羅 鑫，毛新發(fā)，范衛(wèi)兵，羅 星，宋琰駒，武衛(wèi)周

近年來，心血管疾病急癥發(fā)作常引發(fā)心源性猝死，且呈年輕化。隨著心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation，CPR)技術(shù)的普及和急診醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，通過及時(shí)搶救的自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation，ROSC)的成功率上升，心臟驟停(cardiac arrest，CA)患者的病死率降低。心臟驟停后黃金搶救時(shí)間僅有4～6 min，錯(cuò)過黃金搶救時(shí)間可能會(huì)造成腦缺血缺氧性損傷。因此，CA后缺血缺氧性腦損傷是導(dǎo)致患者病死和致殘的主要原因之一[1]。膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1，ANXA1)作用于磷脂結(jié)合蛋白與鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)抗炎反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化增殖等[2, 3]。ANXA1在阿司匹林、地塞米松等引起的體內(nèi)炎性反應(yīng)消除過程中起著關(guān)鍵的作用[4]。在深低溫體外循環(huán)導(dǎo)致的腦損傷中，ANXA1肽可抑制早期大腦核因子-κBp65(nuclear factor-κB p65, NF-κBp65)磷酸化和核轉(zhuǎn)位，下調(diào)如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factors,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等促炎因子，可以減輕腦組織損傷，但其是否對(duì)CPR后腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用尚不清楚[5]。Ac2-26是具有ANXA1功能端的肽片段，目前許多實(shí)驗(yàn)通過擬肽Ac2-26進(jìn)行ANXA1的相關(guān)研究[6, 7]。本研究通過建立大鼠窒息性CA/CPR模型，探討ANXA1擬肽Ac2-26對(duì)模型大鼠生存率和神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠53只，SPF級(jí)，體重為350～450 g,購于長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)溫度為25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，安靜、通風(fēng)及空氣過濾系統(tǒng)良好的清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，維持晝夜節(jié)律(12 h/12 h)。

使用Ac2-26(Tocris公司)、IL-1β、IL-6、TNF-α檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗大鼠NF-κBp65多克隆抗體(Santa Cruz公司)、肝素鈉注射液(上海第一生化藥業(yè))。MD3000型生物信號(hào)采集系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設(shè)備公司)，大鼠體溫維持儀器(瑞沃德生命科技公司)，R407 小動(dòng)物呼吸機(jī)(瑞沃德生命科技公司)，微量注射泵(瑞沃德生命科技公司)，麻醉咽喉鏡(泰興斯美特醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 大鼠窒息性CA/CPR模型的制備 用5%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉。將麻醉的大鼠常規(guī)備皮，消毒，鋪巾，放置于腹部朝上仰臥位，四肢固定于手術(shù)平板，抬高頭側(cè)手術(shù)平板約呈45°，將大鼠舌頭牽拉后置入喉鏡緩慢抬起其舌根，吸氣時(shí)把經(jīng)過潤(rùn)滑的14 G導(dǎo)管插進(jìn)聲門，固定導(dǎo)管。順利插入導(dǎo)管以后，連接呼吸機(jī)，設(shè)定呼吸頻率70次/min，潮氣量6 ml/kg。用碘伏對(duì)大鼠右邊骼窩進(jìn)行消毒、備皮，切1 cm 左右的切口，在腹股溝附近選取較粗的股動(dòng)脈進(jìn)行插管。在插入導(dǎo)管之前，在動(dòng)脈插管和壓力換能器中沖入0.3%肝素生理鹽水注射液，徹底排出氣泡，并提前備好生物信息采集系統(tǒng)。將股動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端使用動(dòng)脈夾牢牢固定，然后用專用線系上活結(jié)。用24G套管針穿刺插管，把線拉緊，固定導(dǎo)管，接上壓力換能器，移除動(dòng)脈夾，便能看見動(dòng)脈搏動(dòng)波形，并監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)血壓、心電圖，采用體溫計(jì)探頭持續(xù)監(jiān)測(cè)體溫。采用白熾燈輻射加熱保持其體溫36.2～37.2 ℃。股動(dòng)靜脈置管結(jié)束后，在其生命體征保持平穩(wěn)后，每隔5 min登記基線平均動(dòng)脈壓、心率及肛溫。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突赮ang等[8]誘導(dǎo)大鼠窒息性心臟驟停方法并改進(jìn)從股靜脈注入短效肌松藥羅庫溴銨(1 mg/kg)誘導(dǎo)大鼠肌松，5 min之后，停用專用呼吸機(jī)，誘導(dǎo)大鼠窒息，并在同一時(shí)間開啟 5 min 倒計(jì)時(shí)。停用呼吸機(jī)后，觀察血壓及心率均逐漸降低，3～4 min至動(dòng)脈搏動(dòng)波形及平均動(dòng)脈壓降低20 mmHg以下。大鼠出現(xiàn)窒息現(xiàn)象直至平均動(dòng)脈壓<20 mmHg的這段時(shí)間，便是窒息至心臟停搏的時(shí)間。完全不進(jìn)行干預(yù)5 min之后，對(duì)其展開CPR。重啟呼吸機(jī)，將機(jī)器參數(shù)重設(shè)為呼吸頻率80次/min，潮氣量維持原狀。腎上腺素(0.01 mg/kg)靜脈注入，并在同一時(shí)間展開人工胸外按壓(操作頻率為200次/min，深度在胸廓前后徑1/3)。自循環(huán)復(fù)原的標(biāo)準(zhǔn)是：大鼠心律恢復(fù)為室上性，平均動(dòng)脈壓≥60 mmHg，且最少維持10 min。如果用以上方法連續(xù)救治10 min仍未達(dá)ROSC要求，便認(rèn)為是復(fù)蘇失敗，結(jié)束所有操作。53只中共45只參與本研究。

