包小平 賀媛媛 孫倩倩 魏益民 郭波莉

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

牛肉因其高蛋白質(zhì)、低脂肪以及含有人體所需的各種營養(yǎng)素，如維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等受到消費(fèi)者的青睞[1]。目前我國已是世界第三大牛肉生產(chǎn)國[2]，國內(nèi)外銷量逐漸增長。食品來源地與其品質(zhì)和質(zhì)量安全密切相關(guān)。2006年歐盟針對(duì)地標(biāo)農(nóng)產(chǎn)品認(rèn)證制定了3 種標(biāo)簽，原產(chǎn)地名稱保護(hù)(protected denomination of origin，PDO)、地理標(biāo)志保護(hù)(protected geographical indication，PGI)、傳統(tǒng)特色保證(traditional specialty guaranteed，TSG)[3]。2007年我國制定了《農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志管理辦法》以規(guī)范和促進(jìn)我國名優(yōu)特地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品的品牌建設(shè)[4]。

在全球化和國際食品貿(mào)易的背景下，一些不良商家受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，常以一般牛肉冒充名優(yōu)、特色的地理標(biāo)志牛肉產(chǎn)品，致使市場秩序混亂，消費(fèi)者合法權(quán)益受損。因此，急需科學(xué)的技術(shù)手段在牛肉原料生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)藏、流通等環(huán)節(jié)進(jìn)行檢測和監(jiān)測，提高特色、優(yōu)質(zhì)牛肉產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈的質(zhì)量安全監(jiān)管水平，保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益，增加消費(fèi)者對(duì)牛肉產(chǎn)品的信心。

穩(wěn)定同位素指紋分析是動(dòng)植物食品產(chǎn)地溯源中非常有效的方法之一[5-6]，已被廣泛應(yīng)用于酒類[7-8]、蜂蜜[9-10]、果蔬[11-13]、糧油[14-16]、乳制品[17-18]以及肉類[19-21]等食品的產(chǎn)地溯源。前期穩(wěn)定同位素分析技術(shù)主要用于農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源，隨著研究的不斷深入，國內(nèi)外專家開始探討其對(duì)加工制品原料產(chǎn)地溯源的可行性。研究發(fā)現(xiàn)，意大利面生產(chǎn)鏈中從小麥制成面粉再加工成意大利面的各環(huán)節(jié)中穩(wěn)定碳、氮、氫、氧同位素比率差異變化分別小于0.1‰、0.1‰、1.0‰、0.2‰，表明穩(wěn)定同位素在加工過程無顯著變化[22]。另一項(xiàng)研究通過測定75 min 發(fā)酵面包樣品以及190℃烘焙前后糖餅干樣品的δ13C、δ15N 值發(fā)現(xiàn)，烘烤前后糖餅干及酵母面包的δ13C 或δ15N 值無顯著變化，認(rèn)為烘焙和發(fā)酵2 種常見的食品加工技術(shù)基本不影響谷物食品的碳、氮穩(wěn)定同位素特征[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)，乙醇和香草醇在蒸餾過程中δ13C 均顯著分餾[24-25]，因此在加熱或蒸發(fā)等過程中化學(xué)物質(zhì)中穩(wěn)定同位素會(huì)發(fā)生一定的分餾效應(yīng)。另有研究表明，盡管5 種不同烘干方式對(duì)西湖龍井茶穩(wěn)定碳、氮、氫、氧同位素比率組成有一定影響，但結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法仍可準(zhǔn)確追溯同一產(chǎn)區(qū)不同烘干方式的西湖龍井茶[26]。不同烹飪方法(煮、烤、蒸)會(huì)改變魚肉組分含量及比例，但穩(wěn)定碳、氮同位素分餾＜1‰，魚骨中的穩(wěn)定碳氮同位素值在烹飪過程中無顯著變化[27]。煮制、烤制和煎制前后牛肉中穩(wěn)定碳、氮同位素?zé)o顯著差異，且聚類分析結(jié)果表明，加工和未加工的牛肉按不同地域均被明確分類[28-29]，但上述研究僅比較了生、熟牛肉之間的同位素差異，不同加工時(shí)間對(duì)牛肉穩(wěn)定同位素組成的影響，以及加工副產(chǎn)物(湯渣、烤渣、炸油)中穩(wěn)定同位素的變化尚不清楚。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索牛肉穩(wěn)定碳、氮同位素的分餾效應(yīng)，旨在確證其在牛肉加工半成品及成品原產(chǎn)地溯源應(yīng)用的穩(wěn)定性和有效性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2017年3月分別從內(nèi)蒙古呼倫貝爾市和吉林長春市2 個(gè)地點(diǎn)采集2 種不同飼養(yǎng)方式的牛肉，各采集8 kg 后腿部位牛肉，于-18℃冷凍保存待用。樣品分為兩部分，一部分作為對(duì)照原料樣品，另一部分用于水煮、烤制和油炸3 種典型的烹飪加工，并收集加工樣品和加工副產(chǎn)物，提取牛肉不同組分用于后續(xù)試驗(yàn)。具體烹飪加工試驗(yàn)流程如圖1所示。

