劉 紅，楊飄飄，李麗霞

(1.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430075；2.湖北省藥品質(zhì)量檢測(cè)與控制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075)

糖皮質(zhì)激素類藥物由Kendall于1935年首次發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)50年代以來，許多腎上腺糖皮質(zhì)激素類藥物被合成，其核心結(jié)構(gòu)為環(huán)戊烷多氫菲核[1]。該類藥物可抑制纖維細(xì)胞增生，減少5-羥色胺形成，因而對(duì)皮膚有一定的嫩白作用[2]。為謀取高額利潤(rùn)，一些不法商家在化妝品中違法添加糖皮質(zhì)激素，然而長(zhǎng)期濫用糖皮質(zhì)激素可引起激素依懶性皮炎[3]，臨床表現(xiàn)為皮膚明顯變薄、毛細(xì)管擴(kuò)張、痤瘡和色素沉著等癥狀。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)規(guī)定糖皮質(zhì)激素為禁用組分[4]，涉及到49種糖皮質(zhì)激素；GB/T 24800.2-2009涵蓋41種糖皮質(zhì)激素[5]。但為規(guī)避監(jiān)管，仍有不法商家非法添加標(biāo)準(zhǔn)方法之外的糖皮質(zhì)激素[6]。因此，研究出一種同時(shí)測(cè)定化妝品中更多種糖皮質(zhì)激素、更易操作、準(zhǔn)確定性定量的檢測(cè)方法尤為重要。

目前糖皮質(zhì)激素類藥物的檢測(cè)手段主要有薄層色譜法[5]、高效液相色譜法[7-9]、高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法[10-13]和高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[14-15]等，但薄層色譜法常用于定性篩查，無法準(zhǔn)確定量；高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法在定量方面的靈敏度優(yōu)于高效液相色譜法和高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法，故應(yīng)用最為普遍。由于化妝品基質(zhì)復(fù)雜，目標(biāo)物結(jié)構(gòu)相似，目前報(bào)道的前處理方法有固相萃取法[5，16-17]或QuEChERS法[18]，但這些方法具有步驟繁瑣、耗時(shí)等不足。

本研究針對(duì)化妝品基質(zhì)復(fù)雜、以油性原料和水為主的特性，采用通過式高效凈化除去脂溶性物質(zhì)，凈化效率高，操作簡(jiǎn)便，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法對(duì)水劑、乳液、膏霜3類基質(zhì)化妝品中73種糖皮質(zhì)激素進(jìn)行了測(cè)定。方法快速、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，結(jié)果可靠，能夠滿足化妝品中糖皮質(zhì)激素風(fēng)險(xiǎn)篩查及監(jiān)測(cè)工作的需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Acquity UPLC/XEVOTMTQ-S 液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國 Waters 公司)；XP504電子天平(瑞士梅特勒公司)；Milli-Q 超純水器(美國Millipore 公司)；LC-250超聲波清洗機(jī)(山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司)；臺(tái)式離心機(jī)(德國Thermo Biofuge公司)。Waters CORTECS C18(150 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國 Waters 公司)；固相萃取柱為Oasis?PRiME HLB(200 mg/6 mL，60 mg/3 mL，美國Waters公司)；甲醇、乙腈(色譜純，默克股份兩合公司)；甲酸銨、甲酸(色譜純，Aladdin 公司)；乙酸銨(色譜純，Macklin公司)。

73種糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(見表1)分別購自中國食品藥品檢定研究院、歐洲藥品質(zhì)量管理局、美國藥典委員會(huì)、加拿大 TRC 公司、美國Stanford 分析化學(xué)公司、德國 Dr.Ehrenstorfer 公司、美國A ChemTek公司。

1.2 對(duì)照溶液的配制

精密稱取各對(duì)照品適量置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得100 μg/mL的各單標(biāo)對(duì)照儲(chǔ)備溶液。分別精密量取適量各單標(biāo)對(duì)照儲(chǔ)備溶液于同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3 樣品制備

