菌體的干質(zhì)量，g；Cn為EDTA洗脫液或消解液中Cd2+濃度，mg·L-1；Vn為EDTA洗脫液或消解液體積，L。

1.5 傅里葉紅外光譜分析

將LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，分別以5%接種量接入含不同濃度Cd2+（0、50、75、100 mg·L-1，分別記作Cd0、Cd50、Cd75和Cd100）的LB培養(yǎng)基，28℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)3 d后，離心收集菌體。將不同處理的菌體進(jìn)行真空冷凍干燥，以1∶99的質(zhì)量比與干燥的KBr混合研磨，利用磨具將其壓成薄片，用傅里葉紅外光譜分析儀進(jìn)行檢測，并參考Huang等[9]和林曉燕等[29]的方法分析菌體吸附Cd2+過程中參與的細(xì)胞表面官能團(tuán)。

1.6 YM4對小麥各組織Cd吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

將供試盆栽土壤自然風(fēng)干，過篩，混合均勻后按每盆4.5 kg分裝于盆缽中。參考《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（GB 15618—2018），外源添加Cd2+（CdCl2·2.5H2O）分別設(shè)置0、0.3、0.6 mg·kg-13個水平（記作Cd0、Cd0.3、Cd0.6），土壤陳化1個月。將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌體細(xì)胞離心收集，洗滌2次后重懸于生理鹽水中制備成1×108CFU·mL-1菌懸液。挑選顆粒飽滿、催芽效果一致的露白種子置于菌懸液中浸種2 h后，每盆種植4粒，且將5 mL菌懸液滴加到每盆種子上。以浸種生理鹽水及接種生理鹽水作為對照處理。小麥生長至返青期時每盆再接種5 mL菌懸液，澆灌于小麥根部土壤。所有處理均設(shè)置3次重復(fù)。定期對盆栽小麥?zhǔn)┘拥攘克?，保持水分含量至田間持水量的70%左右，于次年成熟期收獲。小麥生長時間為10月下旬至次年5月中旬。

將小麥從盆中整株取出，根、莖葉、麥穗分別采集，用去離子水將根部沖洗干凈。麥穗脫殼后，麥粒自然曬干至恒質(zhì)量，根、莖葉和殼烘干至恒質(zhì)量。將干燥的根、莖葉、麥殼和麥粒分別用粉碎機(jī)粉碎，經(jīng)HNO3∶HClO4（優(yōu)級純，V∶V=87∶13）混合酸液浸泡，XT-9916微波消解儀消解后，用原子吸收儀測定Cd含量。根據(jù)樣品質(zhì)量換算出小麥各組織Cd含量。

Cd富集系數(shù)、轉(zhuǎn)移系數(shù)計算方法如下：

富集系數(shù)（BF）=各組織Cd含量（mg·kg-1）/土壤Cd含量（mg·kg-1）

轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF）=地上部各組織Cd含量（mg·kg-1）/根部Cd含量（mg·kg-1）

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗數(shù)據(jù)均用Excel 2007、SPSS17.0進(jìn)行處理和分析。采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan法進(jìn)行多重比較分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd耐性固定細(xì)菌菌株篩選及鑒定

采用稀釋涂布平板法于Cd抗性平板中共篩選出Cd抗性菌株8株，其對Cd的吸附能力見圖1。8株菌對Cd的去除能力不同，去除率在17.6%～58.9%。這些細(xì)菌對Cd的去除可能涉及到絡(luò)合反應(yīng)、物理吸附或胞內(nèi)擴(kuò)散等。菌株YM4具有最強(qiáng)的Cd去除能力，去除率達(dá)58.9%，耐Cd2+濃度達(dá)到225 mg·L-1。YM4菌落外觀呈圓形，邊緣光滑，淡黃色。對16SrDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1 405 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，測序結(jié)果提交至GenBank，登錄號為MK355633。經(jīng)序列比對，選取13株模式菌株序列采用N-J（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2可知，YM4與假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌相似性較高，其中與Pseudomonasprotegens同源性高達(dá)99.8%。因此，可確定菌株YM4為假單胞菌（Pseudomonassp.）。

