孫露萍

(安徽省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

牡丹皮來(lái)源于毛茛科的植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)的干燥去心根皮；苦、辛，微寒；歸心、肝、腎經(jīng)；具有清熱涼血，活血化瘀的功效[1]。牡丹皮是在中醫(yī)臨床上應(yīng)用比較廣泛的一種中藥，市場(chǎng)年需求量約在八千噸左右，六味地黃丸、活血散瘀湯等著名方劑的配方中均包含牡丹皮，其中含有鞣質(zhì)類、單萜類等主要化學(xué)成分[2]。目前，牡丹皮藥材的主產(chǎn)地有安徽的亳州、銅陵與陜西商洛、山東菏澤等地，其中安徽的產(chǎn)量占總產(chǎn)量的50%左右。各相關(guān)記載與現(xiàn)代研究，皆首推銅陵鳳凰山一帶的“鳳丹”為最優(yōu)，因此稱其為道地藥材，聞名于海內(nèi)外[3-5]。牡丹皮的藥用部位的化合物的種類與含量均易受到種屬、氣候、種植環(huán)境等的影響，進(jìn)而影響牡丹皮及其它相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量；現(xiàn)如今牡丹皮藥材的質(zhì)控方法通常是將丹皮酚作為考察的依據(jù)和指標(biāo)來(lái)定性或定量的，很顯然，這樣的做法既不具有專屬性，而且缺乏整體性。為加強(qiáng)牡丹皮的質(zhì)量控制，用指紋圖譜技術(shù)研究牡丹皮藥材，對(duì)其質(zhì)控方法與標(biāo)準(zhǔn)等的完善具有非常重要的意義。本文通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地牡丹皮薄層色譜法鑒別、HPLC法測(cè)定含量和指紋圖譜，來(lái)區(qū)分不同產(chǎn)地的牡丹皮，并通過(guò)結(jié)合兩種主要有效成分丹皮酚、芍藥苷的定量檢測(cè)，對(duì)不同產(chǎn)地的牡丹皮藥材的質(zhì)量評(píng)估體系進(jìn)行了完善和補(bǔ)充。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥 材

多批次牡丹皮(采收地見表1)，經(jīng)鑒定為毛茛科的植物牡丹的干燥去心根皮；牡丹皮的對(duì)照藥材(采購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121490-201102)。

表1 牡丹皮采收地Table 1 Moutans Cortex harvesting areas

1.2 儀 器

Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；SPDM-10Avp DAD檢測(cè)器，島津；LC-10ADvp泵，CTO-10AC柱溫箱，SIL-10A自動(dòng)進(jìn)樣器，SCL-10A控制器，LC Solution色譜工作站；AB135-S型電子天平，瑞士梅特勒。

1.3 試劑與耗材

色譜甲醇、乙腈，純化水，芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)MUST-13113009，購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，純度99.97%)，丹皮酚對(duì)照品(批號(hào)MUST-16071405，購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，純度大于98%)；高效硅膠G薄層板，青島海洋公司。

2 不同產(chǎn)地牡丹皮薄層檢視

2.1 丹皮酚薄層色譜鑒定

取牡丹皮粉末各0.5 g，置于25 mL錐形瓶，加甲醇10 mL，稱量，密塞超聲20 min，用甲醇補(bǔ)足失重，作為供試品溶液。取丹皮酚適量，加甲醇制成0.50 mg·mL-1溶液為丹皮酚對(duì)照品。取對(duì)照品溶液與各樣品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯(2:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鐵乙醇溶液，顯色。

圖1 丹皮酚薄層色譜鑒別 (從左到右依次為丹皮酚對(duì)照品、1、2、4、5、7、9)Fig.1 TLC identification of Paeonol (from left to right: paeonol reference substance, 1, 2, 4, 5, 7, 9)

