丁秀秀，謝甜，黃奕江

（海南省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科，海南 ?？?570311）

特發(fā)性肺纖維化是一種慢性間質性肺病，其發(fā)病率、致死率均較高，嚴重威脅患者生命安全[1-2]。該病影像學下可見肺基底部斑片狀、網格狀玻璃影，支氣管牽拉或擴張，嚴重者可發(fā)生蜂窩狀改變[3]；臨床主要表現為咳嗽、呼吸困難，嚴重者可發(fā)生呼吸衰竭，甚至死亡[4-5]。目前，關于特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病機制尚未明確，因此，尋找其發(fā)病原因有利于早期預防、早期干預，對特發(fā)性肺纖維化具有重要臨床意義。

氧化應激反應時，活性氧簇大量產生，而纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor-21, FGF-21）可抑制活性氧簇從而抑制一系列應激反應[6]。相關研究發(fā)現，FGF-21 與腎纖維化具有相關性[7]。但目前關于FGF-21 在特發(fā)性肺纖維化中的變化及其臨床意義研究甚少。巨噬細胞炎性蛋白2（macrophage inflammatory protein-2, MIP-2）是肺泡巨噬細胞以及呼吸道上皮細胞分泌的蛋白質產物，部分研究發(fā)現，MIP-2 在博來霉素致肺纖維化中起重要作用[8]，但目前關于MIP-2 在特發(fā)性肺纖維化中變化的研究較少。因此，本研究通過檢測特發(fā)性肺纖維化患者中肺組織FGF-21、MIP-2的表達的變化，研究兩者在特發(fā)性肺纖維化中的作用及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

根據《特發(fā)性肺纖維化診斷和治療中國專家共識》特發(fā)性肺纖維的診斷標準[2]，選取2013年12月— 2018年12月海南省人民醫(yī)院確診的特發(fā)性肺纖維化患者80例。其中，男性43例，女性37例；年齡50 ～ 80 歲，平均（69.73±5.67）歲。

排除標準：①其他呼吸系統(tǒng)疾病，如慢性阻塞性肺疾病、肺氣腫、哮喘、肺炎、肺栓塞、肺結核、肺梗死等；②惡性腫瘤患者；③合并其他急重癥，如急性腦卒中、心臟病、休克、腦梗死、肝腎疾病、急性冠狀動脈綜合征者；④近期接受免疫抑制劑治療的 患者。

1.2 主要儀器與試劑

FGF-21 及MIP-2 酶聯免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司），PFT System 肺功能儀、飛利浦彩色多普勒超聲診斷儀（蘇州Philips有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 組織標本采集取距病灶邊緣＜1 cm 肺組織且經病理學檢查證實為特發(fā)性肺纖維化為研究對象；取超過肺纖維化邊緣＞2 cm 的肺旁組織為對照。于離體10 min 內迅速投入液氮中保存。

1.3.2 檢測方法Western blotting 檢測FGF-21、MIP-2 蛋白水平，取0.1 g 特發(fā)性肺纖維化組織及肺旁正常組織，勻漿后抽提總蛋白。用BCA 蛋白濃度試劑盒檢測蛋白含量。取20 μg 蛋白行10% SDS-PAGE后轉聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗相應抗體后于4℃孵育過夜。使用TBST 洗膜3 次，加入Ⅱ抗余室溫孵育1 h，使用TBST再次洗膜3 次，ECL 發(fā)光自顯影。分別以FGF-21、MIP-2 蛋白條帶密度與GAPDH 條帶吸光度比值表示FGF-21、MIP-2 蛋白的相對表達量。

逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測FGF-21 mRNA 和MIP-2 mRNA 的表達水平，采用Trizol 法抽提特發(fā)性肺纖維化組織及肺旁正常組織中的總RNA：取各標本組織50 mg，在組織標本中加入1 ml Trizol 研磨至均質，吸取勻漿液1.5 ml 至EP 管中，加入氯仿離心后取上清液，加入等量異丙嗪，離心后取沉淀物，75%乙醇洗滌后加入RNase-Free H2O2溶解RNA，適當稀釋后用紫外分光光度計在260 和280 nm 波長處測定RNA 純度，控制RNA A260/A280 純度一致。使用PrimeScript ? RT Master 試劑盒，按照說明書進行操作，加樣后行RT-PCR，使RNA 逆轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，GAPDH 為內參，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應，嚴格按照試劑盒說明書進行PCR反應。