圖1菌株在溶液中對Cd的去除效果Figure 1 The removal effect of Cd by strains in solution

2.2 細(xì)菌YM4對Cd的生物積累能力及其重金屬分布

以未接菌處理作為對照，研究細(xì)菌YM4在生長過程中對Cd的生物積累能力。由圖3可知，在50、75、100 mg·L-1Cd2+濃度下，YM4的總吸附量分別為9.03、14.10、26.48 mg·g-1，胞外吸附量分別為6.93、10.46、20.82 mg·g-1，占總吸附量的74.22%～78.63%。胞內(nèi)積累量相對較少，僅占總吸附量的21.37%～25.78%。隨著初始重金屬濃度的增加，YM4總吸附量、胞外吸附量都會顯著升高，而胞內(nèi)積累量也會有一定增多。YM4對Cd的去除依靠胞外吸附和胞內(nèi)積累的共同作用，但以胞外吸附為主，這可能是細(xì)菌主要將Cd吸附在細(xì)胞表面，阻止或減少其向細(xì)胞內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，是細(xì)菌自身保護(hù)的一種解毒機(jī)制。

圖3不同Cd2+濃度下YM4對Cd2+的生物積累能力Figure 3 Bioaccumulation capacity of Cd2+by YM4 at different concentrations of Cd2+

圖2基于菌株YM4 16SrRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of strain YM4 based on 16SrRNA gene sequences

2.3 吸附Cd2+前后YM4的傅里葉紅外光譜分析

采用傅里葉紅外光譜分析細(xì)菌YM4吸附Cd2+前后細(xì)胞表面官能團(tuán)變化（圖4）。YM4在吸附Cd2+后主要有多個位置吸收峰發(fā)生偏移，其中在多個Cd2+濃度處理下，代表締合羥基（─OH）或─NH的吸收帶由3 407.60 cm-1向高波長處（3 409.53 cm-1）偏移；代表烷基中的─CH吸收峰由2 925.48 cm-1向低頻偏移；代表羧基、酰胺I帶C═O伸縮振動的吸收峰向高波數(shù)1 654.62 cm-1偏移；代表—NH伸縮的吸收峰由1 544.70 cm-1向1 540.85 cm-1偏移；代表磷酸基團(tuán)的吸收峰由1 081.87 cm-1向高位發(fā)生偏移。此外，代表醚類C─O─C伸縮和─M─O或O─M─O（M為金屬離子）和P─H鍵的吸收帶也發(fā)生不同程度上的偏移。因此，我們推測YM4細(xì)胞表面的─OH、─NH、─CH、C═O、羧基及磷酸基團(tuán)、─M─O等是吸附Cd的主要功能位點(diǎn)。

2.4 YM4對小麥Cd含量的影響

通過盆栽試驗研究接菌YM4對紅麥、白麥兩個小麥品種根、莖葉、麥殼以及籽粒Cd含量的影響。由圖5可知，在Cd0和Cd0.3處理下，接菌YM4使兩種小麥莖葉、麥殼、籽粒Cd含量均顯著下降（P＜0.05），其中，紅麥Cd含量降幅分別為16.48%～17.79%、14.24%～35.52%、26.79%～62.24%，白麥Cd含量降幅分 別 為20.00%～46.05%、24.44%～42.22%、26.33%～28.99%；在Cd0.6處理下，與對照組相比，接菌YM4均顯著降低小麥植株各部位對Cd的吸收（P＜0.05），接菌處理使根、莖葉、麥殼、籽粒的Cd含量分別顯著降低20.26%、11.31%、10.12%、45.31%（紅 麥）和21.28%、32.04%、34.50%、25.27%（白麥）。特別注意的是，接菌YM4能使白麥和紅麥中Cd超標(biāo)處理的籽粒Cd含量低于或接近《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》（GB 2762—2017）規(guī)定的Cd限量標(biāo)準(zhǔn)（0.1 mg·kg-1）。由此可見，與未接菌對照相比，接菌YM4可顯著降低兩種小麥地上部Cd含量，推測可能是接種YM4能影響Cd從小麥地下向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。

