周 丹 蘇泳霖 鐘如卓 郭志誠 鄔 婧 鄭 哲 王慶恒

光裸星蟲基因的全長克隆及其在全組織和卵母細胞中的表達分析*

周 丹 蘇泳霖 鐘如卓 郭志誠 鄔 婧 鄭 哲①王慶恒

(廣東海洋大學水產學院 湛江 524025)

熱休克蛋白Hsp90在蛋白質正確折疊、胞內物質運輸、細胞增殖調控、配子發(fā)生等過程中發(fā)揮重要的作用。本研究利用RACE技術克隆獲得了光裸星蟲熱休克蛋白() cDNA全長序列。全長3110 bp，其中，3′UTR為582 bp，5′UTR為72 bp，開放閱讀框為2456 bp，編碼818個氨基酸。序列分析結果顯示，SnHsp90蛋白具有1個信號肽，存在B型Hsp90的3個標簽序列FLREL、IGQFGVGFYS、LPLNVSRE以及保守模塊GxxGxG，表明SnHsp90屬于Hsp90B亞族。與其他物種的Hsp90氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，SnHsp90與鴨嘴海豆芽() Hsp90相似度最高，為77.72%。三維結構建模發(fā)現(xiàn)，Hsp90在不同物種之間的空間構象具有較高保守性。系統(tǒng)進化樹分析顯示，SnHsp90先與小頭蟲()、水蛭()等環(huán)節(jié)動物的Hsp90聚為一支，再與鴨嘴海豆芽等其他無脊椎動物聚為一大支，而脊椎動物聚為另一大支，表明SnHsp90與小頭蟲Hsp90親緣關系最近。RT-PCR結果顯示，在光裸星蟲的體壁、收吻肌、腎管等組織中均有表達。也可在卵母細胞不同發(fā)育時期表達，其中，在卵黃旺盛合成前期(Egg2)和外排卵母細胞期(Egg6)顯著高表達(<0.05)，暗示，可能參與到光裸星蟲卵母細胞的蛋白質正確折疊、卵黃合成與環(huán)境抗逆等過程。研究結果為進一步探究光裸星蟲卵母細胞發(fā)育的分子機制積累了基礎資料。

光裸星蟲；熱休克蛋白Hsp90；基因克??；表達分析；卵母細胞

熱休克蛋白(Heat shock proteins, Hsps)是目前研究最為廣泛的應激蛋白之一，可在各種環(huán)境脅迫下誘導大量表達；在正常環(huán)境條件下，細胞內也存在豐富的Hsps；根據(jù)分子量大小，Hsps可以分為Hsp110s、Hsp90s、Hsp70s、Hsp60s和小分子量Hsps等多個家族(Lindquist, 1988)。其中，Hsp90是一類進化上高度保守的重要細胞內伴侶蛋白，在正常情況約占細胞溶質蛋白總量的1%~2%(Lai, 1984)，具有輔助蛋白質正確折疊、胞內物質運輸、細胞增殖調控等重要功能(McClellan, 2007)。此外，Hsp90在配子發(fā)生中也具有重要功能。例如，非洲爪蟾()卵母細胞的Hsp90可通過磷酸化穩(wěn)定c-Mos蛋白，并依賴絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)途徑影響成熟促進因子(Maturation-promoting Factor, MPF)的合成(朱建安, 2007)。在刀額新對蝦()卵母細胞中，Hsp90與雌激素受體(Estrogen receptor, ER)共同作用，激活或增強卵黃蛋白原(Vitellogenin, Vg)等靶基因的轉錄(Wu, 2008)。

