羅洋洋，李群輝，林麗苗，周慶豐

(溫氏食品集團股份有限公司 溫氏集團研究院，廣東 新興 527400)

禽腺病毒(Fowl aviadenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科、禽腺病毒屬的一種無囊膜的雙鏈DNA病毒，核衣核呈20面體對稱，病毒顆粒直徑為70～90 nm，根據(jù)其特異性抗原的不同可分為Ⅰ、Ⅱ群和Ⅲ群[1]。Ⅰ群禽腺病毒根據(jù)交叉中和試驗分為12個血清型(FAdV1～12)，其代表株為雞胚致死孤兒病毒(Chicken embryo lethal orphan virus，CELOV)[2-3]。I亞群腺病毒呈全球性分布，嚴(yán)重的主要表現(xiàn)為包涵體肝炎(Inclusion body hepatitis,IBH)、心包積水綜合征(Hydropericardium syndrome,HPS)、肌胃糜爛和潰瘍(Gizzard erosion and lceration,GEU)[4-5]。

近年來，由I亞群血清4型感染導(dǎo)致的心包積水-包涵體肝炎綜合征發(fā)病較為廣泛[6-9]，由于其發(fā)病迅速、且發(fā)病和死亡率均較高，對我國家禽養(yǎng)殖造成了較大影響，因此，快速、準(zhǔn)確的診斷能夠最大限度的降低養(yǎng)殖場的損失。

本試驗利用熒光定量PCR技術(shù)，根據(jù)FAdV-4的Hexon基因保守序列設(shè)計了1對特異性引物和探針，建立了禽血清4型腺病毒的TaqMan實時熒光定量PCR方法，為禽血清4型腺病毒的早期診斷、臨床樣品的大量檢測以及定量分析提供了重要的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 毒株及臨床樣品 FAdV-4毒株由本實驗室分離鑒定所得。雞新城疫病毒(Newcastal disease virus,NDV)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、雞傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)、雞痘病毒(Fowlpox virus,FPV)、血清8a型禽腺病毒(Fowl aviadenovirus 8a,FAdV-8a)、血清8b型禽腺病毒(Fowl aviadenovirus 8b,FAdV-8b)，均由廣東溫氏食品集團股份有限公司養(yǎng)禽事業(yè)部生產(chǎn)管理室分離保存。臨床樣品均采自廣東區(qū)域及周邊疑似發(fā)病雞場。

1.2 主要試劑 RaPure Viral RNA/DNA Kits、HiPure Gel Pure Micro Kit，均購自美基生物公司；Plasmid Mini Kit，購自美國Omega Bio-Tek公司；PrimeSTAR Premix、ExTaqPremix、Loading Buffer、RNA-free water、DNA DL-2 000 Marker、T-Vetor pMD19(Simple)、DH-5α competent cell，均購自寶生物工程(大連)有限公司;TaqManTMFast Advanced Master Mix、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Systems，均購自Life公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計 根據(jù)NCBI中公布的FAdV-4 的Hexon基因序列的保守區(qū)域，設(shè)計了1對普通PCR引物和TaqMan熒光定量PCR引物和探針，引物序列及擴增位置見表1。

表1 普通PCR和熒光定量PCR引物

1.4 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備 按照美基生物的RaPure Viral RNA/DNA Kits提取病毒的總核酸，用普通PCR引物擴增Hexon基因的保守區(qū)目的片段。擴增體系(50 μL)：PrimeSTAR Premix 25 μL，Primer F/R 2 μL+2 μL，ddH2O 19 μL，DNA 2 μL；反應(yīng)條件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 25 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。將擴增產(chǎn)物克隆至T-Vetor pMD19(Simple)載體上，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH-5α 感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，涂于LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上進行藍(lán)白斑篩選，提取重組質(zhì)粒，用微量紫外分光光度計測定其濃度，根據(jù)拷貝數(shù)換算公式：拷貝數(shù)/μL=(質(zhì)粒濃度×10-9×稀釋倍數(shù)×6.02×1023)/(660道爾頓×堿基數(shù))，計算拷貝數(shù)。