由圖5可知，隨著土壤中Cd濃度的增加，兩種小麥對Cd的積累呈遞增趨勢。在不接菌處理組，Cd0.3和Cd0.6處理組根、莖葉、麥殼和籽粒中Cd濃度均比Cd0處理顯著增多（P＜0.05），其中Cd0.6處理組比Cd0處理組分別增加90.97%、95.15%、56.67%、75.06%（白麥）和95.65%、82.63%、63.37%、115.40%（紅麥）。在接菌處理組，Cd0.3和Cd0.6處理組根、莖葉和麥殼Cd濃度均比Cd0處理顯著增多（P＜0.05），Cd 0.6處理組白麥和紅麥籽粒Cd濃度比Cd0處理分別顯著增加78.39%和61.23%（P＜0.05）。

兩種小麥體內(nèi)Cd含量因品種差異有所不同。根部是富集積累Cd的主要部位，白麥根部Cd積累量大于紅麥，且在Cd0.6處理時達(dá)顯著差異，說明在較高濃度Cd污染下，白麥根部更易吸收積累Cd。在不接菌和接菌處理組，紅麥莖葉和籽粒Cd含量均顯著高于白麥，其中紅麥籽粒Cd含量比白麥增加45.85%～187.28%，表明紅麥可能對Cd具有更強(qiáng)的向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。接菌處理使紅麥籽粒Cd含量較對照下降26.79%～62.24%，下降幅度遠(yuǎn)高于白麥（25.27%～28.99%）。因此，為了保障小麥的安全生產(chǎn)，在無鈍化劑施用情況下，紅麥（揚(yáng)麥158）更適合種植于無污染土壤。

圖4 YM4吸收Cd2+前后的紅外光譜圖Figure 4 FTIRspectrumof YM4 before and after adsorption of Cd2+

圖5 YM4對小麥根部、莖葉、麥殼和籽粒中Cd含量的影響Figure 5 Effects of YM4 on Cd content in roots,straws,hulls and grains

綜上所述，接菌YM4可顯著降低白麥和紅麥地上部Cd含量，使紅麥籽粒Cd含量下降幅度大于白麥，但紅麥籽粒Cd積累能力仍高于白麥。在農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險篩選值（0.6 mg·kg-1）以下，接種YM4對阻控白麥和紅麥吸收Cd，保障小麥安全生產(chǎn)具有潛在應(yīng)用價值。但高于污染篩選值時，YM4則不適用于紅麥。接種功能微生物和選擇適宜低積累型品種，是較高污染土壤原位修復(fù)的重要措施。

2.5 YM4對小麥Cd富集系數(shù)與轉(zhuǎn)移系數(shù)的影響

通過表1可知，小麥根、麥殼、莖葉部Cd富集系數(shù)分別隨著外源添加Cd2+濃度的增加而顯著降低，而小麥各部位Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)沒有呈現(xiàn)規(guī)律性變化。小麥根部Cd富集系數(shù)最高，其次為莖葉，籽?；螓湚じ患禂?shù)較低。在未接菌對照組中比較兩種小麥，發(fā)現(xiàn)白麥莖葉、籽粒Cd富集系數(shù)分別比紅麥顯著降低8.00%～15.91%和37.14%～64.71%（P＜0.05）。白麥莖葉、麥殼、籽粒中Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)分別比紅麥顯著降低12.33%～18.57%、14.73%～31.25%和41.74%～66.97%（P＜0.05），表明白麥對Cd的富集及轉(zhuǎn)運(yùn)能力小于紅麥，屬于低積累型品種。接種YM4后，在3種不同濃度Cd2+處理下，接菌處理均能顯著降低兩種小麥莖葉、籽粒和麥殼富集系數(shù)（P＜0.05），以及降低白麥莖葉、籽粒和麥殼Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)和紅麥籽粒Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)（P＜0.05），且在0、0.3 mg·kg-1Cd2+處理時，接菌處理也顯著降低紅麥莖葉和麥殼轉(zhuǎn)移系數(shù)（P＜0.05）?？傊溩蚜d的富集、轉(zhuǎn)運(yùn)能力低于紅麥，接菌處理能降低籽粒對Cd的富集、轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

表1 YM4對土壤-小麥體系中Cd富集系數(shù)與轉(zhuǎn)移系數(shù)的影響Table 1 Effects of YM4 on Cd bioaccumulation factor and transfer factor in soil-wheat system

