楊寶田，關(guān) 皎，賈 桐，朱鶴云

(1.吉林省白山市食品藥品檢驗所，吉林 白山 134300；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

枳實(Aurantiifructusimmaturus)，又名酸橙，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，原文記載“枳實主大風(fēng)在皮膚中，如麻豆苦癢，除寒熱結(jié)，止利，長肌肉，利五臟，益氣輕身，生川澤”。2015版中國藥典記載枳實為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck 的干燥幼果，具有破氣消積、化痰散痞等功效[1]。枳實為“藥食同源”類植物資源，廣泛分布于四川、江西、福建、江蘇等地區(qū)。枳實中含有的主要活性成分為黃酮類化合物，包括柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、異柚皮苷、柚皮素、橙皮素等，文獻(xiàn)報道，枳實中的黃酮類成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降低毛細(xì)血管通透性、抗氧化等多種生物活性[2-5]。目前，針對枳實中黃酮類活性成分進(jìn)行含量測定主要采用高效液相色譜法[6-9]，存在分析時間長、靈敏度低、專屬性差等缺點，難以滿足高通量樣品分析的要求。近年來，超快速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UFLC- MS/MS)技術(shù)由于具有靈敏度高、選擇性強、定量準(zhǔn)確、分析速度快等優(yōu)點，越來越多的應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制研究[10-11]。本試驗建立UFLC-MS/MS法同時測定枳實中6個黃酮類活性成分(異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素)的含量，所建立的分析方法分析時間明顯縮短，分析效率顯著提高，可為枳實的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)，同時為天然藥物應(yīng)用于獸醫(yī)獸藥領(lǐng)域提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 3200 QTRAP質(zhì)譜儀(配備電噴霧離子源，Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)采集和定量處理軟件，美國AB Sciex公司)；Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(配備Prominence SIL-20AHT自動進(jìn)樣器、LC-20AD二元泵、CTO-20A柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器和LC solution色譜工作站，日本島津公司)；KQ-250DE型數(shù)控聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA 225D型電子天平(德國賽多利斯儀器有限公司)；XK96-A快速混勻器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；FW80型微型高速萬能試樣粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料 柚皮苷對照品(批號：110722-201815)、橙皮苷對照品(批號：110721-201818)和新橙皮苷對照品(批號：111857-201703)，均購自中國食品藥品檢定研究院；異柚皮苷對照品(批號：16081802)、柚皮素對照品(批號：17061301)、橙皮素(批號：17072601)，均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度均大于98%。乙腈和甲醇為色譜純(美國Fisher科技公司)，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。枳實藥材，購自沈陽市國大藥房，產(chǎn)地為四川省，經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院生藥教研室李景華副教授鑒定為蕓香植物酸橙(CitrusanrantiumL.)的干燥幼果，樣品存留于吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院中藥樣品室。

1.3 色譜條件 采用Shim-Pack XR-ODS色譜柱(75 mm×3.0 mm，2.2 μm)，預(yù)柱為C18保護(hù)柱(4 mm×3.0 mm，2.2 μm)，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，10%→30%B；10～12 min，30%→60%B；12～15 min，60%→85%B)，平衡時間為3 min，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

1.4 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源(ESI源)，負(fù)離子方式檢測，源噴霧電壓5 500 V，輔助加熱氣溫度550 ℃，霧化氣、輔助氣和氣簾氣壓力分別為50 psi、50 psi和20 psi；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，用于定量的離子反應(yīng)分別為m/z579.1→m/z270.9(異柚皮苷)、m/z579.2→m/z271.0(柚皮苷)、m/z609.1→m/z301.2(橙皮苷)、m/z609.2→m/z301.1(新橙皮苷)、m/z301.1→m/z151.0(柚皮素)和m/z271.1→m/z150.9(橙皮素)。異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的碰撞能量(CE)分別為34、45、40、48、33 eV和26 eV。異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素混合對照品和樣品的MRM色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)和樣品(B)MRM色譜圖Fig.1 Mixed reference substance (A) and sample (B) MRM chromatogram1:異柚皮苷;2:柚皮苷;3:橙皮苷;4:新橙皮苷;5:柚皮素;6:橙皮素1:Isonaringin;2:Naringin;3:Hesperidin;4：Neohesperidin;5:Naringenin;6:Hespereti

1.5 溶液的制備

1.5.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇配制成異柚皮苷、橙皮苷、柚皮素和橙皮素質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL、柚皮苷和新橙皮苷質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的單一成分對照品儲備液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 供試品溶液的制備 精密稱取枳實藥材粉末(過40目篩)0.1 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲(功率250 W，頻率50 kHz)處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾。精密量取續(xù)濾液0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“1.5.1”項下的各對照品溶液適量，置于同一5 mL容量瓶中，用甲醇配制成異柚皮苷濃度分別為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/mL和8.0 μg/mL，柚皮苷濃度分別為1、2、5、10、20 μg/mL和 40 μg/mL，橙皮苷濃度分別為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg/mL和8.0 μg/mL，新橙皮苷濃度分別為0.5、1、2.5、5、10 μg/mL和20 μg/mL，柚皮素濃度分別為0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 μg/mL和0.8 μg/mL，橙皮素濃度分別為0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 μg/mL和0.8 μg/mL的系列混合對照品溶液。依次注入超快速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定峰面積。以對照品的濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積的積分值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的線性回歸方程分別為：