1.4 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗或方差分析；利用條件Logistic 回歸分析特發(fā)性肺纖維化的相關因素，利用Cox 回歸分析特發(fā)性肺纖維化患者臨床預后的相關因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 特發(fā)性肺纖維化組織及肺旁正常組織FGF-21 和MIP-2 mRNA 及蛋白的表達

特發(fā)性肺纖維化組織中FGF-21 和MIP-2 mRNA及蛋白的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），特發(fā)性肺纖維化組織較肺旁正常組織升高。見表1 和圖1、2。

2.2 特發(fā)性肺纖維化組織FGF-21 mRNA 和MIP-2 mRNA 的表達與臨床病理特征的關系

FGF-21 mRNA 和MIP-2 mRNA 的表達水平與患者性別、年齡、吸煙、BMI 和病程無關（P＞0.05）。見表2。

2.3 特發(fā)性肺纖維化相關因素的條件Logisitic 回歸分析

將特發(fā)性肺纖維化作為因變量（肺纖維化組織賦值=1；肺旁正常組織賦值=0），將FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA作為自變量，構建Logistic回歸分析模型，結果表明，特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生與FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA 呈正相關（P＜0.05）。見表3。

表1 正常組織及特發(fā)性肺纖維化組織FGF-21、MIP-2 mRNA 和蛋白的表達 （n =80，±s）

表1 正常組織及特發(fā)性肺纖維化組織FGF-21、MIP-2 mRNA 和蛋白的表達 （n =80，±s）

組別 FGF-21 mRNA MIP-2 mRNA FGF-21 蛋白 MIP-2 蛋白特發(fā)性肺纖維化組織 3.06±0.46 23.48±1.44 2.78±0.53 18.36±1.21肺旁正常組織 2.10±0.35 16.20±1.27 2.42±0.49 13.85±1.33 t 值 14.855 33.913 4.461 22.435 P 值 0.001 0.001 0.001 0.001

圖1 PCR 原始數據圖

圖2 FGF-21、MIP-2、GAPDH 蛋白表達

表2 FGF-21 mRNA 和MIP-2 mRNA 表達與臨床病理特征的關系

續(xù)表2

2.4 特發(fā)性肺纖維化預后的Cox 回歸分析

將患者的結局變量作為分類變量（生存賦值=1，死亡賦值=0），將患者的生存時間作為連續(xù)變量，將性別、年齡、BMI、吸煙史、病程、FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA 作為自變量，構建Cox 回歸分析模型，結果顯示，FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA 的高表達水平是影響特發(fā)性肺纖維化患者臨床預后的獨立危險因素，見表4。

表3 特發(fā)性肺纖維化相關因素的Logistic 回歸分析參數

表4 特發(fā)性肺纖維化患者臨床預后的Cox 回歸分析參數

3 討論

特發(fā)性肺纖維化是一種慢性纖維化肺疾病，并呈進行性進展。該病常見于中老年人，臨床主要表現為咳嗽、呼吸困難、呼吸衰竭、低氧血癥等，嚴重影響患者的生命質量和安全[9]。但目前關于特發(fā)性肺纖維化的病因尚未明確，給治療帶來極大限制，因而尋找特發(fā)性肺纖維化的病因從而對其進行早期預防、干預具有重要臨床意義。

