沈 霞

(嘉應(yīng)學(xué)院 梅州師范分院，廣東 梅州 514087)

食用菌是可食用的大型絲狀真菌的總稱，含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸，受到越來(lái)越多人的青睞，食用菌養(yǎng)殖已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)的重要產(chǎn)業(yè)。由于食用菌的生產(chǎn)過(guò)程具有密閉、潮濕和不見(jiàn)光等特點(diǎn)，蟲害和菌害一直是影響食用菌產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素之一。我國(guó)GB 2763-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》允許在生產(chǎn)中使用氟蟲腈、阿維菌素、吡蟲啉、除蟲脲、擬除蟲菊酯、多菌靈、百菌清等殺蟲劑、殺菌劑來(lái)防治該類病害，但對(duì)最大殘留量做了規(guī)定，如氟蟲腈在蘑菇中的最大殘留限量為0.02 mg/kg，且是以氟蟲腈及其代謝物氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜之和計(jì)[1]。目前中國(guó)登記用于食用菌的殺蟲劑、殺菌劑品種與國(guó)外相比較少[2-3]，食用菌生產(chǎn)中農(nóng)藥濫用的現(xiàn)象較嚴(yán)重[4]。農(nóng)藥的濫用不僅會(huì)造成對(duì)食用菌和產(chǎn)地環(huán)境的污染，還可能會(huì)引起食用菌農(nóng)藥殘留超標(biāo)，影響食用者的身體健康。此外，對(duì)于部分農(nóng)藥[5-6]，其代謝產(chǎn)物毒性比母體強(qiáng)，且兩者的協(xié)同效應(yīng)會(huì)使毒性增加[7]。因此，研究建立高效準(zhǔn)確的同時(shí)測(cè)定殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物殘留的檢測(cè)方法，對(duì)于保障食用菌安全具有重要意義。

目前對(duì)殺蟲類、殺菌類農(nóng)藥殘留的研究集中在環(huán)境、食品及水果等基質(zhì)中，食用菌基質(zhì)也有少量研究報(bào)道，但這類研究的檢測(cè)對(duì)象主要以施用的原藥為主，往往未涉及危害可能更大的代謝物[8-9]。常用的檢測(cè)方法包括氣相色譜法(GC)[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[13]、高效液相色譜法(HPLC)[14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[15-17]等。其中，很多殺蟲劑、殺菌劑的代謝物由于性質(zhì)穩(wěn)定，不易被氣化，需要衍生后才能用GC、GC-MS或GC-MS/MS分析，衍生化過(guò)程繁瑣且重現(xiàn)性差；HPLC法操作簡(jiǎn)單，但檢出限高，選擇性差，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性；而LC-MS/MS法的適用范圍廣、選擇性強(qiáng)、靈敏度高，特別是質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)可大大提高選擇離子的靈敏度，在痕量分析方面具有很大優(yōu)勢(shì)，適用于食用菌中低含量目標(biāo)物的檢測(cè)[9,18]。我國(guó)2016年發(fā)布的GB 23200.12-2016[19]和GB 23200.15-2016[20]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，雖包含了氟蟲腈、雙甲脒等部分農(nóng)藥，但未包含其代謝物及百菌清、福美雙、除蟲脲等化合物。此外標(biāo)準(zhǔn)方法使用固相萃取柱凈化，實(shí)驗(yàn)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化分散固相萃取凈化方法以及液相色譜-質(zhì)譜條件，建立了快速、通用的同時(shí)測(cè)定新鮮食用菌中19種常用殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法，為食用菌安全評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20 超高效液相色譜儀串聯(lián)AB Triple Quad 5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)；TurboVap LV氮吹儀(瑞典Biotage公司)；KQ-500D數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；3K15 離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司)；MS3渦旋儀(德國(guó)IKA公司)。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、咪鮮胺、雙甲脒、噻菌靈、多菌靈、福美雙、馬拉硫磷、噻蟲嗪、噻蟲胺、吡蟲啉、百菌清、除蟲脲、樂(lè)果、滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(均為100 mg/L)購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；2,4,6-三氯苯酚(純度大于99%)購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH；N-(2,4-二甲苯基)-N’-甲基甲脒鹽酸鹽(純度大于98%)購(gòu)自加拿大TRC公司。乙腈、丙酮(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Merck公司；N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、石墨化炭黑(GCB)、0.22 μm聚四氟乙烯濾膜購(gòu)自CNW公司；氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉(分析純)購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，無(wú)水硫酸鎂使用前需在馬弗爐中550 ℃烘干4 h。