1.3 分組及藥物處理 假手術(shù)組(n=15)大鼠僅行氣管及股動(dòng)靜脈插入導(dǎo)管，整個(gè)過程保持(37.0±0.5)℃體溫，監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)血壓、心率等指標(biāo)，不展開窒息誘導(dǎo)及后續(xù)的CA/CPR。將ROSC后搶救成功大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(n=15)和Ac2-26組(Ac2-26后處理，n=15)。ROSC后5 min，Ac2-26組大鼠使用微量注射泵靜脈輸注Ac2-26(1 mg/kg)，輸注速度為50 μl/min。對(duì)照組以同樣速度輸注等量生理鹽水。

1.4 生存分析及神經(jīng)功能評(píng)估 每日觀察并登記其術(shù)后大鼠生命狀態(tài)，持續(xù)觀測(cè)3 d。根據(jù)神經(jīng)功能缺損評(píng)分量表(neurological deficit score,NDS)對(duì)大鼠的腦功能進(jìn)行評(píng)估。NDS是普遍運(yùn)用于大鼠CA/CPR模型神經(jīng)功能評(píng)測(cè)的量表，包含一般表現(xiàn)、腦干功能、運(yùn)動(dòng)評(píng)估、感覺評(píng)估、運(yùn)動(dòng)行為及行為學(xué)6個(gè)部分。評(píng)估時(shí)間依次為ROSC 后24、48、72 h。

1.5 血清炎性因子檢測(cè) 給藥后3 d抽取3組大鼠靜脈血2 ml(n=4)。在室溫下，讓血液樣本凝結(jié)2 h后，1000 r/min離心20 min，吸取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平。

1.6 測(cè)定腦前額葉皮層及海馬中NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量 Western blot法測(cè)定各組大鼠前額葉皮層和海馬中NF-κB蛋白的表達(dá)水平(n=4)，Beta-actin作為內(nèi)參標(biāo)記蛋白。3 d后用戊巴比妥鈉麻醉大鼠后迅速斷頭取腦，分離出前額葉皮質(zhì)及海馬。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)電泳分離蛋白，對(duì)應(yīng)一抗標(biāo)記，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗結(jié)合后，ECL顯色液顯影，X射線曝光記錄，掃描各條帶灰度值。假手術(shù)組、對(duì)照組與Ac2-26組灰度值為與Beta-action比較的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 ANXA1擬肽Ac2-26后處理對(duì)大鼠ROSC后3 d生存率的影響 假手術(shù)組的大鼠術(shù)后3 d均存活，對(duì)照組大鼠3 d生存率為53.3%(8/15)，Ac2-26組大鼠3 d生存率為73.3%(11/15),對(duì)照組與Ac2-26組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 Ac2-26后處理對(duì)大鼠ROSC后NDS評(píng)分的影響 三組大鼠在藥物處理前后各時(shí)間點(diǎn)的NDS評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=154.321，P=0.000)；分組與檢測(cè)時(shí)間之間存在交互效應(yīng)(F時(shí)間*分組=50.612，P=0.000)；三組之間的NDS評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=122.950，P=0.000)。三組大鼠在藥物處理前NDS評(píng)分相等；給予藥物處理后不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組的評(píng)分均低于假手術(shù)組(P<0.01)，而Ac2-26組的評(píng)分均高于對(duì)照組(P<0.01，表1)，而Ac2-26組與假手術(shù)組的評(píng)分稍有差別。

表1 三組大鼠在藥物處理前后不同時(shí)間點(diǎn)NDS評(píng)分比較

2.3 三組大鼠術(shù)后3 d血清中炎性因子表達(dá)的變化 與假手術(shù)組相比，對(duì)照組術(shù)后3 d血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而 Ac2-26組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平略有升高；與對(duì)照組比較，Ac2-26組術(shù)后3d血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05，表2)。