圖1 加工試驗(yàn)流程圖Fig.1 The flow chart of beef sample preparation

1.2 主要儀器與設(shè)備

ALPHA1-2LD plus 真空冷凍干燥機(jī)，德國CHRIST公司；QM-3SP2 行星式球磨儀，南京大學(xué)儀器廠；MG-17AC-000AC 電烤箱，佛山順德區(qū)美的微波電器制造有限公司；IsoPrime100 同位素比率質(zhì)譜儀，英國IsoPrime 公司；Conflo Ⅲ稀釋儀，英國IsoPrime 公司；Vario PYRO 元素分析儀，德國Elementar 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 未加工樣品處理方法 取100 g 樣品，切成1 cm×1 cm×1 cm 的小塊，采用真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥60 h，干燥完成后用球磨儀研磨，并采用石油醚(60～90℃沸程)進(jìn)行4 h 脫脂處理，提取脫脂牛肉和粗脂肪，保存待用。

1.3.2 加工樣品處理方法

1)水煮試驗(yàn)。取100 g 牛肉樣品，沿肌纖維垂直方向切成1 cm×1cm×1 cm 的肉塊，置于1 000 mL 圓底燒瓶，加水600 mL，裝回流裝置。依據(jù)預(yù)試驗(yàn)中牛肉沸水煮熟需要30 min，設(shè)定沸水中煮制牛肉的時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30 min。分別取出水煮樣品，并過濾肉湯，得到湯渣，將水煮牛肉樣品和湯渣冷凍干燥、研磨脫脂，待測。每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)。

2)烤制試驗(yàn)。取100 g 牛肉樣品，切成3 cm×4 cm×(1 ～1. 5) cm 的肉塊，于烤箱中架空烘烤，底層用瓷盤接滴落烤渣。依據(jù)預(yù)試驗(yàn)中牛肉180℃烘烤至熟需要30 min，設(shè)定180℃條件下烤制5、10、15、20、25、30 min，分別取烤制牛肉樣品和烤渣，隨后進(jìn)行冷凍干燥、研磨脫脂等處理，待測。每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)。

3)油炸試驗(yàn)。取100 g 牛肉樣品，切成2 cm×3 cm×(1～1.5) cm 的肉塊，置于油鍋中，依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定150℃油炸1、2、3、4、5 min，分別取油炸牛肉和炸油樣品，油炸牛肉進(jìn)行冷凍干燥、研磨脫脂等處理，待測。每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)。