樣品：隨機(jī)購(gòu)買本地市售平菇、香菇、金針菇、杏鮑菇、草菇、木耳、銀耳等新鮮樣品共30種，其中平菇4種，香菇5種，金針菇5種，杏鮑菇(雞腿菇)4種，草菇2種，茶樹菇2種，木耳5種，銀耳3種。取樣前混合均勻。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別稱取或量取適量的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈-丙酮(體積比1∶1)配成單標(biāo)儲(chǔ)備液(20.0 mg/L)；然后分別吸取適量的單標(biāo)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，其中N-(2,4-二甲苯基)-N’-甲基甲脒、滅蠅胺、多菌靈、噻蟲嗪、馬拉硫磷的質(zhì)量濃度為0.5 mg/L，樂(lè)果、除蟲脲的質(zhì)量濃度為2.0 mg/L，其余待測(cè)物的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取10.0、20.0、50.0、100、200、500 μL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白基質(zhì)提取液稀釋定容至10 mL，得到系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均保存于4 ℃條件下。

1.3 樣品制備與提取

1.3.1 樣品制備將食用菌樣品切碎混勻，均質(zhì)成漿，裝入潔凈的容器內(nèi)，于-18 ℃冷凍保存。

1.3.2 樣品提取稱取10 g均質(zhì)后的試樣(精確至0.01 g)于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈，然后加入4 g無(wú)水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉，蓋上離心管蓋，渦旋1 min，振搖提取5 min后，4 200 r/min離心5 min。吸取6 mL上清液加至裝有500 mg無(wú)水硫酸鎂、40 mg PSA及40 mg C18的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻1 min，4 200 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取2 mL上清液于10 mL試管中，40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两伞＜尤? mL 20%乙腈水溶液復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過(guò)濾后，待測(cè)定。

1.4 檢測(cè)條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODS液相色譜柱(2.0 mm×100 mm×2.2 μm)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：A為乙腈，B為水，梯度洗脫程序：0～3 min，80% B；3～6 min，80%～20% B；6～9 min，20% B；9～9.5 min，20%～80% B；9.5～12 min，80% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+和ESI-同時(shí)掃描)；數(shù)據(jù)采集：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：400 ℃；霧化氣壓力：0.345 MPa；輔助氣壓力：0.414 MPa；氣簾氣壓力：0.138 MPa；去簇電壓：80 V；碰撞室出口電壓：10 V。19種化合物的保留時(shí)間、母離子、定性定量離子和碰撞電壓見(jiàn)表1。

表1 19種殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 19 insecticides，fungicides and their metabolites

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，對(duì)19種待測(cè)物的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。將目標(biāo)化合物的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在ESI+和ESI-兩種模式下進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，大部分化合物在ESI+模式下易得到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)較強(qiáng);對(duì)于2,4,6-三氯苯酚、氟蟲腈及其代謝物、除蟲脲，由于其含有酚羥基、三氟甲基等基團(tuán)，在ESI-模式下得到較高響應(yīng)的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰。選擇各化合物的特征準(zhǔn)分子離子峰為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，以響應(yīng)值最大的碎片離子為定量離子，次級(jí)響應(yīng)最大的碎片離子為定性離子，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。19種待測(cè)物的最佳質(zhì)譜條件如“1.4”所示。

