陳美晴 陳 俊 蔣君梅 王營鍇 屈志廣 方遠鵬 任明見 謝 鑫

(1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2國家小麥改良中心貴州分中心，貴州 貴陽 550025)

高粱[Sorghum bicolor(L.) Moench]是一種重要的耐旱禾本科植物，在中國已有近兩千年的種植歷史[1-2]，是我國最早栽培種植的禾谷類作物之一。高粱具有較強的抗旱、耐澇、抗鹽堿的抗逆境特性和對環(huán)境的強適應(yīng)性，屬于高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的作物，也是飼料、釀酒、生產(chǎn)生物燃料以及造紙的重要原料[3-5]。但近年來，隨著種植規(guī)模的不斷擴大，各種病害對高粱的危害也越來越嚴重[6-7]。研究表明，植物可以通過啟動其抗病基因，改變體內(nèi)的生理生化途徑來抵抗病原菌的侵染[8-11]。因此，運用分子生物學(xué)技術(shù)對高粱重要抗病基因進行研究，對培育優(yōu)良高粱抗病品種具有重要意義。

SGT1(suppressor of G-Two allele of skp1)基因最早在酵母中發(fā)現(xiàn)[12]。研究報道，SGT1 基因起著正調(diào)控植物抗病性的作用[13]。SGT1 基因沉默或突變會導(dǎo)致多種植物R基因介導(dǎo)抗病性的喪失，相反，超表達SGT1 基因則會增強植物的抗病性[13-15]。此外，SGT1還參與調(diào)控植物的非宿主抗性[16-19]。同時，SGT1 是植物抗病反應(yīng)過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控基因和防衛(wèi)反應(yīng)信號中的重要組件[20]。植物SGT1 蛋白的氨基酸序列包含5 個結(jié)構(gòu)域:1 個重復(fù)結(jié)構(gòu)域TPR、2 個可變區(qū)(VR1 和VR2)、1 個CS 基元以及1 個SGS 基元，其中TPR、CS、SGS 為保守區(qū)域。目前，人們已在水稻[21]、擬南芥[22-23]、大豆[24]、甘薯[25]、煙草[26]、中間偃麥草[27]、茄子[28]、甘藍[29]、小麥[30]等植物中克隆了SGT1 基因，但鮮見SGT1 基因在高粱中研究報道。

本研究在高粱品種BTx236 中克隆得到1 個SGT1基因，并將其命名為SbSGT1。通過對SbSGT1 序列進行生物信息學(xué)系統(tǒng)分析，構(gòu)建其原核表達載體pET-28a-SbSGT1，對蛋白可溶性表達條件進行優(yōu)化，并采用Western blot 對所表達的蛋白進行鑒定，以期為抗病高粱品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物 高粱品種BTx623，由中國科學(xué)院植物研究所景海春老師饋贈。取健康的高粱種子于室溫下在清水中浸泡24 h 催芽，然后將其播種于滅菌營養(yǎng)土中，25℃光照/黑暗交替12 h 培養(yǎng)10 d。取整株材料用液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌BL21(DE3)、JM109(DE3)和Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞均購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；中間載體pEASY-Blunt 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，原核表達載體pET-28a 由貴州大學(xué)植物病理教研室保存。

1.1.3 試劑、酶及抗體 RNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子量標準品購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (isopropyl-beta- Dthiogalactopyranoside，IPTG)以及聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodeylsulphate polyacylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)有關(guān)試劑(過硫酸銨、四甲基乙二胺、丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯胺)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；FastPfu 高保真酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；一抗Anti His 和二抗Goat Anti-Mouse IgG(H＋L)-HRP 購自北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 高粱總RNA 提取及cDNA 的合成 取保存的高粱BTx623 品種材料，利用RNA 提取試劑盒提取苗期總RNA，并在RNA 中加入適量DNase Ⅰ消化RNA中殘留的DNA，參考Promega 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.2.2SbSGT1 基因的克隆 根據(jù)已報道的水稻SGT1 基因(基因號為LOC＿Os01g43540)的蛋白序列，利用BLASTP 搜索高粱基因組數(shù)據(jù)庫(https:/ /phytozome)找到高粱同源基因SbSGT1(基因號為Sb03g028430)。根據(jù)其核酸序列設(shè)計引物，以SbSGT1-F: GCGAATTCATGGCCGCGTCGGATCT(下劃線為限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切位點)和SbSGT1-R: CGCTCGAGTTAGTATTCCCACTTCTTGAGCT(下劃線為限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ酶切位點)為引物對SbSGT1 基因進行擴增。