表2 三組大鼠術(shù)后3 d血清中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度比較

2.4 三組大鼠術(shù)后3 d腦前額葉皮質(zhì)和海馬中NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量 Western blot法測(cè)定三組大鼠術(shù)后3 d前額葉皮質(zhì)和海馬中NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)水平(圖1)。NF-κB蛋白表達(dá)量，與假手術(shù)組相比，對(duì)照組大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬中NF-κB蛋白表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但Ac2-26組中NF-κB蛋白表達(dá)量則無明顯變化(P>0.05)；與對(duì)照組相比，Ac2-26組大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬中NF-κB蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表3)。說明Ac2-26能降低在CA/CPR誘導(dǎo)下升高的NF-κB表達(dá)量(P<0.01)。

圖1 三組大鼠術(shù)后皮質(zhì)和海馬中NF-κB蛋白表達(dá)的Westem blot結(jié)果

表3 三組大鼠術(shù)后3d前額葉皮質(zhì)和海馬中NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

3 討 論

CA是目前常見的突發(fā)心腦血管類危重疾病，多會(huì)誘發(fā)腦缺血、腦出血等疾病，對(duì)腦神經(jīng)造成嚴(yán)重?fù)p害。CA引起腦內(nèi)供血減少會(huì)導(dǎo)致不可逆的腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡或損傷，破壞血腦屏障，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生腦組織內(nèi)更大范圍的缺血缺氧癥狀的發(fā)生，使腦損傷加重[9]。Kim等[10]發(fā)現(xiàn)，急性腦缺血早期死亡的細(xì)胞可引起氧自由基爆發(fā)性產(chǎn)生及其他的相關(guān)信使激活小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)NF-κB核轉(zhuǎn)位，活化的NF-κB與大量致炎因子基因啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)炎性因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等的釋放，導(dǎo)致并加重腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。研究表明，CA患者在得到及時(shí)有效治療可成功恢復(fù)自主循環(huán)，但短暫的腦缺血也會(huì)引發(fā)嚴(yán)重缺血再灌注腦損傷或者復(fù)蘇后腦病[11]。

ANXA1參與多種疾病相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，ANXA1能通過內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)途徑減少白細(xì)胞浸潤(rùn)和加快嗜中性粒細(xì)胞凋亡，從而抑制嗜中性粒細(xì)胞在組織中的積累，參與調(diào)控炎性反應(yīng)的消退，有望成為抗炎治療的新作用靶點(diǎn)[12]。ANXA1的抗炎活性主要是通過干預(yù)中性粒細(xì)胞的聚集、遷移而降低其在炎性反應(yīng)部位的活性。ANXA1在中性粒細(xì)胞激活時(shí)，可快速以鈣離子依賴的方式靶定在細(xì)胞的漿膜上，并與黏附分子互相作用，從而抑制白細(xì)胞遷移到炎性反應(yīng)部位發(fā)揮作用[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ac2-26組大鼠NDS 評(píng)分、血清炎性反應(yīng)因子、NF-κB表達(dá)與假手術(shù)組差異較??；與對(duì)照組相比，Ac2-26組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、生存率均升高，而血清中IL-1β、IL-6、TNF-α因子和前額葉皮層及海馬中NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低。這說明ANXA1擬肽Ac2-26對(duì)大鼠心肺復(fù)蘇后腦損傷具有保護(hù)作用。

NF-κB信號(hào)通路是目前研究發(fā)現(xiàn)最重要的炎性反應(yīng)通路之一。當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激刺激時(shí)，可促進(jìn)NF-κBp65亞基與核內(nèi)NF-κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)炎性因子的表達(dá)[13]。ANXA1是一種天然的內(nèi)源性抗炎蛋白，可通過減少中性粒細(xì)胞聚集減輕組織器官的炎性反應(yīng)。張志泉等[5]發(fā)現(xiàn)ANXA1可以直接與細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的p65結(jié)合從而調(diào)節(jié)500多個(gè)基因的表達(dá)。在深低溫停循環(huán)導(dǎo)致的腦損傷中[14]，ANXA1通過與早期大腦NF-κB p65結(jié)合從而抑制其轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，下調(diào)血清和腦組織中促炎因子TNF-α、IL-6和髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)，減弱缺血再灌注相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)炎性反應(yīng)。Ac2-26抑制TNF-α誘導(dǎo)的ROSC形成并減少內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB通路的激活[15]。因此，膜聯(lián)蛋白A1擬肽Ac2-26可以通過抑制NF-kB通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠心肺復(fù)蘇后腦神經(jīng)的保護(hù)。