1.3.3 穩(wěn)定碳、氮同位素比率檢測方法 稱取2 mg樣品包裹成球狀放入錫杯(2 mm×3 mm×5 mm)中。采用元素分析儀與同位素比率質(zhì)譜儀聯(lián)用分析穩(wěn)定碳、氮同位素比率。樣品先經(jīng)元素分析儀燃燒管(850℃)燃燒生成CO2和NOX，通過He 以230 mL·min-1的流速轉(zhuǎn)移至還原管(650℃)，再經(jīng)過稀釋儀，最后進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。具體工作參數(shù)如下:

稀釋儀參數(shù)設(shè)置:He 稀釋壓力為4 bar，CO2參考?xì)鈮毫? bar，N2參考?xì)鈮毫? bar。

穩(wěn)定碳、氮同位素比率分別用δ13C‰和δ15N‰表示，δ13C 的國際相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為V-PDB，δ15N 的國際相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為空氣。按照公式進(jìn)行計(jì)算:

式中，δ 表示δ13C 和δ15N；R 分別是13C/12C 或15N/14N。

參考?xì)怏wCO2和N2根據(jù)國際參考標(biāo)準(zhǔn)，以國際原子能機(jī)構(gòu)(international atomic energy agency，IAEA)提供的IAEA-600 咖啡因(δ13CPDB＝-27.77‰±0.043‰)和USGS24(δ13CPDB ＝-16.04‰±0.035‰)校準(zhǔn)碳，IAEA-N-1(δ15Nair＝0.4‰±0.2‰)和IAEA-600 咖啡因(δ15Nair＝1.00‰±0.2‰)校準(zhǔn)氮。δ13C 和δ15N 的檢測精度為0.2‰。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s 多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加工時(shí)間對(duì)牛肉穩(wěn)定碳同位素的影響

2.1.1 水煮時(shí)間對(duì)穩(wěn)定碳同位素的影響 由表1可知，吉林和內(nèi)蒙未加工脫脂牛肉的δ13C 值分別為-10.5‰ 和-23.7‰。這主要是由于牛所食飼料不同導(dǎo)致存在差異，吉林牛主要是以玉米為主的谷物飼料喂養(yǎng)[30]，內(nèi)蒙牛主要以C3牧草為飼料喂養(yǎng)[30]。兩組樣品脫脂牛肉隨著水煮時(shí)間的延長(5～30 min)其δ13C 值與對(duì)照組δ13C 差值均小于0.1‰，不同水煮時(shí)間的脫脂牛肉與對(duì)照組無顯著差異。兩組樣品未加工牛肉粗脂肪δ13C 值分別為-14.4‰和-28.7‰，水煮時(shí)間由5 min 增加至30 min 時(shí)，粗脂肪中δ13C 值無顯著變化，且與對(duì)照組牛肉粗脂肪無顯著差異。水煮5 ～30 min 得到的副產(chǎn)物脫脂湯渣δ13C 值均低于相應(yīng)對(duì)照組牛肉，均值差異小于0.5‰，但水煮后的脫脂湯渣與對(duì)照組δ13C 值之間無顯著差異。

表1 不同水煮時(shí)間對(duì)δ13C 值的影響Table1 The effect of different boiling time on δ13C value /‰

2.1.2 烤制時(shí)間對(duì)穩(wěn)定碳同位素的影響 由表2可知，吉林和內(nèi)蒙兩產(chǎn)地牛肉樣品不同烤制時(shí)間(5 ～30 min)的脫脂牛肉δ13C 值分別-10.5‰和-23.8‰～-23.7‰，與對(duì)照組δ13C 值均無顯著差異。吉林和內(nèi)蒙的牛肉粗脂肪在不同烤制時(shí)間δ13C 值變化較小，其范圍分別介于-14.3‰～-14.2‰和-29.2‰～-28.9‰之間，不同烤制時(shí)間牛肉粗脂肪中的δ13C 值也均無顯著差異。