稱取均勻試樣約0.2 g，置于15 mL離心管中，加入飽和氯化鈉溶液3 mL，渦旋30 s，分散均勻，精密加入4 mL乙腈，渦旋30 s，超聲提取30 min，渦旋混合搖勻，取上清液過PRiME HLB柱，重力作用下收集全部流出液。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters Cortecs C18(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積：2 μL；流動(dòng)相：乙腈(A)和0.1%乙酸溶液(B)。梯度洗脫程序：0～6 min，5%～15% A；6～16.8 min，15%～23.4% A；16.8～18.8 min，23.4% A；18.8～38 min，23.4%～42% A；38～44 min，42%～67.8% A；44～46 min，67.8% A；46～50 min，67.8%～85% A；50～52 min，85%～5% A；52～56 min，5% A。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；去溶劑氣流速：800 L/h；去溶劑溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：3.2 kV；73種待測(cè)物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 73種分析物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the 73 analytes

(續(xù)表1)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取方法的優(yōu)化

糖皮質(zhì)激素為甾體化合物，其結(jié)構(gòu)特征是在固醇核D環(huán)的C17上有α羥基，在C環(huán)的C11上有氧或羥基[19]。因此，糖皮質(zhì)激素類化合物多屬于弱極性或中等極性，文獻(xiàn)[16-17]以乙腈或甲醇為提取溶劑。考慮到乙腈作為提取溶劑更易分層，不易乳化，故選用乙腈為提取溶劑。化妝品基質(zhì)復(fù)雜，由油性、粉質(zhì)、溶劑類、膠質(zhì)、表面活性劑、香精香料、顏料色素、保濕劑、防曬劑、防腐劑和抗氧化劑等原料根據(jù)不同的產(chǎn)品需求組合而成[20]，所以分散劑的選擇至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)比較了以水、飽和氯化鈉為分散劑時(shí)73種糖皮質(zhì)激素的回收率。結(jié)果表明，飽和氯化鈉作為分散劑時(shí)，有73%(53/73)的目標(biāo)物回收率更接近100%，而水作為分散劑時(shí)，僅有27%(20/73)的目標(biāo)物回收率更接近100%，分析原因可能為飽和氯化鈉屬強(qiáng)電解質(zhì)，作為分散劑和破乳劑可增加樣品的表面張力，使分散更完全。所以最終選擇飽和氯化鈉作為分散劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

糖皮質(zhì)激素以環(huán)戊烷多氫菲核為母核，僅取代基位置不同，本研究中共有12組同分異構(gòu)體，如22(R)-布地奈德和22(S)-布地奈德等。采用0.1%乙酸溶液和乙腈為流動(dòng)相，比較了Agilent Poroshell EC-C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm) 、Waters Cortecs C18(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)和Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)3種色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物分離效果和峰形的影響。結(jié)果表明，73種藥物在3種色譜柱上的峰形均較好，但分離效果差異較大，12組同分異構(gòu)體在Agilent Poroshell EC-C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm) 和Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)上不能同時(shí)分離，而在Waters Cortecs C18(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)上能實(shí)現(xiàn)較好分離，因此本文選用Cortecs C18(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)色譜柱。

考察了乙腈-0.1%乙酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.01 mol·L-1甲酸銨和乙腈-0.01 mol·L-1乙酸銨4種流動(dòng)相體系對(duì)目標(biāo)化合物分離效果和信號(hào)強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，上述4種流動(dòng)相體系下，73種糖皮質(zhì)激素的分離度和保留時(shí)間相似，但以乙腈-0.1%乙酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)的峰形最好，且絕大部分目標(biāo)化合物的響應(yīng)優(yōu)于其他流動(dòng)相體系。故選擇乙腈-0.1%乙酸溶液作為流動(dòng)相。

圖1 典型同分異構(gòu)體的基峰色譜圖Fig.1 Base peak chromatogram of typical isomersthe peak numbers denoted were the same as those in Table 1

圖2 3種基質(zhì)化妝品基質(zhì)效應(yīng)的比較Fig.2 The comparison of matrix effect for three matrices

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源下，分別對(duì)質(zhì)量濃度為200 ng/mL的目標(biāo)化合物對(duì)照溶液做正離子和負(fù)離子全掃描，發(fā)現(xiàn)73種目標(biāo)化合物均在正離子模式下獲得響應(yīng)最佳的準(zhǔn)分子離子峰。由于糖皮質(zhì)激素有相同的母核，73種目標(biāo)化合物中有12組同分異構(gòu)體，而且有些化合物雖不是同分異構(gòu)體，但其質(zhì)量數(shù)相同，裂解規(guī)律相似，易產(chǎn)生相同的碎片，所以選擇特征的、無干擾且穩(wěn)定的子離子對(duì)作為定量定性離子，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù)，使化合物的準(zhǔn)分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大。優(yōu)化條件下典型同分異構(gòu)體的色譜圖見圖1。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