PCR 反應(yīng)體系(50 μL): FastPfu Fly DNA Polymerase 1 μL、5×buffer 10 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μL、cDNA 模板1 μL、10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，ddH2O 32 μL。PCR 擴增程序:95℃預(yù)變性2 min，95℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次。采用1%瓊脂糖對PCR 產(chǎn)物進行檢測。PCR 產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、純化后，連接到pEASY-Blunt 克隆載體。連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有抗生素的LB(Luria-Bertani)平板上，37℃過夜培養(yǎng)后，挑選單克隆送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.3 序列的生物信息學(xué)分析 在 NCBI 的Genebank 數(shù)據(jù)庫中下載SGT1 相關(guān)物種的同源序列，利用DNAMAN 軟件中的Homology Tree 構(gòu)建不同植物的SGT1 蛋白系統(tǒng)進化樹，并將這些物種的同源SGT1蛋白進行氨基酸序列比對；采用Protparam(http:/ /web.expasy.org/protparam/)預(yù)測SbSGT1 蛋白的基本理化性質(zhì)；利用Protscale (http:/ /web. expasy. org/protscale/)預(yù)測SbSGT1 蛋白的親水性及疏水性；使用在線網(wǎng)站(http:/ /www.softberry.com/cgi-bin/programs/proloc/protcompan.pl)進行蛋白的亞細胞定位。分別使用MLRC(https:/ /npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred＿mlr.pl)和SWISS-MODEL(http:/ /swissmodel. expasy.org/)預(yù)測SbSGT1 蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)；采用TMHMM Server(http:/ /www. cbs.dtu.dk/services/)對SbSGT1蛋白質(zhì)跨膜區(qū)進行預(yù)測分析。

1.2.4 pET-28a-SbSGT1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以1.2.2中擴增正確的SbSGT1 基因為模板，采用酶切連接的方法進行重組載體的構(gòu)建。酶切體系(50 μL):10×buffer 5 μL、EcoRⅠ1 μL、XhoⅠ1 μL、質(zhì)粒5 μL(約1 μg)，ddH2O 38 μL。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，用瓊脂糖凝膠試劑盒回收?；厥蘸蟮漠a(chǎn)物通過T4 DNA 連接酶連接到經(jīng)相同雙酶切的pET-28a 表達載體中，16℃連接16 h，構(gòu)建pET-28a-SbSGT1 重組質(zhì)粒。

1.2.5 高粱SbSGT1 蛋白的可溶性表達 首先通過熱激法將重組質(zhì)粒pET-28a-SbSGT1 分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)、JM109(DE3)和Rosetta(DE3)中，以0.8 mmol·L-1IPTG、25℃、10 h 誘導(dǎo)表達。收集6 mL 菌液，12 000 r·min-1離心2 min，向菌體加入400 μL 裂解液[50 mmol·L-1Tris(pH 值7.5)、1 mmol·L-1EDTA、100 mmol·L-1NaCl、1 mg·mL-1lysozyme、1% Triton X-100 以及蛋白酶抑制劑]，用超聲破碎儀(vex130，美國Sonics 公司)進行細胞破碎，12 000 r·min-1離心10 min，分別取上清和沉淀，加入5×Loading Buffer(上樣緩沖液) 煮沸5 min，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液用12% SDS-PAGE 電泳檢測目標蛋白的表達情況，從而確定最佳表達菌株。同時分析不同誘導(dǎo)溫度(16、20、25、30、37℃)、IPTG 濃度(0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1)對上述最佳表達菌株SbSGT1 蛋白表達的影響。

1.2.6 重組蛋白的Western blot 檢測 采用濕法轉(zhuǎn)印進行Western blot 試驗，具體步驟如下:原核表達的高粱SbSGT1 蛋白樣品經(jīng)過SDS-PAGE 電泳、聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)轉(zhuǎn)膜后，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，用Anti His 抗體室溫孵育2 h，隨后用1 × 吐溫20 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution tween-20，PBST)緩慢洗滌4 次，每次5 min；加入二抗室溫孵育1 h，1×PBST 緩慢洗滌4 次，每次5 min，棄去二抗；在PVDF 膜上加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)化學(xué)發(fā)光底物液，在天能5200 化學(xué)發(fā)光檢測儀(上海天能科技有限公司)上檢測蛋白表達信號。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱抗病基因SbSGT1 的克隆