1.5 FAdV-4 TaqMan 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 用構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板進行反應(yīng)條件的優(yōu)化，體系20 μL。分別選擇0.1、0.2、0.3、0.4 μmol/L和0.5 μmol/L的引物終濃度，0.1、0.2、0.4、0.6、0.8μmol/L和1.0 μmol/L的探針濃度和56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃和60 ℃的退火溫度進行TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)，獲得最低的Ct值和最高的熒光強度增加量(△Rn)時的反應(yīng)條件為最佳反應(yīng)條件。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將制備的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行10倍梯度稀釋，選取7.3×108、7.3×107、7.3×106、7.3×105、7.3×104拷貝/μL和7.3×103拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，設(shè)立陰性對照，重復(fù)3次，按照優(yōu)化的最佳條件進行TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)，獲得其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗 利用構(gòu)建的定量PCR方法，對NDV、AIV、IBV、ILT、IBDV、FPV、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-4進行檢測，檢驗該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗 以各稀釋梯度(7.3×108～7.3×101拷貝/μL)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板進行TaqMan熒光定量PCR和普通PCR檢測，確定能檢出的最低濃度，比較2種方法的敏感性差異。

1.9 重復(fù)性試驗 選取標(biāo)準(zhǔn)品中7.3×108、7.3×107、7.3×106、7.3×105、7.3×104拷貝/μL和7.3×103拷貝/μL共6個梯度的樣品作為模板，每個樣品做3個重復(fù)檢測，并分別以上述6個稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，分3次進行熒光定量PCR檢測，根據(jù)Ct值計算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)，評價該方法的重復(fù)性。

1.10 臨床樣品的檢測 從廣東省10個養(yǎng)雞場采取50份FAdV-4疑似發(fā)病雞只的肝臟，提取其核酸，分別進行普通PCR和TaqMan熒光定量PCR檢測，計算2種檢測方法的陽性率并進行比較。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 利用引物FAdV-4 F1/R1對Hexon基因的目的片段進行擴增，將其克隆至T-Vetor pMD19(Simple)載體上，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。提取的重組質(zhì)粒DNA濃度為335 ng/μL，經(jīng)公式計算其拷貝數(shù)為7.3×1010拷貝/μL。

2.2 TaqMan 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 經(jīng)條件優(yōu)化表明：采用0.2 μmol/L的引物終濃度和0.2 μmol/L的探針終濃度，退火溫度選擇60 ℃，可使反應(yīng)獲得最低的Ct值和最高的熒光強度增加量(△Rn)。標(biāo)準(zhǔn)品濃度從7.3×103～7.3×108拷貝/μL共6個梯度為擴增模板，得到良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為：Ct=-3.681 lgX+42.984，相關(guān)系數(shù)R2=0.997。

圖1 FAdV-4熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR assay for the detection of FAdV-4

2.3 特異性試驗 利用構(gòu)建的熒光定量PCR方法對FAdV-4、NDV、AIV、IBV、IBDV、ILTV、FPV、FAdV-8a和FAdV-8b 進行熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示：只有FAdV-4有明顯的擴增曲線，其他8種病毒無明顯的熒光信號(圖2)。表明該方法特異性良好，同上述病毒無交叉反應(yīng)。

圖2 FAdV-4熒光定量特異性試驗Fig.2 Specificity test of TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR assayA：FAdV-4；B：AIV、NDV、IBV、IBDV、ILTV、FPV、FAdV-8a、FAdV-8b和陰性對照A:FAdV-4;B:AIV,NDV,IBV,IBDV,ILTV,FPV,FAdV-8a,FAdV-8b and negative control