樣品經(jīng)乙腈萃取后的溶液中含有大量脂溶性物質(zhì)[21]，因此利用固相萃取柱凈化樣品溶液。有文獻(xiàn)采用HLB固相萃取柱凈化[5,16-17]，但步驟繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)。而新型PRiME HLB 柱屬于過濾型固相萃取柱，無需活化和平衡，能有效吸附脂溶性干擾物，過程簡(jiǎn)單、高效。因此，本實(shí)驗(yàn)選取200 mg/6 mL和60 mg/3 mL兩種型號(hào)的PRiME HLB固相萃取柱進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，與過柱前相比，凈化后的提取液澄清度均有顯著提升。對(duì)兩柱的提取回收率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)，結(jié)果表明兩者有顯著性差異，60 mg/3 mL固相萃取柱的平均提取回收率更好，故選擇PRiME HLB(60 mg/3 mL)固相萃取柱進(jìn)行凈化。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是由于樣品在離子化時(shí)基質(zhì)成分與目標(biāo)化合物相互競(jìng)爭(zhēng)電離所致，包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。采用ME=(1-基質(zhì)對(duì)照溶液的峰面積/溶劑對(duì)照溶液的峰面積)×100%對(duì)73 種化合物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)-20%≤ME≤20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng) 20%<|ME|≤50% 時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng) |ME|>50% 時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[22]；通常采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算以獲得更真實(shí)的樣品數(shù)據(jù)[23]。本研究對(duì)水劑、乳液、膏霜3類化妝品的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察，由圖2可知，膏霜類化妝品受基質(zhì)影響較大，水劑次之，乳液類化妝品受基質(zhì)效應(yīng)影響最小。為了能更準(zhǔn)確地測(cè)定目標(biāo)化合物，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 定量下限、標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍在國食藥監(jiān)許[2010]455號(hào)《化妝品中禁用物質(zhì)和限用物質(zhì)檢測(cè)方法驗(yàn)證技術(shù)規(guī)范》中，定量下限定義為能夠?qū)Ρ粶y(cè)物質(zhì)準(zhǔn)確定量的最低濃度或質(zhì)量[24]。在保證準(zhǔn)確定性的前提下，通過使用空白基質(zhì)逐級(jí)稀釋對(duì)照品溶液來考察定量下限(LOQ)，以信噪比S/N≥10確定73種糖皮質(zhì)激素的LOQ為0.1～0.3 μg/g(見表2)。

空白樣品中添加系列不同質(zhì)量濃度的73種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”方法處理得到樣品提取液，以目標(biāo)化合物的色譜峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x，ng/mL)進(jìn)行線性回歸，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，73種目標(biāo)化合物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99(見表2)。

2.6.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差選取水劑、膏霜、乳液3類空白基質(zhì)，按1、2、5倍LOQ進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行分析3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，水劑的平均回收率為88.1 %～118%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 為 0.40%～14%；膏霜的平均回收率為73.3%～119%，RSD為 0.40%～18%；乳液的平均回收率為86.5%～115%，RSD為 0.60%～17%。典型乳液基質(zhì)的數(shù)據(jù)見表2。

表2 73種化合物在典型乳液基質(zhì)中的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率、精密度和定量下限Table 2 Linear ranges，correlation coefficients，average recoveries，precisions and limits of quantitation of the 73 compounds in typical emulsion matrices

(續(xù)表2)

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)客戶委托的7個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，其中2批樣品檢出倍他米松，含量分別為4.9 μg/g和5.2 μg/g。典型陽性樣品的總離子流圖及提取離子流圖見圖3。

3 結(jié) 論

本研究建立了通過式高效凈化/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)化妝品中73種糖皮質(zhì)激素的分析方法。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確，靈敏度高，能滿足同時(shí)測(cè)定化妝品中73種糖皮質(zhì)激素的要求，為有效監(jiān)管化妝品中非法添加禁用物質(zhì)提供了技術(shù)支撐。