3 討論

原位鈍化修復(fù)技術(shù)是適合重金屬中低污染土壤的理想修復(fù)技術(shù)。新興的微生物鈍化修復(fù)材料已引起廣大研究者的關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)的能吸附固定重金屬的微生物主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）[12]、無色桿菌屬（Achromobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）[10]、沙雷氏菌屬（Serratia）[23]、腸桿菌屬（Enterobacter）[30]、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）[31]。這些微生物能夠在高濃度的重金屬環(huán)境中生存，并通過吸附、沉淀、吸收等多種方式固定重金屬，對重金屬污染土壤的修復(fù)起重要作用。一些微生物可以通過細(xì)胞表面的陰離子基團(tuán)或胞外分泌物來吸附固定重金屬[7，9-10，30]。張旭輝等[10]分離到的一株P(guān)seudomonassp．ZXH23在含Cd2+50 mg·L-1LB培養(yǎng)基中對Cd的去除率為33.7%。Xu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，Enterobacter cloacaeTU在Cd濃度大于20 mg·L-1時，對Cd的去除方式以胞外吸附為主，且隨Cd濃度增加，胞外吸附量逐漸增加，但胞內(nèi)積累量幾乎不變。Huang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus cereusRC-1在重金屬濃度大于20 mg·L-1時，去除方式也以胞外吸附為主，但除胞外吸附量外，胞內(nèi)積累量也隨Zn、Pb和Cd濃度增加有一定的增加。本研究篩選到的菌株P(guān)seudomonassp.YM4在含Cd 50 mg·L-1LB培養(yǎng)基中對Cd的去除率為58.9%，該菌以胞外吸附為主要方式，隨Cd濃度增加，胞外吸附和胞內(nèi)吸收積累量均會增加。細(xì)菌的胞外吸附和胞內(nèi)積累會受不同微生物種類、重金屬種類及離子濃度的影響[10，28]。

小麥重金屬食品安全已備受關(guān)注[17-18，33]。研究者們曾采取多種化學(xué)鈍化劑降低小麥重金屬含量并取得一定效果[34-35]。但化學(xué)鈍化劑的長期過量施用可能會引起土壤二次污染，改變土壤理化性質(zhì)，導(dǎo)致土壤生態(tài)系統(tǒng)惡化[36]。近年來基于重金屬固定細(xì)菌的生物鈍化修復(fù)技術(shù)已引起關(guān)注。Rajkumar等[14]篩選的Ni耐性固定細(xì)菌BacillusmegateriumSR28C使芥菜根部和地上部Ni含量降低了52%和15%。Han等[15]分離到的重金屬固定細(xì)菌Bacillus megateriumN3和Serratia liquefaciensH12使青菜葉部Cd含量降低76.5%～79.7%，Pb含量降低76.3%～83.5%。本研究篩選到的重金屬固定細(xì)菌Pseudomonassp.YM4使兩種小麥籽粒Cd含量、富集系數(shù)、轉(zhuǎn)移系數(shù)降低，且Cd超標(biāo)處理的籽粒Cd含量低于或接近小麥?zhǔn)称钒踩南蘖繕?biāo)準(zhǔn)。結(jié)合前人研究，本研究也進(jìn)一步證實(shí)重金屬固定細(xì)菌的篩選是一種快速獲得阻控作物吸收重金屬的功能菌株方式。重金屬固定細(xì)菌能阻控植物對重金屬的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，一方面與細(xì)菌通過細(xì)胞壁吸附重金屬、胞外分泌物絡(luò)合、沉淀等吸附固定重金屬，降低有效態(tài)重金屬含量有關(guān)[6，14]，另一方面微生物與植物之間發(fā)生復(fù)雜的互作作用，微生物能正面或負(fù)面調(diào)控植物體內(nèi)某些功能基因的表達(dá)，從而改變重金屬在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)植物的抗逆性[37-38]。Khanna等[39]研究發(fā)現(xiàn)番茄接種根際細(xì)菌假單胞菌和伯克霍爾德菌降低了Cd轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)，減少了對Cd的吸收積累。加強(qiáng)功能菌與小麥的互作研究，研究細(xì)菌對小麥Cd轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)功能基因表達(dá)的影響，有望闡明微生物阻控小麥吸收Cd的分子機(jī)理，為保障糧食作物安全生產(chǎn)提供重要理論基礎(chǔ)。