光裸星蟲()又名裸體方格星蟲，俗稱沙蟲，主要棲息于暖水性海濱潮間帶，在我國華南沿海資源量較為豐富(李鳳魯?shù)? 1990; Li, 2017)，其味道鮮美，含有大量谷氨酸、天冬氨酸等呈味氨基酸，具有很高的市場價值(羅少杰等, 2016)。近年來，光裸星蟲逐漸成為廣東湛江、廣西北海等北部灣沿岸地區(qū)養(yǎng)殖新熱點，但苗種短缺制約了產業(yè)發(fā)展。目前，關于光裸星蟲繁殖生物學研究主要在形態(tài)學方面，尚未開展分子機制研究。如，王慶恒等(2017)報道了光裸星蟲卵子發(fā)生的超微結構，建立了卵母細胞粒徑、超微結構和發(fā)育階段的對應關系；張家煒等(2018a)觀察了光裸星蟲胚胎和幼體發(fā)育的超微結構。光裸星蟲體腔液中有大量生殖細胞游離發(fā)育，但直接解剖獲取的卵母細胞不具備受精能力。解析卵母細胞成熟機制，有助于建立卵母細胞體外促熟技術，從而提高光裸星蟲苗種產量，促進產業(yè)發(fā)展。作者所在課題組已構建了不同發(fā)育階段卵子的轉錄組文庫，分析表明，在卵母細胞中表達量較高，可能在卵母細胞發(fā)育過程中起著重要作用(未發(fā)表)。

本研究通過RACE技術獲得的cDNA全長，并對其序列結構、不同組織及不同卵子發(fā)育時期的表達模式進行分析，以探究在光裸星蟲卵母細胞發(fā)育中的作用，為認識光裸星蟲卵母細胞發(fā)育的分子機制積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用光裸星蟲于2018年6月采集自廣東省湛江市草潭鎮(zhèn)潮間帶，取鉆沙有力、體壁無傷的雌性蟲體用于實驗，體重為(12.92±1.68) g。

滅菌海水清洗蟲體表面砂礫后，用2 ml注射器抽取少量體腔液，鏡檢分辨雌雄。取30尾雌蟲，每尾抽取2 ml體腔液，分別置于5 ml離心管中冰浴靜置5 min，卵母細胞沉降到管底，上層懸浮液中則含有各類血細胞、卵原細胞等。棄懸浮液，在沉淀中加入RNA Later吹打混勻，冰浴靜置5 min，棄上清液，再次加入RNA Later吹打混勻。將獲得的卵母細胞懸浮液全部置于50 ml燒杯中混合，逐次使用100、150和300目的細胞篩進行分級分離，結合王慶恒等(2017)工作，獲得的各級卵母細胞的直徑及發(fā)育時期分別為：Egg1 (<48 μm，卵黃形成初期)、Egg2 (48~108 μm，卵黃旺盛合成前期)、Egg3 (108~150 μm，卵黃旺盛合成后期)和Egg4 (>150 μm，成熟期)(圖1)。

解剖雌蟲，如果腎管充盈，即用過濾海水清洗腎管表面，將腎管游離端輕輕放入2 ml離心管中，用解剖針刺破腎管收集卵母細胞，加入RNA Later吹打混勻。本研究共獲得30尾雌蟲腎管中的卵母細胞，混合后作為樣品Egg5 (腎管發(fā)育時期)。另取30尾雌蟲，陰干刺激后放入過濾海水中促使排卵，用100目篩絹網撈取水體中的外排卵母細胞，加入RNA Later吹打混勻作為樣品Egg6 (外排卵母細胞)。

解剖取9尾雌蟲取體壁(M)、腸道(I)、收吻肌(Rm)、腎管(Ne)組織以及體腔液細胞(Co)，液氮速凍，并轉移至–80℃冰箱保存，用于RNA提取。

1.2 SnHsp90基因全長cDNA克隆

總RNA提取及第一鏈cDNA合成參照賴卓欣等(2019)的方法進行。根據(jù)本課題組前期光裸星蟲轉錄組數(shù)據(jù)中的部分序列，利用Primer premier 6.0軟件設計引物(表1)。

采用巢式PCR擴增3′UTR和5′UTR，PCR產物利用1%瓊脂糖電泳檢測，產物與載體pMD18-T連接，連接產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞，并在固體氨芐選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h。挑取陽性單克隆菌落進行PCR檢測，合格后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 SnHsp90序列分析

利用DNAman 8對測序結果進行拼接，獲得全長。采用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder)預測的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)以及蛋白質氨基酸序列。利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)進行理化性質及二級結構預測。ProtComp 9.0(http://linux1. softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&group= programs&subgroup=proloc)進行蛋白亞細胞定位。NCBI Blast在線分析工具(https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)進行序列同源性、一致性性分析。Phyer2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id= index)預測蛋白三級結構。smart進行保守結構域預測(http://smart.embl-heidelberg.de/)。MEME (http://meme- suite.org/index.html)進行motif挖掘。使用Mega X構建生物系統(tǒng)進化樹。

