薛 瑞，楊良竹，王永利，李 文，宋麗蘋(píng)，李 琛

(1 玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100;2 云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650000)

多孔淀粉又名微孔淀粉、有孔淀粉，是由對(duì)生淀粉具有水解活力的酶在低于糊化溫度下降解淀粉得到的水解產(chǎn)物，這個(gè)定義是1998年日本學(xué)者長(zhǎng)谷川信弘才首次提出的[1]。多孔淀粉，是一種新型的變性淀粉，淀粉顆粒表面呈現(xiàn)的是蜂窩狀，與天然淀粉相比，具有較大的比表面積及良好的吸附性能[2-3]。同時(shí)，多孔淀粉還具有很好的安全性、易降解等優(yōu)點(diǎn)，這些特性使多孔淀粉被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，主要用在微膠囊芯材、吸附各種功能性物質(zhì)等方面[4-6]。目前，日本和美國(guó)對(duì)多孔淀粉的研究較多，研究?jī)?nèi)容多為多孔淀粉的制備、應(yīng)用及改性等[7]。多孔淀粉的制備方法主要有化學(xué)法、物理法、復(fù)合酶解法、溶膠-凝膠法、酸法等，其中復(fù)合酶法制備的多孔淀粉成孔效果較好[8-9]。我國(guó)是全球的水稻“王國(guó)”，稻谷產(chǎn)量居世界第一，大米中淀粉和蛋白質(zhì)含量分別約是80%和8%，從含量上看大米是制取多孔淀粉很好的原料。本文選取大米淀粉為原料，采用復(fù)合酶法來(lái)制備多孔淀粉，期望可以制備出高吸附性能的多孔淀粉，為其在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑

大米淀粉，Sigma-Aldrich (上海)貿(mào)易有限公司；一水合檸檬酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糖化酶、α-淀粉酶，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；色拉油，上海日清油脂有限公司。

1.2 儀 器

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；TD5A-WS型離心機(jī)，廣州深華生物技術(shù)有限公司；AR1140型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大米多孔淀粉的制備[10]

用分析天平準(zhǔn)確稱取大米淀粉10 g，加入適量磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH，攪拌均勻，預(yù)熱15 min，加入復(fù)合酶(α-淀粉酶+糖化酶)，反應(yīng)完成后，用5 mL 4%濃度的氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)，將沉淀過(guò)濾洗滌，烘干至恒重，即得大米多孔淀粉產(chǎn)物。

1.3.2 多孔淀粉吸附性能的測(cè)定[11]

準(zhǔn)確稱取多孔淀粉1 g于兩個(gè)燒杯中，前者加入10 mL色拉油，后者加入10 mL蒸餾水，置于磁力攪拌器上攪拌30 min，分別將混合液倒入砂芯漏斗中抽濾，直至沒(méi)有油滴或水滴滴下為止，記錄砂芯漏斗前后的質(zhì)量，按公式1進(jìn)行吸油率、吸水率計(jì)算。

(1)

式中：m1為抽濾前砂芯漏斗的質(zhì)量,g；m2為抽濾后砂芯漏斗的質(zhì)量,g;m為稱取多孔淀粉的質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與討論

2.1 大米多孔淀粉的形貌

通過(guò)掃描電鏡(SEM)對(duì)大米多孔淀粉的形貌進(jìn)行觀察，如圖1所示。可以看出，采用復(fù)合酶法制備的大米多孔淀粉顆粒表面呈蜂窩狀，分布著很多小孔，孔徑不大，小孔由顆粒表面向中心延伸，顆粒較完整。

圖1 大米多孔淀粉的掃描電鏡圖Fig.1 SEM image of rice porous starch

2.2 大米多孔淀粉制備工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

以吸油率和吸水率為吸附性能的指標(biāo)，考察pH值、酶用量、酶配比(α-淀粉酶：糖化酶)、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和淀粉濃度對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響，并進(jìn)一步通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到最佳的制備工藝。

2.2.1 pH值的影響

在酶用量1.2%，酶配比(α-淀粉酶:糖化酶)1:2，反應(yīng)時(shí)間12 h，反應(yīng)溫度50 ℃，淀粉濃度40%的條件下，研究不同pH值對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH值對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響Fig.2 The effect of pH value on adsorption properties of rice porous starch