2.1.3 油炸時(shí)間對(duì)穩(wěn)定碳同位素的影響 由表3可知，經(jīng)1～5 min 油炸，兩組樣品脫脂牛肉與對(duì)照組脫脂牛肉δ13C 值無顯著差異。吉林牛肉樣品油炸1～5 min粗脂肪δ13C 值介于-25.8‰～-25.4‰之間，不同油炸時(shí)間處理組間無顯著差異，但顯著低于對(duì)照組(-14.4‰)。內(nèi)蒙牛肉對(duì)照組粗脂肪δ13C 值為-28.7‰，油炸1～5 min δ13C 值介于-29.1‰～-28.9‰之間，不同油炸時(shí)間處理組樣品無顯著差異。這主要受油炸所用植物油影響。植物油δ13C 值為-29.7‰，油炸牛肉脫脂后所得到的粗脂肪中含該植物油，因此粗脂肪中δ13C 值與植物油δ13C 值接近。此外，不同時(shí)間的炸油δ13C 值無顯著差異，說明高溫對(duì)炸油δ13C 值無顯著影響。

表2 不同烤制時(shí)間對(duì)δ13C 值的影響Table2 The effect of different roasting time on δ13C value /‰

2.2 不同加工時(shí)間對(duì)牛肉穩(wěn)定氮同位素的影響

2.2.1 水煮時(shí)間對(duì)穩(wěn)定氮同位素的影響 由表4可知，對(duì)照組吉林和內(nèi)蒙脫脂牛肉的δ15N 值分別為2.6‰和6.7‰，這可能是由于喂養(yǎng)飼料不同導(dǎo)致存在差異。同時(shí)，兩組樣品的δ15N 值在水煮5 ～20 min 內(nèi)無顯著變化，水煮25 min 和30 min 時(shí)吉林脫脂牛肉δ15N 值顯著高于對(duì)照組，差值為0.3‰；水煮25 min時(shí)，蒙脫脂牛肉δ15N 值與對(duì)照組存在顯著差異，δ15N值相差0.9‰。水煮25 min 和30 min 時(shí)吉林牛肉湯渣中δ15N 值同樣與對(duì)照組顯著差異，水煮25 min 時(shí)內(nèi)蒙牛肉湯渣中δ15N 值與對(duì)照組存在顯著差異，其差值為-0.5‰。兩組牛肉水煮后δ15N 值均高于對(duì)照組，兩組湯渣中δ15N 值均低于對(duì)照組，說明氮同位素經(jīng)水煮后存在一定的分餾效應(yīng)。

表4 不同水煮時(shí)間對(duì)δ15N 值的影響Table4 The effect of different boiling time on δ15N value /‰

2.2.2 烤制時(shí)間對(duì)穩(wěn)定氮同位素的影響 由表5可知，經(jīng)1～5 min 的烤制，吉林和內(nèi)蒙脫脂牛肉δ15N 值分別介于2.5‰～2.6‰和6.8‰～7.0‰之間，δ15N 差值小于0.2‰，不同烤制時(shí)間處理組間無顯著差異，且與對(duì)照組脫脂牛肉δ15N 值無顯著差異。

表5 不同烤制時(shí)間對(duì)δ15N 值的影響Table5 The effect of different roasting time on δ15N value /‰

2.2.3 油炸時(shí)間對(duì)穩(wěn)定氮同位素的影響 由表6可知，經(jīng)1～5 min 的油炸，吉林和內(nèi)蒙脫脂牛肉δ15N 平均值分別為2.8‰和6.9‰，不同油炸時(shí)間δ15N 差值均小于0.3‰，且與對(duì)照組脫脂牛肉均無顯著差異。

表6 不同油炸時(shí)間對(duì)δ15N 值的影響Table6 The effect of different frying time on δ15N value /‰