A：卵黃形成初期(Egg1)；B：卵黃旺盛合成前期(Egg2)；C：卵黃旺盛合成后期(Egg3)；D：成熟期(Egg4)；E：腎管發(fā)育時期 (Egg5)；F：外排卵母細胞(Egg6)。圖8同

A: Oocyte in beginning of yolk synthesis; B: Oocyte in early stage of vigorous yolk synthesis; C: Oocyte in late stage of vigorous yolk synthesis; D: Oocyte in mature stage; E: Oocytes in the nephridioduct; F: Excretive oocyte. The same as Fig.8

表1基因克隆及熒光定量的引物序列

Tab.1 Primer sequence used in the cloning and real-time PCR of SnHsp90 gene

1.4 SnHsp90差異表達分析

分別以(張家煒等, 2018b)和(篩選過程未發(fā)表)基因作為內參基因，檢測在成體不同組織及在不同發(fā)育時期卵母細胞的表達水平。反應體系：上下游引物各0.4 μl，SYBR?Select Master Mix 5 μl，cDNA模板0.4 μl，滅菌水3.8 μl。反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，共40個循環(huán)。采用2–ΔΔCt法計算的相對表達量。通過IBM SPSS Statistics 22進行顯著性分析(置信水平取95%)。

2 結果與分析

2.1 SnHsp90基因克隆及氨基酸序列

本研究利用RACE技術克隆獲得光裸星蟲基因cDNA序列，全長3110 bp，其中，5′ UTR為72 bp；3′ UTR為582 bp，開放式閱讀框(ORF)長度為2456 bp，編碼818個氨基酸。SnHsp90同時具有B型Hsp90(Hsp90B)的3個特征序列(FLREL、IGQFGVGFYS、LPLNVSRE)以及保守模塊“GxxGxG” (圖2)。

圖2 SnHsp90 cDNA序列全長及推導的氨基酸序列

黃色背景為Hsp90B蛋白家族的特征序列；GxxGxG以紅色字體突出；5′和3′ UTR用小寫字母表示；編碼區(qū)以及推導的氨基酸序列用大寫字母表示；信號肽以灰色陰影突出；HATPase_c結構域以黑框框出；Hsp90結構域以藍色字體突出

The yellow background is the characteristic sequence of the Hsp90B protein family; the GxxGxG motif is highlighted in red; 5' UTR and 3' UTR are indicated with small letters; open reading fragment and the deduced amino acid sequences are indicated with capital letters; the signal peptide is highlighted by a gray shadow; the HATPase_c domain is outlined in black box; the Hsp90 domain is highlighted in blue

2.2 SnHsp90蛋白質理化分析

利用ProtParam預測得到SnHsp90的理論分子量為93.839 kDa，等電點為4.75，負電荷殘基178個，正電荷殘基114個。結果顯示，其脂溶指數(shù)(Aliphatic index)為77.98，總平均親水性(Grand average of hydropathy, GRAVY)為–0.752，屬于親水性蛋白。使用SOPMA軟件對SnHsp90二級結構進行預測，發(fā)現(xiàn)a螺旋、b轉角和延伸鏈分別占整體的55.87%、4.28%和12.59%。細胞亞定位預測結果顯示，SnHsp90定位于內質網上。結構域分析顯示，不同物種的Hsp90都含有信號肽、組氨酸激酶結構域(HATPase-c Domain)和熱休克蛋白結構域(Hsp90 Domain)(圖3)，可見Hsp90蛋白在結構域上具有高度保守性。

