熊逸晨，吳瀚楓，張恩婷，蘇寶玲，胡展恒

（1.廣州中醫(yī)藥大學 深圳臨床醫(yī)學院,廣東 深圳 518116；2.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,廣東 廣州 511400）

急性痛風性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis, AGA）是體內(nèi)嘌呤代謝異常所致的常見疾病，主要表現(xiàn)在血尿酸升高和尿酸鈉（monosodium urate, MSU）晶體沉積兩方面[1]。MSU 作為異物沉積在關(guān)節(jié)滑膜、軟骨等處，白細胞因此聚集進入滑液，吞噬MSU，釋放白細胞介素-1（Interleukin-1, IL-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α)等炎癥因子，誘發(fā)炎癥[2]。同時，AGA 還是一些心血管疾病、泌尿系統(tǒng)疾病的危險因素[3]。

現(xiàn)今西藥治療AGA 已經(jīng)較為成熟，但臨床容易出現(xiàn)嚴重的胃腸道反應、血細胞減少、肝腎功能不全、彌散性血管內(nèi)凝血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害等不良反應[4]， 故近年來中藥抗AGA 愈加得到學者們的重視。有研究表明，葛根素單獨或配以其他藥物，抗AGA 效果顯著，然而臨床治療尚未普及，也未闡明其作用機制?，F(xiàn)已明確AGA 的重要發(fā)病機制是由Toll 樣受體4 （TLR4）-核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路介導，激活的Toll 樣受體家族可誘導細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-1β 等促炎因子[5]，誘導炎癥反應的發(fā)生與進展。因此，本研究將基于TLR4/NF-κB 通路探討葛根素對AGA 的治療作用，探討葛根素抗AGA 的可能機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MSU（上海源葉生物科技有限公司）混懸液：用無菌生理鹽水配制成25 mg/ml 的MSU 混懸液，超聲溶解10 min，4℃冰箱保存，用前搖勻；葛根素（成都德斯特生物技術(shù)有限公司）溶液：用無菌生理鹽水配制成濃度為1 g/ml 葛根素溶液，超聲溶解10 min，4℃冰箱保存；秋水仙堿（四川省維克奇生物科技有限公司）溶液：用無菌生理鹽水配制成濃度為0.15 mg/ml 秋水仙堿溶液，超聲溶解10 min，4℃冰箱保存；TLR4 抗體、NF-κB（p65）抗體（上海寶曼生物科技有限公司），IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒（廣州妙博生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗動物與分組

選取成熟雄性SD 大鼠60 只作為研究對象，9 ～ 11 周齡，體重（200±15）g，由廣州中醫(yī)藥大學新藥開發(fā)與研究中心提供，許可證編號：SYXK（粵）2018-0085。實驗環(huán)境溫度控制在26℃左右，濕度穩(wěn)定在65%左右，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進食進水。適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為4 組：正常空白對照組（正常組）、模型陰性對照組（模型組）、秋水仙堿陽性對照組（秋水仙堿組）、葛根素實驗組（葛根素組），每組15 只。

1.3 動物模型復制

參照CODERRE 等[6]的方法復制模型，大鼠兩側(cè)后膝關(guān)節(jié)外側(cè)膝眼進針，正常組向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.2 ml無菌生理鹽水，其余3 組注射等量25 mg/ml MSU 混懸液。肉眼觀察大鼠膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫、僵硬，大鼠活動明顯受限，即顯示模型復制成功。

1.4 治療藥物干預方法

模型復制成功后48 h，葛根素組用1 g/ml 葛根素溶液灌胃，3.5 g/kg；秋水仙堿組用0.15 mg/ml 秋水仙堿溶液灌胃，1.5 mg/kg；正常組和模型組大鼠分別用等量生理鹽水灌胃；各組大鼠都以20 ml/kg 為灌胃量，灌胃2 次/d，延續(xù)2 周。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 AGA 大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度除正常組外，縛線法量取每只大鼠模型復制前1h 及末次灌胃后4h 膝關(guān)節(jié)周徑，在同一部位測量周徑3 次，取平均值。

1.5.2 ELISA 法檢測AGA 大鼠膝關(guān)節(jié)腔沖洗液IL-1β、TNF-α 含量除正常組外，分別在模型復制后48 h 和藥物干預2 周后，在AGA 大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉，常規(guī)碘伏消毒，解剖大鼠單側(cè)膝關(guān)節(jié)囊，用1 ml 無菌生理鹽水洗滌關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)腔洗滌液。嚴格按照ELISA 試劑盒說明書操作，測定IL-1β、TNF-α 的含量。

1.5.3 膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學觀察每組隨機抽取3 只大鼠作為1 個樣本，分離其膝關(guān)節(jié)滑膜組織，先由4%多聚甲醛固定，后置于4℃冰箱保存24 h，再用酒精和二甲苯梯度脫水，石蠟包埋、切片，厚度為4 μm，HE 染色，光學顯微鏡觀察各組膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化情況并對比各組間變化程度。