FGF-21 是成纖維細胞生長因子超家族中的一種，其通過輔因子β-Klotho 蛋白的作用與細胞表面的成纖維細胞生長因子受體結合，形成FGF-21-β-Klotho-FGFR 復合體而發(fā)揮生物學作用。FGF-21 功能較多，可參與機體多種物質代謝，如葡萄糖、脂肪等，其可降低血糖、血脂，改善胰島素抵抗及胰島細胞功能等[10]。相關研究表明，FGF-21 參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。例如，糖尿病性大血管病變、糖尿病合并頸動脈斑塊的患者血清FGF-21 水平升高[11]，發(fā)生FGF-21 抵抗。另外，研究發(fā)現[12-13]，FGF-21 還可通過激活Nrf2 而抑制NF-κB 信號通路，從而抑制巨噬細胞介導的體內炎癥反應，其在關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。此外，FGF-21 還可通過抑制APAP 而抑制氧化應激反應、抑制IL-6、TNF-α、C 反應蛋白的表達，以及抑制血小板的聚集和活化等。但目前關于FGF-21 在特發(fā)性肺纖維化中是否起重要作用的研究甚少。本研究結果顯示，特發(fā)性肺纖維化組織FGF-21 mRNA 及蛋白的表達水平較肺旁正常組織升高；FGF-21 mRNA 的表達水平與患者性別、年齡、吸煙、BMI 和病程無關；條件Logistic 回歸分析模型結果表明，特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生與FGF-21 mRNA 呈正相關；結果表明，FGF-21 參與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生及發(fā)展。本研究中Cox 回歸分析結果顯示，FGF-21 mRNA的高表達水平是影響特發(fā)性肺纖維化患者臨床預后的獨立因素，結果表明，FGF-21 與特發(fā)性肺纖維化的預后具有重要關系。相關研究發(fā)現，發(fā)生氧化損傷時可降低機體FGF-21 蛋白的表達量，FGF-21 蛋白與氧化應激具有相關性，使用FGF-21 蛋白可逆轉小鼠的肺纖維化癥狀[15]。因此，對特發(fā)性肺纖維化患者可抑制機體FGF-21 mRNA 的表達水平從而進行早期治療，從而 有助于改善預后。

MIP-2 蛋白是肺泡巨噬細胞分泌的蛋白產物，其具有特異性，專作用于中性粒細胞，可發(fā)揮趨化和激活作用[15]。在炎癥早期，NF-κB 被激活并調節(jié)MIP-2基因的轉錄，機體分泌MIP-2 增加，特異性趨化中性粒細胞及巨噬細胞的重要因子。MIP-2 參與多種疾病，如膿毒癥、盆腔炎、呼吸道疾病等。相關研究表明，當呼吸道受到刺激或損害時，如吸煙、污染、細菌或病毒等，巨噬細胞、中性粒細胞可快速合成并分泌大量MIP-2[16]。有研究表明[17]，MIP-2 蛋白可增加相關炎癥因子的合成與分泌，誘導炎癥因子發(fā)生浸潤，從而增加血管通透性。據報道[18]，在博來霉素致肺纖維化的大鼠中，MIP-2 升高，而地塞米松可抑制MIP-2 的表達并降低炎癥反應。但目前關于MIP-2 與人類特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生及發(fā)展的研究甚少。本研究結果顯示，特發(fā)性肺纖維化組織MIP-2 mRNA 的表達水平較肺旁正常組織升高；MIP-2 mRNA 的表達水平與患者性別、年齡、吸煙、BMI 和病程無關；Logistic 回歸分析模型結果表明，特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生與MIP-2 mRNA 呈正相關；結果表明，MIP-2 參與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生及發(fā)展。本研究中Cox 回歸分析結果顯示，MIP-2 mRNA 的高表達水平是影響特發(fā)性肺纖維化患者臨床預后的獨立因素，結果表明，MIP-2 與特發(fā)性肺纖維化的預后具有重要關系。因此，對疑似特發(fā)性肺纖維化患者，可檢測MIP-2 mRNA 的表達水平從而進行診斷并早期干預。

綜上所述，FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA 的高表達水平是特發(fā)性肺纖維化發(fā)生的相關因素，并與臨床預后相關。臨床對于特發(fā)性肺纖維化患者可降低機體FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA 的表達水平，從而延長患者生存時間。