2.2 芍藥苷薄層色譜鑒定

圖2 芍藥苷薄層色譜鑒別Fig.2 TLC identification of Paeoniflorin

取牡丹皮粉末0.5 g，置于25 mL錐形瓶，甲醇10 mL，稱量，密塞超聲20 min，用甲醇補(bǔ)足失重，作為供試品溶液。取芍藥苷適量，加甲醇制成0.50 mg·mL-1溶液為芍藥苷對(duì)照品。取對(duì)照品溶液與各樣品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G板上，以氯仿:乙酸乙酯:甲醇:甲酸(40:5:10:0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

2.3 薄層檢視總結(jié)

經(jīng)薄層鑒別，不同產(chǎn)地牡丹皮均含有芍藥苷和丹皮酚，期望通過(guò)薄層方法對(duì)不同產(chǎn)地牡丹皮進(jìn)行區(qū)分難度較大，而薄層檢視長(zhǎng)處在于定性鑒別，方法簡(jiǎn)單快捷，適用于快速檢查，為更好的區(qū)分不同產(chǎn)地牡丹皮，因此對(duì)不同牡丹皮中芍藥苷和丹皮酚進(jìn)行含量測(cè)定。

3 牡丹皮芍藥苷與丹皮酚的含量測(cè)定[6-9]

3.1 色譜條件

色譜柱：選用Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液的水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫0～15 min(10%B～20%B)，15～27 min(20%B)，27～40 min(20%B～30%B)，40～60 min(30%～50%B)；檢測(cè)波長(zhǎng)：選取230 nm和274 nm(中國(guó)藥典所規(guī)定的芍藥苷與丹皮酚的檢測(cè)波長(zhǎng))；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取2.36 mg芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品與3.99 mg丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL的容量瓶中，加入色譜甲醇定容到容量瓶的刻度線，即可得到本次實(shí)驗(yàn)所需的混合對(duì)照品(芍藥苷與丹皮酚)溶液?；旌蠈?duì)照色譜圖如圖3所示。

圖3 混合對(duì)照色譜圖Fig.3 Mixed standers chromatogram

3.3 供試品溶液的制備

精密稱定0.5 g的各樣品粗粉，分別置于具塞錐形瓶中；再精確添加50 mL色譜甲醇，密塞，稱定重量；超聲處理30 min后，取出，待冷卻，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量；搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即可得到本次實(shí)驗(yàn)所需的供試品溶液。

3.4 線性關(guān)系考察

精密稱定芍藥苷3.13 mg、丹皮酚5.28 mg，根據(jù)2.2項(xiàng)下所述配制方法來(lái)配制，然后用移液管吸取5 mL第一份樣品溶液置于另一10 mL容量瓶，再用色譜甲醇溶液定容到容量瓶的刻度線，搖晃均勻后，即得第二份樣品。第三份樣品取第二份樣品溶液5 mL，定容，以此類推，共制成七份對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。每次進(jìn)樣10 μL檢測(cè)，記錄并分析HPLC色譜圖，以所測(cè)得的色譜峰峰面積A作為線性回歸的Y坐標(biāo)，樣品的濃度(μg/mL)作為線性回歸的X坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得芍藥苷的線性回歸方程為Y=11267X-35242，r=0.9991(n=7)，丹皮酚的線性回歸方程為Y=44643X+65589，r=0.9999(n=7)。由結(jié)果可知芍藥苷和丹皮酚兩者分別在4.89～313 μg/mL與8.25～528 μg/mL濃度范圍內(nèi)，丹皮酚與芍藥苷的色譜峰峰面積與其濃度之間有著較好的線性關(guān)系。

3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密稱定0.5 g樣品粗粉，依照3.3項(xiàng)下所述的配制溶液的方法來(lái)配制，每次進(jìn)樣10 μL所配制的供試品溶液，依照3.1項(xiàng)所述條件下連續(xù)進(jìn)樣5次檢測(cè)，以進(jìn)樣檢測(cè)的芍藥苷和丹皮酚的色譜峰峰面積計(jì)算，兩種化學(xué)成分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為 2.93%、1.96%，表明儀器精密度良好。