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化使用UPLC-MS/MS檢測(cè)時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入甲酸、氨水等試劑以提高響應(yīng)，但由于19種待測(cè)物需在ESI+和ESI-兩種模式下同時(shí)檢測(cè)，為兼顧各化合物的響應(yīng)，流動(dòng)相中未使用甲酸、氨水等試劑。對(duì)于有機(jī)相，分別考察了甲醇和乙腈對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果，結(jié)果顯示，兩種有機(jī)相下目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)相當(dāng)，但有機(jī)相為乙腈時(shí)，色譜峰形更好、色譜柱柱壓低，因此選用乙腈作為有機(jī)相。綜上，實(shí)驗(yàn)選擇乙腈與水作流動(dòng)相，此時(shí)目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度高，分離度好，可以滿足檢測(cè)分析要求。

2.1.3 色譜柱的選擇考察了Shim-pack XR-ODS(2.0 mm×100 mm×2.2 μm)、Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)和Thermo Hypersil GOLD(2.1 mm×100 mm×1.9 μm)4種液相色譜柱對(duì)19種待測(cè)物的分離效果。結(jié)果表明，所有目標(biāo)化合物在4種色譜柱上均能實(shí)現(xiàn)有效保留及分離。實(shí)驗(yàn)選擇低成本的Shim-pack XR-ODS(2.0 mm×100 mm×2.2 μm)色譜柱進(jìn)行分離。在最優(yōu)UPLC-MS/MS檢測(cè)條件下，19種待測(cè)物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖如圖1所示。

2.2 提取與凈化方法的優(yōu)化

由于香菇、木耳等食用菌樣品中含有大量黑色素，提取液顏色較深，若提取后直接測(cè)定，會(huì)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，因此需對(duì)提取液凈化后再上機(jī)分析。目前，農(nóng)藥殘留檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中常用的凈化方式有固相萃取(SPE)法和分散固相萃取(QuEChERS)法[19,21]。SPE法操作相對(duì)復(fù)雜耗時(shí)，且常使用甲苯等毒性較大的有機(jī)試劑。QuEChERS技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種快速、簡(jiǎn)便的樣品前處理技術(shù)，方法操作簡(jiǎn)單、迅速，且處理過(guò)程中避免了毒性較大的有機(jī)試劑，因此本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS提取凈化方法。

為提高對(duì)提取液pH變化敏感的目標(biāo)物的萃取效率，實(shí)驗(yàn)采用歐盟推薦的QuEChERS提取方法。在提取過(guò)程中加入檸檬酸鈉和檸檬酸氫二鈉，形成緩沖鹽體系，不僅能有效提高pH敏感化合物的提取效率，還能防止目標(biāo)物在提取放熱環(huán)境中降解。實(shí)驗(yàn)比較了PSA、C18和GCB 3種QuEChERS材料的不同用量組合(20、40、60 mg)對(duì)木耳陰性加標(biāo)樣品(10 μg/kg)提取回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明：混合吸附劑材料中含有GCB時(shí)，所有目標(biāo)物的提取效率均未超過(guò)40%，而吸附劑未含有GCB的樣品組中，目標(biāo)化合物的回收率均在50%以上，說(shuō)明加入GCB后，大量目標(biāo)化合物會(huì)被GCB吸附。而對(duì)于PSA和C18不同組合，C18用量變化對(duì)回收率的影響不及PSA明顯，這是由于C18主要吸附提取液中含量較少的非極性物質(zhì)，而PSA主要針對(duì)含量較多的有機(jī)酸、氨基酸、糖類等極性化合物。其中，40 mg PSA/40 mg C18組合時(shí)的回收率相對(duì)最好，在78%～108%之間，當(dāng)PSA用量過(guò)低時(shí)，雜質(zhì)去除較少，基質(zhì)效應(yīng)仍較明顯；當(dāng)PSA用量較高時(shí)，部分化合物被PSA吸附，導(dǎo)致回收率偏低。綜合比較，實(shí)驗(yàn)選取用量均為40 mg的PSA和C18組合凈化木耳樣品。在優(yōu)化的組合下，對(duì)其它基質(zhì)的加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測(cè)，回收率為82%～104%，可以滿足方法學(xué)要求。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)食用菌樣品的主要成分為水、蛋白質(zhì)、氨基酸等，大部分基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單，但由于木耳和香菇樣品中含有大量黑色素，在檢測(cè)過(guò)程中會(huì)干擾目標(biāo)化合物的響應(yīng)，相同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)僅為溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)的42%～54%，基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，采用陰性樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使目標(biāo)物在標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液中均具有相似的離子化環(huán)境，確保了檢測(cè)方法定性與定量分析的準(zhǔn)確性。