以高粱BTx623 幼苗總RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，以高粱基因組數(shù)據(jù)庫(https:/ /phytozome) 的SbSGT1 基因序列為參考，用Primer Premier 5.0 設(shè)計的SbSGT1-F/SbSGT1-R 引物對進行PCR 擴增，擴增得到序列為1 095 bp 的目的基因，共編碼364 個氨基酸。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對獲得的PCR 產(chǎn)物進行檢測，得到的條帶大小與數(shù)據(jù)庫中的一致(圖1)。

圖1 SbSGT1 基因的PCR 擴增Fig.1 PCR amplification of SbSGT1 gene

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 SbSGT1 蛋白質(zhì)序列同源性分析 在NCBI 比對下載SGT1 在其他物種的同源序列，與高粱SbSGT1 進行序列同源性分析。由圖2可知，SbSGT1 與玉米(Zea mays)同源性為94.87%，與水稻(Oryza sativa)的同源性為85.75%，與大麥(Hordeum vulgare) 的同源性為83.24%，與小麥(Triticum aestivum) 的同源性為81.82%，說明SGT1 在這幾種植物中都相對保守。

圖2 SbSGT1 與其他物種的同源氨基酸序列比對Fig.2 Amino acids alignment between SbSGT1 and other species

2.2.2 SbSGT1 基因系統(tǒng)進化樹分析 為進一步研究SbSGT1 與其他植物SGT1 的進化關(guān)系，使用DNAMAN軟件中的Homology Tree 構(gòu)建不同植物的SGT1 系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，SbSGT1 與玉米的親緣關(guān)系最接近，為95%，與水稻的親緣關(guān)系也較接近，為86%，與麥類的親緣關(guān)系為84%，暗示與其具有相近或者相似的功能；而該基因與馬鈴薯、蓖麻、胡楊等其他植物的親緣關(guān)系較遠(圖3)。

圖3 SbSGT1 與其他物種的SGT1 系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of SbSGT1 and other species SGT1

2.2.3 SbSGT1 蛋白的基本理化性質(zhì)分析 用Protparam 對SbSGT1 蛋白進行基本理化性質(zhì)分析，由表1可知，SbSGT1 編碼364 個氨基酸，分子量為40 441.52，蛋白質(zhì)理論等電點為5.0，帶負電荷的殘基總數(shù)(Asp ＋Glu)為65，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg ＋Lys)為50，該蛋白中酸、堿性氨基酸組成比例和理論等電點顯示兩者均呈弱酸性。不穩(wěn)定指數(shù)為41.19，說明該蛋白不穩(wěn)定；脂溶指數(shù)為69.81，說明該蛋白有較好的脂溶性。用Protparam 分析得到該蛋白的親水性的平均值(grand average of hydropathy，GRAVY)為-0.617，與Protscale 分析結(jié)果一致，該蛋白為親水性蛋白(圖4)。

圖4 SbSGT1 蛋白的親疏水性預(yù)測分析Fig.4 Prediction and analysis of hydrophobicity of SbSGT1 protein

2.2.4 SbSGT1 蛋白的亞細胞定位及二、三級結(jié)構(gòu)分析 用Softberry-Protcomp 分析SbSGT1 蛋白的亞細胞定位，結(jié)果顯示SbSGT1 蛋白可能定位于細胞質(zhì)中。用MLRC 對SbSGT1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析，由圖5可知，SbSGT1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α 螺旋占43.41%、延伸鏈占10.71%、無規(guī)則卷曲占45.88%。用SWISS-MODEL 預(yù)測SbSGT1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SbSGT1 與來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的5 型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶的晶體結(jié)構(gòu)模型覆蓋率為38.14%，三級預(yù)測結(jié)果與二級預(yù)測結(jié)果一致(圖6)。

表1 SbSGT1 蛋白的基本理化性質(zhì)Table1 Basic physical and chemical parameters of SbSGT1 protein

2.2.5 SbSGT1 蛋白信號肽及跨膜區(qū)預(yù)測分析 為確定SbSGT1 蛋白是否存在信號肽，用SignalP 5.0 對其進行預(yù)測。由圖7可知，SbSGT1 蛋白不存在信號肽剪切位點。用TMHMM Server 對SbSGT1 蛋白進行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)進行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果顯示SbSGT1 蛋白無跨膜區(qū)，為非膜蛋白(圖8)。

2.3 pET－28a-SbSGT1 原核表達載體的構(gòu)建

圖5 SbSGT1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 The secondary structure prediction of SbSGT1 protein

將2.1 中PCR 克隆得到的SbSGT1 擴增產(chǎn)物與原核表達載體pET-28a 分別采用EcoRⅠ和XhoⅠ進行酶切，回收酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，并進行篩選、鑒定。由圖9可知，pET-28a-SbSGT1 融合表達載體經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后，得到一條約1 kb 的條帶，表明SbSGT1 已成功構(gòu)建到pET-28a 載體上。