3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱定同一批樣品的(根皮)粗粉共5份，每份0.5 g，依照3.3項(xiàng)下所述配制方法來(lái)配制，各樣品溶液分別進(jìn)樣10 μL，根據(jù)3.1項(xiàng)下所述的條件分別進(jìn)樣檢測(cè)，以進(jìn)樣檢測(cè)的的含量來(lái)計(jì)算，芍藥苷和丹皮酚兩者的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.93%和1.77%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱定0.5 g樣品(根皮)粗粉，依照3.3項(xiàng)下所述的配制溶液的方法來(lái)配制，每次進(jìn)樣10 μL樣品溶液，根據(jù)上述的色譜條件先后在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣檢測(cè)，以測(cè)定的芍藥苷和丹皮酚色譜峰的峰面積計(jì)算，得到芍藥苷與丹皮酚的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.91%、2.31%(如表4所示)，說(shuō)明供試品溶液在12 h內(nèi)較穩(wěn)定。

3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱定樣品(根皮)粗粉共6份，每份0.25 g，每份樣品中加入一定量的芍藥苷和丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)照品，根據(jù)3.3項(xiàng)下所述的配制溶液的方法，配制供試溶液，每份進(jìn)樣10 μL檢測(cè)，記錄并分析HPLC色譜，分別計(jì)算芍藥苷與丹皮酚的回收率(詳見表5、表6)，得到芍藥苷與丹皮酚二者的平均回收率分別為98.05%、98.72%，芍藥苷與丹皮酚二者的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%(如表2、表3所示)，表明回收率符合該實(shí)驗(yàn)研究的規(guī)定。

表2 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)(n=6)Table 2 Paeoniflorin sample recovery test (n=6)

表3 丹皮酚加樣回收試驗(yàn)(n=6)Table 3 Paeonol sample recovery test (n=6)

3.9 樣品測(cè)定與數(shù)據(jù)分析

按3.1項(xiàng)下色譜條件，對(duì)上述各供試品與對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，每次進(jìn)樣10 μL，經(jīng)計(jì)算，得到不同產(chǎn)地中丹皮酚和芍藥苷的含量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值結(jié)果見表4。

表4 各樣品中芍藥苷與丹皮酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 4 The mass fraction of paeoniflorin and paeonol in each sample

利用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件，對(duì)10批樣品測(cè)得的芍藥苷與丹皮酚的含量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以顯示產(chǎn)地與含量之間的關(guān)系，結(jié)果表明不同產(chǎn)地牡丹皮芍藥苷與丹皮酚的含量有顯著性差異。

4 牡丹皮HPLC指紋圖譜研究[10-13]

4.1 色譜條件

同2.1。

4.2 對(duì)照品溶液的制備

同2.2。

4.3 供試品溶液的制備

同2.3。

4.4 精密度試驗(yàn)

精密稱定0.5 g的樣品(根皮)粗粉，根據(jù)3.3項(xiàng)下配制的方法來(lái)配制，每次進(jìn)樣10 μL所配制的樣品溶液，依照3.1項(xiàng)所述的實(shí)驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣5次檢測(cè)。因2號(hào)峰(芍藥苷峰)出峰時(shí)間適中，峰面積大，所以選擇2號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其余5個(gè)峰的相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD的值。結(jié)果顯示，它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.70%、0.00%、1.72%、2.90%、1.01%、0.54%、2.92%、1.62%、0.45%、0.61%，均小于3%，表明儀器精密度較好。

4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱定同一批樣品的(根皮)粗粉共五份，每份0.5 g，根據(jù)3.3項(xiàng)下溶液配制的方法來(lái)配制，每次進(jìn)樣10 μL的各樣品溶液，根據(jù)3.1項(xiàng)所述的條件分別進(jìn)行檢測(cè)。因2號(hào)峰(芍藥苷峰)出峰時(shí)間適中，峰面積大，所以選擇2號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其余5個(gè)峰的相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD的值。結(jié)果顯示，它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.53%、0.00%、1.48%、2.07%、1.21%、1.80%均小于3%，說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱定0.5 g的樣品(根皮)粗粉，根據(jù)3.3項(xiàng)下的溶液配制方法來(lái)配制，每次進(jìn)樣10 μL的樣品溶液，按照3.1項(xiàng)下所述的條件先后在0、2、4、6、8、12小時(shí)進(jìn)樣檢測(cè)。因2號(hào)峰(芍藥苷峰)出峰時(shí)間適中，峰面積大，所以選擇2號(hào)峰為參照峰，計(jì)算其余5個(gè)峰的相對(duì)峰面積，并計(jì)算RSD的值。結(jié)果顯示，它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 為2.04%、0.00%、0.61%、2.80%、1.13%、1.01%、4.24%、3.03%、1.03%、0.55%，均小于3%，說(shuō)明供試品溶液在12 h內(nèi)較穩(wěn)定。