1.5.4 免疫組織化學法檢測AGA 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB 表達量分別在模型復制48 h和藥物干預2 周后，將上述切片脫蠟、水化、抗原完成熱修復后降溫至室溫，再用PBS 沖洗5 min/次，反復沖洗2、3 次，滴加封閉液，在室溫條件下孵育20 min。滴加一抗50 μl，4℃冰箱過夜，復溫后PBS沖洗2、3 次，滴加HRP 標記的二抗40 ～50 μl，室溫靜置1 h，隨后滴加SP，室溫孵育1 h，DAB 顯色5 ～10 min 后終止反應，經(jīng)蘇木精復染，常規(guī)脫水，透明、中性樹膠封片，鏡檢，IPP 軟件分析平均光密度（OD）值。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AGA 大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度

復制模型后48 h，3 組AGA 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3 組AGA 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度治療藥物干預前后差值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與模型組比較，秋水仙堿組、葛根素組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度均減輕，葛根素組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度又輕于秋水仙堿組（P＜0.05）。見表1。

2.2 AGA 大鼠關(guān)節(jié)腔沖洗液中IL-1β、TNF-α含量

復制模型后48h，模型組、秋水仙堿組、葛根素組大鼠IL-1β、TNF-α 組間比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。藥物干預2 周后，3 組大鼠IL-1β、TNF-α 差值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與模型組比較，秋水仙堿組和葛根素組IL-1β、TNF-α 含量降低，葛根素組IL-1β、TNF-α 低于秋水仙堿組（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織光鏡觀察結(jié)果

正常組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)清晰，滑膜細胞排列整齊，細胞間為膠原性間質(zhì)，無炎癥細胞浸潤，無毛細血管增生、充血、水腫（見圖1A）；與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織結(jié)構(gòu)清晰程度下降，伴明顯水腫，滑膜細胞排列紊亂且有大量炎癥細胞浸潤，正常膠原性間質(zhì)明顯減少，且伴毛細血管增生（見圖1B）；與模型組比較，秋水仙堿組及葛根素組滑膜炎癥反應均有不同程度減輕，其中葛根素組病變減輕程度較秋水仙堿組更明顯（見圖1C、D）。

表1 3 組AGA 大鼠治療藥物干預前后膝關(guān)節(jié)腫脹度比較 （n =15，mm，±s）

表1 3 組AGA 大鼠治療藥物干預前后膝關(guān)節(jié)腫脹度比較 （n =15，mm，±s）

注：①與模型組比較，P ＜0.05；②與秋水仙堿組比較，P ＜ 0.05。

組別 復制模型后48 h 末次灌胃后4 h 差值模型組 28.23±2.31 25.12±5.07 -3.10±4.49秋水仙堿組 27.45±1.74 22.99±1.67① -4.46±2.37①葛根素組 28.23±1.20 20.97±1.90①② -7.25±2.09①②F 值 0.930 6.040 6.241 P 值 0.404 0.005 0.004

表2 3 組AGA 大鼠關(guān)節(jié)腔沖洗液中IL-1β、TNF-α 含量比較 （n =15，ng/L，±s）

表2 3 組AGA 大鼠關(guān)節(jié)腔沖洗液中IL-1β、TNF-α 含量比較 （n =15，ng/L，±s）

注：①與模型組比較，P ＜0.05；②與秋水仙堿組比較，P ＜0.05。

組別IL-1β TNF-α復制模型后 48 h 藥物干預2 周后 差值 復制模型后 48 h 藥物干預2 周后 差值模型組 104.87±7.07 116.28±2.72 11.40±6.59 205.32±5.95 220.31±5.23 14.99±7.23秋水仙堿組 102.22±3.61 62.71±5.54① -39.50±7.26① 202.51±4.38 90.68±10.54① -111.83±11.75①葛根素組 102.61±2.88 54.83±4.10①② -47.78±5.92①② 201.91±3.67 73.30±7.36①② -128.61±7.82①②F 值 1.295 854.683 328.476 2.052 1 492.986 1 029.108 P 值 0.285 0.000 0.000 0.141 0.000 0.000

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理結(jié)果（HE 染色×400）

2.4 AGA 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、NF-κB表達量比較

復制模型后48h，模型組、秋水仙堿組、葛根素組大鼠TLR4、NF-κB 表達量比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。藥物干預2 周后，3 組間差值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿組和葛根素組TLR4、NF-κB 表達量降低，葛根素組TLR4、NF-κB 表達量又低于秋水仙堿組（P＜0.05）。見表3。

表3 3 組AGA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、NF-κB 表達量比較 （n =15，±s）

表3 3 組AGA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、NF-κB 表達量比較 （n =15，±s）

注：①與模型組比較，P ＜0.05；②與秋水仙堿組比較，P ＜0.05。

組別TLR4 NF-κB復制模型后 48 h 藥物干預2 周后 差值 復制模型后 48 h 藥物干預2 周后 差值模型組 0.33±0.16 0.35±0.02 0.02±0.02 0.35±0.02 0.31±0.03 -0.04±0.03秋水仙堿組 0.33±0.02 0.21±0.02① -0.11±0.03① 0.35±0.01 0.21±0.06① -0.13±0.05①葛根素組 0.33±0.02 0.17±0.01①② -0.16±0.02① 0.35±0.01 0.14±0.02①② -0.20±0.03①②F 值 0.367 366.507 220.680 0.110 68.214 68.843 P 值 0.695 0.000 0.000 0.896 0.000 0.000