圖6 SbSGT1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 The tertiary structure prediction of SbSGT1 protein

2.4 SbSGT1 蛋白的誘導(dǎo)表達

2.4.1 SbSGT1 表達菌株的分析 將重組質(zhì)粒pET-28a-SbSGT1 分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和JM109(DE3)表達菌株中，37℃培養(yǎng)，挑取單菌落進行小量誘導(dǎo)表達，用0.8 mmol·L-1IPTG，在25℃誘導(dǎo)10 h 后，經(jīng)12%SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示在42 kDa 處有一條明顯條帶(圖10)，蛋白大小與預(yù)期一致，說明重組蛋白SbSGT1 在大腸桿菌BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和JM109(DE3)中均可以包涵體形式表達(泳道1、3 和5)。但對于SbSGT1 可溶性蛋白的獲得，在JM109(DE3)和Rosetta(DE3)菌株中，只有少量的SbSGT1 可溶性蛋白(泳道2 和4)，而在BL21(DE3)菌株中有大量表達(泳道6)，因此，選用BL21(DE3)菌株用于后續(xù)表達分析試驗。

圖7 SbSGT1 蛋白信號肽預(yù)測Fig.7 Signal peptide prediction of SbSGT1 protein

圖8 SbSGT1 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測Fig.8 Transmembrane region prediction of SbSGT1 protein

2.4.2 溫度對SbSGT1 蛋白表達的影響 將重組質(zhì)粒pET-28a-SbSGT1 轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，分別在16、20、25、30、37℃條件下對其進行誘導(dǎo)表達，確定最佳誘導(dǎo)溫度。由圖11可知，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，SbSGT1 蛋白表達量呈先升高后降低的趨勢，其中在25℃誘導(dǎo)溫度下SbSGT1 蛋白表達量最高(泳道4)。因此，選用誘導(dǎo)溫度25℃用于后續(xù)SbSGT1 蛋白表達分析試驗。

圖9 pET－28a-SbSGT1 重組質(zhì)粒構(gòu)建的電泳圖譜Fig.9 The electrophoresis result of the recombinant expression plasmid of pET－28a-SbSGT1

圖10 SbSGT1 蛋白不同菌株表達分析Fig.10 Protein expression analysis of SbSGT1 in bacterial strains

圖11 不同溫度對SbSGT1 蛋白誘導(dǎo)表達分析Fig.11 SbSGT1 protein expression analysis under different temperatures

2.4.3 不同IPTG 濃度對SbSGT1 蛋白表達的影響將重組質(zhì)粒pET-28a-SbSGT1 轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，25℃條件下分別在0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1IPTG濃度下進行誘導(dǎo)表達，確定最佳誘導(dǎo)濃度。由圖12可知，隨著IPTG 濃度的增大，SbSGT1 蛋白的表達量逐步升高，當IPTG 濃度為0.8 mmol·L-1時，SbSGT1 蛋白表達量最高(泳道4)，當濃度為1.0 mmol·L-1時，蛋白表達量無明顯增加(泳道5)。

2.5 SbSGT1 蛋白的Western blot 檢測

為進一步確定誘導(dǎo)表達的SbSGT1 蛋白，采用Western blot 對重組蛋白進行檢測。由圖13可知，當用Anti His 抗體對誘導(dǎo)的蛋白進行檢測時，可觀察到一條約42 kDa 的蛋白條帶，且條帶單一，說明成功誘導(dǎo)了His-SbSGT1 蛋白表達。

3 討論

植物對病原菌的抗病性一直是植物病理學(xué)領(lǐng)域的熱門課題之一。SGT1 基因的發(fā)現(xiàn)使植物抗病機制的研究有了進一步的突破，近期的多項研究都表明SGT1是植物抗病反應(yīng)過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控基因和防衛(wèi)反應(yīng)信號的重要調(diào)控因子[20]，其功能是調(diào)節(jié)靶蛋白被26S 蛋白酶體降解[31]。SGT1 首先在酵母中報道[32]，隨后在植物和動物中相繼被報道，并且在功能上存在保守性，即SGT1 是泛素連接酶SCF(Skp1-Cullin-FVOX protein)的重要組成[33]，該蛋白可以對底物蛋白進行泛素化修飾，進而調(diào)節(jié)底物蛋白的降解。

圖12 不同IPTG 濃度對SbSGT1 蛋白表達的影響Fig.12 SbSGT1 protein expression analysis under different IPTG concentrations