4.7 樣品的HPLC指紋圖譜的測(cè)定

根據(jù)3.3項(xiàng)下供試品溶液配制方法，首先依法配制好各樣品溶液，然后分別進(jìn)樣，每次10 μL，根據(jù)3.1項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄分析各樣品60 min的HPLC色譜圖。結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同產(chǎn)地牡丹皮根皮樣品指紋圖譜與對(duì)照藥材疊加圖Fig.4 The fingerprint of Moutans Cortex samples from different places and the superposition of the control medicinal materials

4.8 樣品的HPLC指紋圖譜相似度分析

表5 不同產(chǎn)地樣品HPLC與對(duì)照藥材圖譜相似度比較Table 5 Comparison of similarity of HPLC and control medicinal materials of samples from different origins

利用國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件，將AIA格式的HPLC色譜圖文件依次導(dǎo)入軟件，將相同產(chǎn)地的色譜圖通過(guò)指紋圖譜軟件先進(jìn)行合成，擬合產(chǎn)地指紋圖譜，再將各產(chǎn)地指紋圖譜進(jìn)行比較。結(jié)果如表5所示，不同產(chǎn)地的牡丹皮藥材相似度為0.912～0.985，安徽銅陵產(chǎn)牡丹皮指紋圖譜與對(duì)照藥材的指紋圖譜的相似度最高，各產(chǎn)地間指紋圖譜相似度存在差異，表明指紋圖譜可用來(lái)對(duì)不同產(chǎn)地間牡丹皮進(jìn)行比較。

5 結(jié)論與討論

5.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選定

實(shí)驗(yàn)在用HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地牡丹皮進(jìn)行指紋圖譜的研究時(shí)，利用DAD全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)，在190～400 nm的色譜圖中，參考丹皮酚的檢測(cè)波長(zhǎng)，選定274 nm作為本次實(shí)驗(yàn)研究的檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，HPLC顯示的色譜峰較少；參考芍藥苷的檢測(cè)波長(zhǎng)，選取藥典所規(guī)定的芍藥苷檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm作為指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，色譜圖基線漂移明顯；選取248 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，所顯示的HPLC色譜圖基線平穩(wěn)、峰的數(shù)目較多，并且峰的峰形與分離度都較好，能夠?qū)崿F(xiàn)較為理想的分離效果，故此選擇248 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)牡丹皮及其它樣品HPLC 指紋圖譜研究。

5.2 含量測(cè)定與指紋圖譜相似度分析結(jié)果討論

化學(xué)成分含量的比較往往是鑒定、區(qū)分中藥好壞的重要指標(biāo)之一，但單純的比較單個(gè)成分的多少進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分，缺乏整體觀念，而指紋圖譜法有著信息量大，“整體性”和“模糊性”為顯著特點(diǎn)，因此通過(guò)不同產(chǎn)地指紋圖譜進(jìn)行比較可以對(duì)不同產(chǎn)地藥材進(jìn)行區(qū)分。本文采用含量測(cè)定與指紋圖測(cè)定同時(shí)進(jìn)行的方法，在保證區(qū)分度的前提下，相較于單獨(dú)進(jìn)行含測(cè)和指紋圖譜分析，減少分析所需時(shí)長(zhǎng)，與一測(cè)多評(píng)相符合，可作為牡丹皮質(zhì)量評(píng)價(jià)的補(bǔ)充。