3 討論

中醫(yī)對痛風早已有了認識，稱其痹癥、白虎歷節(jié)?！督饏T要略·中風歷節(jié)病脈并治》就為該病講述一系列臨床表現(xiàn)諸肢節(jié)疼痛，身體魁羸，腳腫如脫，頭眩短氣，溫溫欲吐。《外臺秘要·卷十三·白虎方》闡述到其疾晝靜而夜發(fā)，發(fā)即徹髓，酸疼乍歇，其病如白虎之嚙，故名曰白虎之病也?！吨T病源候論》亦對痹證進行陳述，同時點出風寒濕三氣侵襲入體進而轉(zhuǎn)變?yōu)槎虤?、自汗出、四肢疼痛、不得屈伸等乃痹證之主要病因[7]。

《神農(nóng)本草經(jīng)》中描述葛根，主消渴、身大熱、嘔吐、諸痹、起陰氣、解諸毒。其有用組成是葛根素，葛根素系異黃酮類化合物，其資源豐富，藥理作用廣泛，安全、有效，適應范圍廣[8]。葛根素可調(diào)節(jié)白細胞介素系統(tǒng)（ILs）中促炎因子與抗炎因子的含量；抑制促炎因子如TNF-α 對中性粒細胞的趨化作用，減少炎癥介質(zhì)的釋放；或阻止NF-κB 參與細胞的免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應[9-10]。

此外，葛根素對黃嘌呤氧化酶存在抑制效果，從而降低尿酸水平[11]。葛根素尚能促進組織向血液中釋放一氧化氮NO，降低炎癥組織中NO 含量[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠有效地通過促進近曲小管上皮細胞內(nèi)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G2基因的表達，促進腎臟對尿酸的分泌，具有治療AGA 的作用[13]?，F(xiàn)有文獻報道中，單純大劑量使用葛根素和與其他中藥配伍結(jié)合治療AGA，葛根素在一定程度上的確能起到緩解患者關(guān)節(jié)的腫脹疼痛的作用，且讓患者體內(nèi)尿酸濃度下降[14-15]。

TLR4/NF-κB 通路是現(xiàn)在研究AGA 發(fā)病機制的熱點。TLRs 為I 型跨膜受體，當其活化后通過Toll/IL-1 受體結(jié)構(gòu)域（TIR）與髓樣分化分子88（MyD88）結(jié)合，并激活I(lǐng)L-1 受體相關(guān)激酶（IRAK）[16-18]；隨后結(jié)合TNF 受體相關(guān)因子6（TRAF6）活化轉(zhuǎn)化生長因子β 活化激酶1（TAK1），進而激活NF-κB，NF-κB 是一種參與調(diào)控多種基因表達的核轉(zhuǎn)錄因子，其活化后可以控制轉(zhuǎn)錄IL-1β 前體，最后再在一些炎癥體的作用下，大量IL-1β、TNF-α 等細胞因子被釋放[19]。在AGA 的發(fā)病過程中，關(guān)節(jié)液尿酸濃度過飽和，沉積形成MSU，MSU 可作為損傷相關(guān)模式分子（DAMP），直接或通過破壞細胞產(chǎn)生組織蛋白酶等，觸發(fā)機體非特異性免疫反應，激活炎癥體，趨化中性粒細胞，產(chǎn)生瀑布效應，大量炎癥因子聚集在關(guān)節(jié)及其周圍組織處，誘發(fā)急性炎癥反應，其中TLR4 作為模式識別受體發(fā)揮關(guān)鍵作用[20-22]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，秋水仙堿組、葛根素組滑膜組織的炎癥程度均可見明顯減輕，ELISA 結(jié)果表明關(guān)節(jié)腔沖洗液中IL-1β、TNF-α 含量降低，免疫組織化學結(jié)果表明關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、NF-κB蛋白表達量下調(diào)。與秋水仙堿組比較，葛根素組大鼠治療后膝關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥改變明顯，關(guān)節(jié)腔沖洗液中IL-1β、TNF-α 含量、滑膜組織中TLR4、NF-κB 蛋白表達量均低于秋水仙堿組。

綜上所述，葛根素治療AGA 有效，其可能的作用機制為通過阻斷TLR4/NF-κB 通路，抑制IL-1β、TNF-α 的產(chǎn)生，達到抗炎、鎮(zhèn)痛、改善臨床癥狀的作用。本研究的應用價值和現(xiàn)實意義在于基于TLR4/NF-κB 通路探討葛根素治療AGA 的作用，同時對比葛根素與秋水仙堿治療AGA 的療效優(yōu)劣，進一步闡明葛根素治療AGA 的機制，為葛根素防治AGA 提供客觀的臨床前實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，為具有相似功能的其他藥物的作用機制探討提供思路與方法。