可以看出，大米多孔淀粉的吸附性能隨著pH值的增加先升高后降低，當(dāng)pH值為5.5時(shí)，吸油率和吸水率最大，此時(shí)吸附性能最好。這可能是由于當(dāng)pH值≤5.5時(shí)，隨著pH值的升高，復(fù)合酶的活性逐漸增強(qiáng)，從而對(duì)淀粉的酶解作用加強(qiáng)，淀粉的吸附性能得到提高。當(dāng)pH值≥6.0后，復(fù)合酶的活性降低，限制了淀粉的酶解過(guò)程，成孔減少，淀粉的吸附性能下降。因此，本反應(yīng)體系的最佳pH值為5.5。

2.2.2 酶用量的影響

在pH值5.5，酶配比(α-淀粉酶:糖化酶)1:2，反應(yīng)時(shí)間12 h，反應(yīng)溫度50 ℃，淀粉濃度40%的條件下，研究不同酶用量對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶用量對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響Fig.3 The effect of enzyme dosage on adsorption properties of rice porous starch

可以看出，大米多孔淀粉的吸附性能隨著酶用量的增加先升高后降低，當(dāng)酶用量為1.2%時(shí)，吸油率和吸水率均達(dá)到最大值，吸附性能最優(yōu)。這可能是因?yàn)楫?dāng)酶用量≤1.2%時(shí)，隨著酶用量的增加，淀粉酶解反應(yīng)的速度加快，成孔較多，吸附性能得到提高。當(dāng)酶用量≥1.4%時(shí)，隨著酶用量的增加，淀粉酶解速度過(guò)快，破壞成孔的空間結(jié)構(gòu)甚至導(dǎo)致淀粉顆粒結(jié)構(gòu)崩解，吸附性能迅速下降。因此，本反應(yīng)體系的最佳酶用量為1.2%。

2.2.3 酶配比的影響

在pH值5.5，酶用量1.2%，反應(yīng)時(shí)間12 h，反應(yīng)溫度50 ℃，淀粉濃度40%的條件下，研究復(fù)合酶不同的酶配比對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶配比對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響Fig.4 The effect of enzyme ratio on adsorption properties of rice porous starch

可以看出，大米多孔淀粉的吸附性能隨著α-淀粉酶：糖化酶比值的降低先升高后降低，在酶配比為1:2時(shí)，吸附性能最優(yōu)。這可能是因?yàn)槎嗫椎矸鄣男纬蛇^(guò)程首先是由糖化酶(外切型淀粉酶)作用于淀粉的非還原性末端，隨機(jī)切開(kāi)淀粉的α-1,4和α-1,6等糖苷鍵，將淀粉顆粒表面容易水解的無(wú)定形區(qū)酶解形成小孔。隨后，α-淀粉酶(內(nèi)切型淀粉酶)通過(guò)溶脹作用進(jìn)入淀粉顆粒內(nèi)部，隨機(jī)水解淀粉的α-1,4糖苷鍵，為糖化酶的水解提供新的非還原性末端?？偟膩?lái)說(shuō)，α-淀粉酶和糖化酶是協(xié)同水解向淀粉顆粒內(nèi)部推進(jìn)，從而形成淀粉的多孔結(jié)構(gòu)。因此，只有當(dāng)α-淀粉酶和糖化酶在一定配比時(shí)，成孔效果最好，多孔淀粉的吸附性能最佳，本反應(yīng)體系的最佳酶配比為1:2。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

在pH值5.5，酶用量1.2%，酶配比(α-淀粉酶:糖化酶)1:2，反應(yīng)溫度50 ℃，淀粉濃度40%的條件下，研究不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響Fig.5 The effect of reaction time on adsorption properties of rice porous starch

可以看出，大米多孔淀粉的吸附性能隨著反應(yīng)時(shí)間的增加先升高后降低，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為12 h時(shí)，吸附性能最佳。這可能是由于剛反應(yīng)時(shí)，淀粉顆粒隨著時(shí)間的增加而吸水溶脹，復(fù)合酶更容易與淀粉結(jié)合發(fā)生水解反應(yīng)，達(dá)到一定時(shí)間后，淀粉顆粒的水解作用充分，成孔數(shù)量多，孔徑大且深，此時(shí)吸附性能優(yōu)異。但是，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，淀粉顆粒進(jìn)一步被水解，可能會(huì)造成孔洞結(jié)構(gòu)的破壞甚至崩解，導(dǎo)致吸附性能迅速下降。因此，本反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)時(shí)間為12 h。