2.3 Hsp90蛋白序列分析

對來源于鴨嘴海豆芽(, XP_ 023932276.1)、小頭蟲(, ELU00023.1)、福壽螺(, XP_025107756.1)、太平洋牡蠣(, BAF63637.1)、水蛭(, XP_009019107.1)、貓頭鷹帽貝(, XP_009065664.1)、蝦夷扇貝(, OWF41993.1)、白氏文昌魚(, XP_019627224.1)、棘冠海星(, XP_022100344.1)、斑馬擬麗魚(, XP_004567801.1)、尼羅羅非魚(, XP_003443932.1)、雜色鳉(, XP_015232211.1)、隆頭蛛(, KFM57735.1)、銀大馬哈魚(, XP_020311813.1)、大彈涂魚(, XP_020790709.1)的Hsp90蛋白與光裸星蟲Hsp90序列進行motif分析，結果表明，各物種Hsp90蛋白序列保守性較高(圖4)。其中，光裸星蟲Hsp90與鴨嘴海豆芽的相似性最高，為77.72%；與大彈涂魚的相似性最低，為69.18%。對不同物種的Hsp90蛋白序列進行Motif分析，發(fā)現(xiàn)這些物種均具有Motif (1~10)，且相對位置一致，進一步表明Hsp90蛋白在序列上的保守性。

紅色部分為信號肽；綠色三角HATPase_c結構域；黑色矩形為Hsp90結構域；各物種基因序列登錄號：蝦夷扇貝OWF41993.1; 貓頭鷹帽貝XP_009065664.1; 鴨嘴海豆芽XP_023932276.1; 太平洋牡蠣BAF63637.1; 小頭蟲ELU00023.1; 福壽螺XP_025107756.1

Red section is signal peptide; green triangle is HATPase_c domain; black rectangle is Hsp90 domain; TheGenBank accession numbers of each species are following:, OWF41993.1;, XP_009065664.1;, XP_023932276.1;, BAF63637.1;, ELU00023.1;, XP_025107756.1

圖4 Hsp90氨基酸序列Motif分析

對來自小頭蟲、鴨嘴海豆芽、水蛭的Hsp90和SnHsp90進行三級結構預測，結果發(fā)現(xiàn)，光裸星蟲與鴨嘴海豆芽、小頭蟲、水蛭Hsp90在三級結果上相似性很高(圖5)，說明Hsp90蛋白的三級結構非常保守。

2.4 SnHsp90系統(tǒng)發(fā)育分析

利用最大似然法(Maximum likelihood)，選擇光裸星蟲、太平洋牡蠣、福壽螺、貓頭鷹帽貝、蝦夷扇貝、鴨嘴海豆芽、小頭蟲、水蛭、白氏文昌魚、雜色鳉、尼羅羅非魚、斑馬擬麗魚、大彈涂魚以及銀大馬哈魚的Hsp90蛋白序列構建系統(tǒng)進化發(fā)育樹。結果顯示，Hsp90系統(tǒng)發(fā)育樹可分為無脊椎動物和脊椎動物兩大支，在無脊椎動物中，光裸星蟲Hsp90與水蛭、小頭蟲等環(huán)節(jié)動物聚為一支，再與鴨嘴海豆芽、太平洋牡蠣、蝦夷扇貝等軟體動物聚為一支(圖6)。系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結果與傳統(tǒng)分類學結果一致。

圖5 光裸星蟲(A)、鴨嘴海豆芽(B)、小頭蟲(C)和水蛭(D)Hsp90蛋白分子結構

圖6 Hsp90蛋白質聚類分析

2.5 SnHsp90表達模式分析

利用qRT-PCR對進行不同組織的表達模式分析，結果顯示，在光裸星蟲的各個組織中均有表達，且收吻肌中表達量最高，差異顯著(<0.05) (圖7)。

M：體壁；I：腸；Rm：收吻??；Ne：腎管；Co：體腔液細胞。不同字母代表差異性顯著(<0.05), 下同

M: Body wall; I: Intestine; Rm: Rhynchonellida muscle; Ne: Nephridioduct; Co: Coelomic cell. Different letters mean significant difference (<0.05). The same as below

如圖8所示，在不同發(fā)育時期卵母細胞中均有表達。其中，在Egg6的表達量顯著高于其他時期(<0.05)，Egg2表達量顯著高于Egg1和Egg3~5 (<0.05)。