3 討論

本研究探討了牛肉不同組織及加工副產(chǎn)物穩(wěn)定碳、氮同位素比率經(jīng)不同加工方式的變化，進(jìn)一步確證其在加工過程中的穩(wěn)定性。脫脂牛肉的δ13C 和δ15N值經(jīng)不同時(shí)間的水煮、烤制和油炸后差值較小(＜0.5‰)，即水煮、烤制和油炸3 種加工方式對(duì)牛肉穩(wěn)定碳、氮同位素?zé)o顯著影響。這與Doering[31]的研究結(jié)果一致，烤制對(duì)鮭魚肌肉組織中的穩(wěn)定碳、氮同位素?zé)o顯著影響；另有研究也表明，鯖魚和黑線鱈魚在煮、烤、蒸等不同加工條件下，其穩(wěn)定碳和氮同位素分餾值＜1‰[27]。前人研究也發(fā)現(xiàn)，面條、面包和餅干等面制品加工過程中原料和成品之間穩(wěn)定碳、氮同位素也基本無顯著差異[14，32]，且谷物在230℃高溫不同加熱時(shí)間對(duì)δ13C 和δ15N 值的影響也比較小，雖然穩(wěn)定氮同位素隨著加熱時(shí)間的延長呈逐漸升高的趨勢，但僅增加1‰[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著水煮時(shí)間的延長脫脂牛肉中δ15N 也呈升高趨勢，脫脂湯渣中δ15N 值呈降低趨勢，水煮25 min 和30 min 時(shí)脫脂牛肉δ15N 值高于對(duì)照組牛肉，但二者差值僅為0.3‰。與不同產(chǎn)地牛肉穩(wěn)定氮同位素差異相比，加工對(duì)穩(wěn)定氮同位素組成影響較小，即加工導(dǎo)致的分餾效應(yīng)不足以影響鑒別不同地域的牛肉產(chǎn)品。

肉制品中的不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸等在熱加工過程中均可能發(fā)生變化[34]。牛肉在烹飪過程中硬脂酸和總飽和脂肪酸的含量均有所增加，但總不飽和脂肪酸含量降低[35]，蒸煮牛肉時(shí)其多不飽和脂肪酸增加而飽和脂肪酸含量保持不變[36]。雖然烹飪過程中脂質(zhì)組成發(fā)生不同的變化，但本研究發(fā)現(xiàn)，水煮和烤制牛肉粗脂肪中的穩(wěn)定碳同位素經(jīng)不同時(shí)間加工后與對(duì)照組均無顯著差異，因此牛肉粗脂肪中的穩(wěn)定碳同位素不受水煮和烤制加工的影響。油炸1～5 min 內(nèi)測定的粗脂肪δ13C 值無顯著差異，但與所用植物油中δ13C值非常相近，這主要是由于油炸牛肉脫脂后收集的粗脂肪為油炸所用植物油和牛肉所含粗脂肪的混合物，因此油炸后粗脂肪的δ13C 值不受加工時(shí)間的影響，但受加工介質(zhì)的影響[30]。本研究主要分析了3 種加工方式單獨(dú)對(duì)穩(wěn)定碳、氮同位素的影響，后續(xù)可以進(jìn)一步探討牛肉連續(xù)不同方式加工后其穩(wěn)定同位素的分餾效應(yīng)及機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，吉林和內(nèi)蒙兩地飼喂方式不同的牛肉經(jīng)不同加工方式處理不同時(shí)間后，脫脂牛肉中穩(wěn)定碳、氮同位素分餾均較小，其中穩(wěn)定氮同位素經(jīng)25 min 水煮后與對(duì)照組有顯著差異，差值僅為0.3‰，但與不同產(chǎn)地牛肉穩(wěn)定氮同位素差異比較，加工導(dǎo)致的分餾效應(yīng)不足以影響鑒別不同地域的牛肉產(chǎn)品。可見，加工方式及加工時(shí)間對(duì)牛肉中穩(wěn)定碳、氮同位素基本無顯著影響，穩(wěn)定碳、氮同位素可直接用于牛肉加工半成品和成品的原產(chǎn)地溯源。