Y=4.109×104X-4.544×103r=0.999 2

Y=2.640×104X+5.622×103r=0.999 4

Y=2.871×104X-3.552×102r=0.999 7

Y=6.469×104X+1.247×104r=0.999 2

Y=3.553×104X-2.849×102r=0.999 7

Y=7.043×104X+1.877×102r=0.999 7

結(jié)果表明，異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素分別在0.2～8.0 μg /mL、1.0～40 μg/mL、0.2～8.0 μg/mL、0.5～20 μg/mL、0.02～0.8 μg/mL和0.02～0.8 μg/mL濃度范圍之內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度試驗 精密吸取“2.1”項下制備的異柚皮苷質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL、柚皮苷質(zhì)量濃度為10 μg/mL、橙皮苷質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL、新橙皮苷質(zhì)量濃度為5 μg/mL、柚皮素質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL和橙皮素質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL的混合對照品溶液 200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上。按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素峰面積的RSD分別為2.6%、2.0%、2.7%、1.9%、1.6%和2.5%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上，在室溫下分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12 h和24 h 進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素峰面積的RSD分別為2.7%、2.7%、2.9%、1.5%、1.4%和2.3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗 取同一批枳實樣品6 份，分別按“1.5.2”項下方法制備供試品溶液，取供試品溶液200 μL，注入樣品瓶中，置于樣品架上，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算待測成分的含量。結(jié)果異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量平均值(n=6)分別為1.87%、11.9%、0.471%、3.14%、0.373%和0.0418%，RSD分別為1.5%、2.3%、2.8%、2.2%、2.8%和2.5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批次枳實樣品9份，精密稱定，每份0.05 g，分別加入相當(dāng)于樣品中異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素含量的80%、100%、120%的對照品溶液適量，各3份。按“1.5.2”項下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣5 μL測定，計算異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的回收率和RSD值，結(jié)果見表1。

表1 枳實樣品中異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的回收率Table 1 Recoveries of isonaringin,naringin,hesperidin,neohesperidin,naringenin and hesperetin

2.6 樣品含量測定 精密稱取6批枳實樣品，按“1.5.2”項下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣5 μL，每個溶液進(jìn)樣3次，計算異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量。6批樣品測定結(jié)果見表2。

表2 枳實樣品中異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量Table 2 The contents of isonaringin,naringin,hesperidin,neohesperidin,naringenin and hesperetin in Aurantii fructus immaturus (%)

3 討論

3.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化 分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水4種流動相體系。結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液流動相體系能夠獲得較好的分離效果。6個待測物在電噴霧離子源負(fù)離子檢測模式下的響應(yīng)明顯高于正離子模式，在負(fù)離子模式下異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素分別形成m/z579.1、m/z579.2、m/z609.1、m/z609.2、m/z301.1和m/z271.1的[M-H]-準(zhǔn)分子離子，靈敏度較高且信號較為穩(wěn)定。碰撞能量(CE)對定量結(jié)果的影響較大，試驗過程中對碰撞能量(CE)進(jìn)行了優(yōu)化，考察了10～50 eV范圍內(nèi)異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的質(zhì)譜響應(yīng)，結(jié)果表明，較低CE (10～20 eV)時，6個待測物形成各自穩(wěn)定的碎片離子，產(chǎn)生的碎片離子較少，較高CE (20～50 eV)時，母離子信號進(jìn)一步降低，但產(chǎn)生較多的碎片離子。因此，最終選擇的異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的CE值分別為34、45、40、48、33 eV和26 eV。本試驗同時對源溫度(Source temperature)、源噴霧電壓(Ionspray voltage)等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。采用本試驗建立的UFLC-MS/MS分析方法測定枳實中6個活性成分時，分析時間僅為14 min，與文獻(xiàn)[5-8]中采用的常規(guī)HPLC相比分析時間明顯縮短，且藥材中其他色譜峰不干擾樣品的測定。

3.2 提取方法及提取溶劑的選擇 本試驗對比了回流法和超聲法提取枳實中異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的提取效果。結(jié)果表明，超聲提取30 min所得供試品中上述6個活性成分的含量均明顯高于回流提取法，因此，本試驗采用超聲提取法作為枳實中6個活性成分的提取方法。本試驗對比了50%、70%、100%乙醇溶液和50%、70%、100%甲醇溶液對枳實中6個活性成分的提取效率，結(jié)果顯示，100%甲醇的綜合提取效率最高，故本試驗采用100%甲醇作為提取溶劑。

3.3 本試驗建立UFLC-MS/MS法同時測定枳實中異柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素和橙皮素的含量，并應(yīng)用該方法測定了6批枳實中上述6個活性成分的含量。本試驗建立的UFLC-MS/MS方法簡單、快速、靈敏、專屬性強，可為枳實的質(zhì)量控制和體內(nèi)研究提供參考。