圖8 SnHsp90在不同時期卵母細胞中的相對表達量

3 討論

生殖細胞發(fā)生是水產動物繁殖生物學研究的重要內容。近年來，通過構建不同發(fā)育時期性腺的轉錄組文庫，已發(fā)掘了大量與水產動物繁殖相關的關鍵基因。例如，袁靜(2013)比較分析了5~180日齡尼羅羅非魚()性腺轉錄組，發(fā)現(xiàn)雌雄性腺特異表達的基因分別為69個和259個。林睿涓(2017)利用七彩神仙魚()性腺轉錄組文庫，篩選出12個與性別決定、性腺發(fā)育和性激素調控相關的重要功能基因。本課題組前期構建了光裸星蟲卵母細胞的轉錄組文庫，分析發(fā)現(xiàn)Hsp90在各時期卵母細胞均具有較高的表達水平(未發(fā)表)，暗示著其在卵母細胞或胚胎發(fā)育中承擔著重要作用。本研究通過分析的序列特征及表達模式，探索其在卵母細胞發(fā)育中可能具有的功能。

Hsp90家族可分為Hsp90A、Hsp90B、TNF受體相關因子(TNF receptor associated factors, TRAP)、Hsp90C、高溫蛋白G (High-temperature protein G, HTPG) 5個亞家族，其中，Hsp90B定位于真核生物內質網中，含有信號肽結構，序列上同時存在“FLREL”、“IGQFGVGFYS”及“LPLNVSRE” 3個標簽序列(Chen, 2006)。本研究利用RACE方法克隆獲得cDNA全長序列，顯示SnHsp90具有信號肽結構，且存在Hsp90B亞家族的上述3個特征序列標簽，可見本研究克隆所得的屬于Hsp90B亞家族。一般來說，Hsp90B亞家族的C末端具有內質網定位序列“KDEL”。然而，有研究指出，該序列在Hsp90B中并不保守，其K位點和D位點會發(fā)生一定的變化(Gupta, 1995; Chen, 2006)。這與本研究發(fā)現(xiàn)的SnHsp90氨基酸序列C末端序列為“HTEL”的結果一致。

對軟體動物、棘皮動物、脊椎動物等16個物種進行motif搜索，發(fā)現(xiàn)不同物種間搜索出來的motif類型、數(shù)目以及排列順序上均一致；光裸星蟲、鴨嘴海豆芽、小頭蟲和水蛭同源Hsp90在三維結構上高度相似。以上結果均說明了Hsp90在二級和三級序列上均具有較高的保守性。

Hsp90B也稱為葡萄糖調節(jié)的蛋白(Glucose regulated protein 94 kDa, Grp94) (Gupta, 1995; Chen, 2006)，作為分子伴侶時，有助于蛋白質的正確折疊以及防止錯誤折疊蛋白的積累(Young, 2001; Mamipour, 2017; Krüger, 2019)；參與免疫球蛋白、Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)和某些整聯(lián)蛋白(Integrin)的折疊、組裝和轉運等過程(Melnick, 1992; Yang, 2007)。本研究中，在收吻肌、體壁、腸等組織中均有表達，提示該基因廣泛參與了各組織的生理活動。在收吻肌的參與下，光裸星蟲的吻可快速伸縮進行攝食和鉆穴。在頻繁的強力伸縮過程中，收吻肌的細胞可能發(fā)生損傷，在收吻肌中的表達量顯著高于其他組織，推測與細胞的損傷修復有關。

卵母細胞發(fā)育過程中，核糖體、內質網、高爾基體等細胞器大量增殖，積累大量酶、蛋白質、mRNA等物質。本研究顯示，在光裸星蟲各時期卵母細胞中均有較高表達，有利于快速合成蛋白的正確折疊，與卵母細胞旺盛的轉錄和翻譯活動相一致。有研究顯示，Hsp90可與Greatwall激酶結合，影響生殖細胞的細胞周期進程(Yamamoto, 2014)。在刀額新對蝦中，Hsp90與雌激素受體結合，介導雌激素信號轉導過程，開啟靶基因如卵黃蛋白原的轉錄(Wu, 2008)。光裸星蟲卵母細胞Egg2處于卵黃旺盛合成前期，卵黃快速積累(王慶恒等, 2017)，本研究顯示，光裸星蟲在該時期顯著高表達(<0.05)，暗示的表達可能與卵黃合成之間存在相關性，與刀額新對蝦的研究結果相似。