圖13 SbSGT1 蛋白Western blot 檢測Fig.13 Detection of SbSGT1 protein by Western blot

SGT1 基因作為植物中一類重要的抗性基因，其在植物處于非生物脅迫時表達上調(diào)，以增強植物的抗逆性。例如，擬南芥HSC70/SGT1 基因協(xié)同作用可減輕γ 射線以及高鹽脅迫造成的損傷[34]；甘藍處于高鹽脅迫下，BolSGT1 基因表達量大幅上調(diào)[35]。當植物面對病原菌侵染時，也需要SGT1 的參與，推測SGT1 可能位于抗病信號通路的上游，因而調(diào)控著植物對病原菌的“廣譜抗性”[36]。在大麥中SGT1 與RAR1 蛋白相互作用，參與調(diào)節(jié)大麥對白粉病菌的抗性[37]；在擬南芥中SGT1 與RAR1 蛋白、熱激蛋白HSP90 形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)R基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)[38]。而高粱中，SbSGT1 能否與調(diào)控其抗病性尚待進一步研究。

白菜BcSGT1 基因編碼蛋白的大小為39 kDa，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，其與擬南芥AtSGT1b親緣關(guān)系最近[39]；花生AdSGT1 基因含有TRP、CS 和SGS 保守結(jié)構(gòu)域，編碼358 個氨基酸，進化分析表明，其與大豆GmSGT1 同源性達到82%，親緣關(guān)系較近[40]；簇毛麥Hv-SGT1 基因編碼376 個氨基酸，包含2 個可變結(jié)構(gòu)域VR1、VR2 和1 個SGS，進化分析表明，其與大麥SGT1 同屬1 個分支，親緣關(guān)系最近[41]。本研究顯示，高粱SbSGT1 與玉米親緣關(guān)系最近。由此發(fā)現(xiàn)，SGT1在不同植物中的蛋白大小、親緣關(guān)系都有所不同，說明其在進化中存在多樣性。

高粱作為重要的農(nóng)作物和工業(yè)原料，對其抗病機制的研究直接關(guān)系到高粱的產(chǎn)量和品質(zhì)的問題。研究SGT1 是否參與高粱抗病性的調(diào)控，以及研究SGT1 在高粱抗病機制中的互作關(guān)系，對高粱SGT1 的克隆與表達是非常必要的。原核表達是外源蛋白的常用研究方法之一，其表達菌株多為大腸桿菌及其改良菌株，具有表達背景低、操作簡便、成本低、繁殖快以及蛋白表達量高等優(yōu)點[42-44]，且大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用范圍最廣的重組蛋白表達系統(tǒng)之一[45]。研究表明，表達菌株、IPTG 濃度和誘導(dǎo)溫度會影響靶標蛋白的表達[46]。水稻OsSGT1、大麥HvSGT1 和白菜BcSGT1 蛋白均可在BL21(DE3)菌株、1.0 mmol·L-1IPTG 以及37℃誘導(dǎo)溫度下表達[21，39，47]，這與本研究SbSGT1 在BL21(DE3)菌株中表達結(jié)果一致；但本研究顯示SbSGT1 的最佳誘導(dǎo)溫度(25℃)和最佳IPTG 濃度(0.8 mmol·L-1)與上述報道有偏差，可能是所使用原核表達載體不一致所致。本研究中獲得的SbSGT1 蛋白相對分子質(zhì)量約為42 kDa，這與理論值(40.45 kDa)基本一致，且Western blot 也檢測到該條帶，推測該蛋白為表達的高粱SbSGT1 融合蛋白。

本研究對高粱SbSGT1 基因進行克隆，并對其原核表達條件進行了優(yōu)化，但SbSGT1 基因在真核的表達情況、蛋白互作以及結(jié)構(gòu)解析等仍需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究從高粱中成功克隆SbSGT1 基因，該基因全長1 095 bp，編碼364 個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果與其他物種已報道的SGT1 基因信息基本一致，該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為40.45 kDa，等電點為5.0，具有親水性，發(fā)生信號肽剪切的可能性極小；亞細胞定位預(yù)測該蛋白主要定位在細胞質(zhì)中，進化樹分析發(fā)現(xiàn)其與玉米ZmSGT1 同源性較高。原核表達結(jié)果顯示，SbSGT1 蛋白在BL21(DE3)菌株中可溶性表達，最佳誘導(dǎo)溫度和 IPTG 濃度分別為 25℃和 0.8 mmol·L-1。本研究結(jié)果為SbSGT1 蛋白功能分析、結(jié)構(gòu)解析以及抗病功能的研究提供了一定的依據(jù)。