圖2 木耳加標(biāo)樣品中不同用量PSA、C18和GCB組合的回收率對(duì)比Fig.2 Recoveries comparison of different combinations of PSA,C18 and GCB in spiked black fungusthe numbers(1-19) denoted were the same as those in Table 1

2.3.2 線性范圍與檢出限在最優(yōu)的質(zhì)譜和色譜測(cè)定條件下，對(duì)“1.2”中19種待測(cè)物的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，以各化合物定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/L)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算。代表性基質(zhì)木耳中目標(biāo)化合物的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2，結(jié)果表明，19種待測(cè)物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.998 0。

通過(guò)測(cè)定質(zhì)量濃度為5.0 μg/L(N-(2,4-二甲苯基)-N’-甲基甲脒、滅蠅胺、多菌靈、噻蟲嗪、馬拉硫磷)、10.0 μg/L(雙甲脒、噻菌靈、福美雙、噻蟲胺、吡蟲啉、百菌清、咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚、氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜)和20.0 μg/L(樂(lè)果、除蟲脲)的標(biāo)準(zhǔn)工作液，計(jì)算得到各化合物的信噪比和儀器檢出限，結(jié)合前處理過(guò)程，最終計(jì)算得到各化合物的方法檢出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)分別為0.2～0.6 μg/kg和0.5～2.0 μg/kg，其中木耳基質(zhì)的相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表2。該方法的靈敏度高，適用于食用菌中19種殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物的定量分析。

表2 木耳基質(zhì)中19種待測(cè)物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 19 analytes in black fungus

2.3.3 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差由于食用菌種類繁多，基質(zhì)差異較大，不同品種對(duì)方法的回收率影響也不同。因此在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，選取3類食用菌(香菇、木耳、銀耳)的陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，考察了方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。每類食用菌分別添加3水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)濃度分別為1倍、2倍和10倍LOQ，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率及RSD。結(jié)果顯示，3類食用菌樣品的加標(biāo)回收率為83.1%～106%，RSD為5.0%～12%(見(jiàn)表3)。方法的準(zhǔn)確度和精密度均能滿足日常檢測(cè)定量分析的要求。

表3 19種待測(cè)物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 19 analytes(n=6)

圖3 陽(yáng)性香菇樣品中百菌清的提取定量離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatogram of chlorothalonil in lentinus edodes

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

為評(píng)價(jià)方法的有效性，采用本方法測(cè)定了30個(gè)市售的平菇、香菇、金針菇、杏鮑菇、草菇、木耳、銀耳等樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個(gè)香菇樣品中檢出百菌清，檢出含量為4.72 mg/kg，其陽(yáng)性色譜圖見(jiàn)圖3。

3 結(jié) 論

本文參照QuEChERS方法，以乙腈溶劑提取，檸檬酸鹽提供緩沖環(huán)境，氯化鈉鹽析、無(wú)水硫酸鎂除水，PSA和C18組合凈化，經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分離檢測(cè)后，可同時(shí)測(cè)定食用菌中19種殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)檢測(cè)條件、樣品前處理及凈化手段的優(yōu)化，使得該方法在香菇、木耳、銀耳等多種樣品基質(zhì)中均能得到較好的回收率及重現(xiàn)性。本方法操作簡(jiǎn)單、可行性強(qiáng)、回收率高、結(jié)果準(zhǔn)確、檢出限低，各項(xiàng)方法學(xué)技術(shù)指標(biāo)均滿足定性、定量分析要求，適用于食用菌中19種殺蟲劑、殺菌劑及其代謝物的測(cè)定，可為食用菌中其它農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供有效的技術(shù)支持。