Hsp90在水生生物應激和抗逆過程中具有重要作用。例如，在萊茵衣藻()耐鹽群體的細胞中表達上調，可能在鹽度耐受方面起作用(Sithtisarn, 2017)；三疣梭子蟹()具有2個基因，對脅迫條件可產生不同的響應，例如，熱處理導致的表達量顯著上調，而則顯著下調(Zhang, 2009)；氨氮脅迫下，中國對蝦()鰓、肝胰腺、肌肉和血細胞的表達量均在短時間內明顯上調，有利于防止分子氨對組織細胞的損傷(王蕓等, 2013)。本研究中，Egg6是經腎管排放到水體中的卵母細胞，需要應對體內外滲透壓、pH、離子濃度等環(huán)境因子的重大改變，在Egg6時期表達量最高，暗示的高表達可能與卵母細胞應對環(huán)境變化密切相關。

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Zhu JA. The effects of injecting c-mos siRNA on maturation, fertilization and development of porcine oocyte. Institute of Biotechnology Ilan University, 2007 [朱建安. 注射c-mos siRNA對豬卵母細胞成熟, 受精及發(fā)育的影響. 宜蘭大學生物技術研究所, 2007]

Molecular Cloning and Expression Analysis ofof Peanut Worm

ZHOU Dan, SU Yonglin, ZHONG Ruzhuo, GUO Zhicheng, WU Jing, ZHENG Zhe①, WANG Qingheng

(Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025)

Heat shock protein 90 (Hsp90) plays important roles in correct protein folding, intracellular material transport, cell proliferation regulation, and gametogenesis. In this study, the full-length cDNA of() ofwas cloned using RACE technology. The results showed thatis 3110 bp in length, including a 3′ UTR of 582 bp and a 5′ UTR of 72 bp. The open reading frame is 2456 bp in length and it encodes 818 amino acids. Sequence analysis showed that SnHsp90 has a signal peptide, with three tag sequences FLREL, IGQFGVGFYS, and LPLNVSRE and a conserved module, GxGxG, of type B Hsp90, thereby indicating that SnHsp90 belongs to the Hsp90B subgroup. Compared with other species, SnHsp90 showed the highest similarity (77.72%) with the Hsp90 of duck-billed bean sprouts. Three-dimensional structural modeling showed that the spatial conformation of Hsp90 among different species is highly conserved. Phylogenetic tree analysis showed that SnHsp90 was clustered into one branch of Hsp90 of annelids such asand. The Hsp90 of all invertebrates was clustered into one branch, whereas that of the vertebrates was clustered into another branch, thus suggesting that SnHsp90 is closely related to the Hsp90 of. RT-PCR results showed thatwas expressed in different tissues of, such as those of the body wall, muscles, and kidney tubes.can also be expressed at different developmental stages of oocytes, and it is significantly expressed in Egg2 (oocyte in early stage of vigorous yolk synthesis) and Egg6 (excretive oocyte) (<0.05). This result suggests the involvement of SnHsp90 in correct protein folding, yolk synthesis, and environmental stress resistance of. The above results provide a basis for further exploration of the developmental mechanism ofoocytes.

; Oocyte;; Gene cloning; Expression analysis

ZHENG Zhe, E-mail: haidazhengzhe@163.com

Q959.19

A

2095-9869(2020)05-0018-10

10.19663/j.issn2095-9869.20190416001

http://www.yykxjz.cn/

周丹, 蘇泳霖, 鐘如卓, 郭志誠, 鄔婧, 鄭哲, 王慶恒. 光裸星蟲基因的全長克隆及其在全組織和卵母細胞中的表達分析. 漁業(yè)科學進展, 2020, 41(5): 150–159

Zhou D, Su YL, Zhong RZ, Guo ZC, Wu J, Zheng Z, Wang QH. Molecular cloning and expression analysis ofof peanut worm. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 150–159

* 廣東省科技計劃(2016A020209010; 2017A030303075)和廣東海洋大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(CXXL2018049)共同資助[This work was supported by Science and Technology Plan of Guangdong Province (2016A020209010; 2017A030303075), and Guangdong Ocean University Undergraduates Innovation and Entrepreneurship Training Program (CXXL2018049)]. 周 丹，E-mail: 1334285134@qq.com

鄭 哲，E-mail: haidazhengzhe@163.com

2019-04-16,

2019-06-04

(編輯 馮小花)