2.4 敏感性試驗 分別以各梯度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進行熒光定量檢測，結(jié)果顯示，最小檢出的梯度為7.3×101拷貝/μL(中插彩版圖3)；再以相同梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進行普通PCR檢測，結(jié)果顯示，可檢出的最小梯度為7.3×103拷貝/μL(圖4)。表明本試驗構(gòu)建的熒光定量PCR方法比普通PCR敏感性提高了100倍。

圖4 FAdV-4普通PCR敏感性試驗Fig.4 Sensitivity test of conventional PCR assayM:DNA Marker;1～8:重組質(zhì)粒濃度為7.3×108～ 7.3×101拷貝/μL;9:陰性對照M:DNA Marker;1～8:Recombinant plasmid diluted from 7.3×108～ 7.3×101copies/μL;9:Negative control

2.5 重復(fù)性試驗 對同一批次稀釋的5個標(biāo)準(zhǔn)品分別進行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間試驗的標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.5，變異系數(shù)均小于2%，表明本試驗構(gòu)建的TaqMan熒光定量PCR方法的重復(fù)性良好。

2.6 臨床樣品的檢測 對采集的50份疑似發(fā)病樣品用熒光定量和普通PCR進行檢測，結(jié)果顯示，用本試驗構(gòu)建的TaqMan熒光定量方法檢出16份陽性樣品，而普通PCR僅檢出11份陽性樣品，且普通PCR方法同熒光定量的符合率達(dá)到100%。由此可見，本試驗建立的TaqMan熒光定量PCR具有更高的靈敏度。

3 討論

2015以來，我國各地陸續(xù)暴發(fā)了心包積水-包涵體肝炎綜合征，該病主要發(fā)生于3周齡以上的肉雞，包括 817、肉雜等品種，自然發(fā)病日齡最小的為 7 日齡，發(fā)病后4～8 d為死亡高峰，病程為 8～15 d，死亡率20%～80%不等。發(fā)病日齡越小，死亡率越高。同時 20～70日齡以及 200～300 日齡的蛋雞也有發(fā)生該病，但死亡率低于肉雞，后被證實為I亞群血清4型禽腺病毒感染[10-11]。在此之后，多個品種的鴨也分離到了FAdV-4[12-13]，給國內(nèi)的養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。因此，早期快速、準(zhǔn)確的診斷成為防控該病的重要環(huán)節(jié)，在很大程度上能夠降低經(jīng)濟損失，所以建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定的檢測方法顯得尤為迫切。

表2 FAdV-4熒光定量批內(nèi)重復(fù)試驗

表3 FAdV-4熒光定量批間重復(fù)試驗

目前對于FAdV-4的檢測主要靠傳統(tǒng)的PCR方法。眾所周知，傳統(tǒng)的PCR方法需要經(jīng)過核酸提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、基因測序等相對繁瑣的步驟，且靈敏度相比實時熒光定量PCR方法要低[14]。熒光定量PCR技術(shù)發(fā)明以來，由于其快速、敏感、特異、實時等一系列優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用于疾病診斷和檢測。六鄰體(Hexon)是禽腺病毒目前研究最廣泛的蛋白，是主要的衣殼蛋白，含有型、群、亞群特異性抗原決定簇[15]。本試驗利用熒光定量PCR技術(shù)，根據(jù)FAdV-4六鄰體基因的保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，建立了FAdV-4的TaqMan熒光定量PCR方法。

用建立的TaqMan熒光定量PCR方法對其他家禽常見病原進行特異性驗證，結(jié)果顯示，無其他非特異性擴增曲線；靈敏性試驗顯示，該方法可檢出的最小病毒濃度為7.3×101拷貝/μL，是普通PCR靈敏度的100倍；批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于2%，表明該方法具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性。除此之外，TaqMan熒光定量PCR方法無需通過電泳即可得出結(jié)果，既能縮短臨床樣品檢測的時間，也可避免操作繁瑣而造成的樣品污染，同時降低了操作人員接觸有毒物質(zhì)的風(fēng)險。