2.2.5 反應(yīng)溫度的影響

在pH值5.5，酶用量1.2%，酶配比(α-淀粉酶:糖化酶)1:2，反應(yīng)時(shí)間12 h，淀粉濃度40%的條件下，研究不同反應(yīng)溫度對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 反應(yīng)溫度對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響Fig.6 The effect of reaction temperature on adsorption properties of rice porous starch

可以看出，大米多孔淀粉的吸附性能隨著反應(yīng)溫度的增加先升高后降低，當(dāng)反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí)，吸附性能最好。這可能是因?yàn)閯傞_(kāi)始隨著反應(yīng)溫度的升高，復(fù)合酶達(dá)到了適宜溫度，活性增強(qiáng)。同時(shí)，淀粉顆粒的溶脹性隨著溫度的升高而增加，進(jìn)一步促進(jìn)了復(fù)合酶的水解作用，提高了淀粉顆粒的成孔率。而當(dāng)溫度繼續(xù)升高，復(fù)合酶的活性降低，淀粉顆粒增加的溶脹性抵不過(guò)前者的損失，酶解速率下降，限制了淀粉多孔結(jié)構(gòu)的形成。因此，本反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)溫度為55 ℃。

2.2.6 淀粉濃度的影響

在pH值5.5，酶用量1.2%，酶配比(α-淀粉酶:糖化酶)1:2，反應(yīng)時(shí)間12 h，反應(yīng)溫度55 ℃的條件下，研究不同淀粉濃度對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 淀粉濃度對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響Fig.7 The effect of starch concentration on adsorption properties of rice porous starch

可以看出，大米多孔淀粉的吸附性能隨著淀粉濃度的增加先升高后降低，當(dāng)?shù)矸蹪舛葹?0%時(shí)，吸附性能達(dá)到最大值。這可能是由于當(dāng)?shù)矸蹪舛容^低時(shí)，復(fù)合酶和淀粉在溶液中較為分散，復(fù)合酶不容易吸附到淀粉顆粒表面進(jìn)行水解作用，吸附性能較低。當(dāng)濃度繼續(xù)增加，復(fù)合酶和淀粉能充分接觸并發(fā)生反應(yīng)，吸附性能增強(qiáng)。但是，當(dāng)?shù)矸蹪舛容^高時(shí)，體系黏度增加，很難形成均一體系，復(fù)合酶可能只與部分淀粉反應(yīng)，酶解不充分，吸附性能降低。因此，本反應(yīng)體系的最佳淀粉濃度為30%。

2.3 大米多孔淀粉制備工藝的正交實(shí)驗(yàn)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)可得對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響為：酶用量>反應(yīng)時(shí)間>pH值>酶配比>反應(yīng)溫度>淀粉濃度。因此，在反應(yīng)溫度55 ℃，淀粉濃度30%的條件下，以大米多孔淀粉的吸附性能(吸油率)為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)的方法，考察影響最大的四種單因素，優(yōu)化大米多孔淀粉的制備工藝。

表1 正交實(shí)驗(yàn)四因素三水平表Table 1 Four factors and three levels of orthogonal test

表2為四種單因素中，對(duì)大米多孔淀粉吸附性能影響。由表2可以看出，最大的是反應(yīng)時(shí)間，其次是酶用量和酶配比，pH值的影響最小。同時(shí)，得到大米多孔淀粉制備工藝的最佳條件為：pH值5.0，酶用量1.2%，酶配比1:2，反應(yīng)時(shí)間16 h，反應(yīng)溫度55 ℃，淀粉濃度30%。在此實(shí)驗(yàn)條件下制備大米多孔淀粉，測(cè)得吸油率為51.38%，吸水率為178.65%。同時(shí)，測(cè)得大米原淀粉的吸油率為17.89%，吸水率為98.21%，不難發(fā)現(xiàn)，大米多孔淀粉的吸附性能有了極大的提高。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The design and results of orthogonal test

3 結(jié) 論

通過(guò)復(fù)合酶法制備的大米多孔淀粉顆粒表面分布著很多小孔，呈蜂窩狀。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析，得到各因素對(duì)大米多孔淀粉吸附性能的影響因素為：酶用量>反應(yīng)時(shí)間>pH值>酶配比>反應(yīng)溫度>淀粉濃度。采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)大米多孔淀粉的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的制備工藝為：pH值5.0，酶用量1.2%，酶配比1:2，反應(yīng)時(shí)間16 h，反應(yīng)溫度55 ℃，淀粉濃度30%，此時(shí)制得的大米多孔淀粉吸油率為51.38%，吸水率為178.65%。