近年來針對小麥不同積累能力品種的篩選研究備受關(guān)注[40]。艾金華等[25]及李樂樂等[41]在Cd污染土壤種植多個小麥品種，通過對小麥籽粒Cd富集能力及Cd吸收能力分析，篩選出西農(nóng)979屬于低Cd累積品種。劉艷陽等[24]采用水培方法以地上部Cd積累量為篩選指標(biāo)，將25個小麥品種劃分為Cd高、中、低3種積累型，其中揚(yáng)麥158被認(rèn)定為Cd低積累型品種。本研究以前人報道的低積累型小麥品種西農(nóng)979和揚(yáng)麥158為供試材料，研究發(fā)現(xiàn)在同一Cd濃度下，不論接菌組或不接菌對照組，白麥（西農(nóng)979）籽粒的Cd含量、轉(zhuǎn)移系數(shù)和富集系數(shù)均明顯低于紅麥（揚(yáng)麥158），進(jìn)一步證實(shí)白麥（西農(nóng)979）為低Cd積累型小麥品種。本研究中紅麥籽粒Cd積累能力明顯較高，這與劉艷陽等[24]篩選揚(yáng)麥158為Cd低積累型的結(jié)論不同，分析可能原因是其采用水培試驗，僅依靠地上部Cd含量，而不是籽粒Cd含量作為篩選依據(jù)。建議對植物品種不同積累型的篩選應(yīng)該以可食用部位重金屬含量作為標(biāo)準(zhǔn)。YM4接種紅麥Cd富集量下降幅度大于白麥，但并未使紅麥籽粒Cd含量達(dá)到限量標(biāo)準(zhǔn)，說明白麥和紅麥兩種小麥對細(xì)菌接種的反應(yīng)效果不盡相同，一方面不同基因型品種決定了植物對重金屬的吸收能力，此外，這可能與功能菌與不同基因型品種的復(fù)雜互作關(guān)系有關(guān)，這種現(xiàn)象也在Neiverth等[42]對小麥的研究中發(fā)現(xiàn)。因此建議在研究微生物對作物應(yīng)用效果研究時，應(yīng)擴(kuò)大供試品種量，充分考慮到不同作物品種對菌株的反應(yīng)，以明確菌株的適宜匹配品種。

張靜靜等[43]研究發(fā)現(xiàn)1%褐煤和1%生物炭處理能有效阻控鄭麥379籽粒對Cd的積累，降幅達(dá)56.47%和38.89%。姜洋等[44]發(fā)現(xiàn)鈣鎂磷肥配施石灰處理能有效鈍化土壤Cd，降低小麥籽粒Cd含量。本研究中白麥接種細(xì)菌YM4后Cd超標(biāo)處理的籽粒Cd含量下降到0.1 mg·kg-1以下，達(dá)到食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)。但對于紅麥品種，在0.6 mg·kg-1處理時接菌處理雖顯著降低了籽粒Cd含量，降幅高達(dá)45.31%，但并未使Cd含量低于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》（GB 2762—2017）小麥的限量標(biāo)準(zhǔn)（0.1 mg·kg-1）。因此，進(jìn)一步開展功能細(xì)菌與某些化學(xué)鈍化劑聯(lián)合施用的研究，配合選用低積累型小麥品種，有望獲得比單一菌劑或鈍化劑更好的阻控效果，對阻控小麥吸收重金屬及糧食安全生產(chǎn)具有潛在應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

（1）篩選到的Cd耐性固定菌株P(guān)seudomonassp.YM4可通過胞外吸附和胞內(nèi)積累作用去除Cd，且以胞外吸附為主要方式。

（2）接種YM4在3種Cd濃度下都能阻控兩個小麥品種體內(nèi)Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)，顯著降低小麥籽粒Cd含量至低于或接近食品安全國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

（3）YM4接種使兩個小麥品種Cd含量下降幅度不同，接種YM4使紅麥（揚(yáng)麥158）籽粒Cd含量下降幅度更大，但白麥（西農(nóng)979）籽粒Cd富集量、富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)明顯低于紅麥。

（4）隨著土壤Cd濃度增加，接菌YM4與不接菌處理組，兩個品種小麥吸收Cd含量增多。