周麗青 趙 丹 吳 宙 吳 磊 楊金龍

主要經(jīng)濟(jì)雙殼貝類性別分化的分子機(jī)制概述*

周麗青1,2趙 丹2吳 宙3吳 磊4楊金龍2①

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306；3. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 舟山 316000；4. 江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院 連云港 222005)

本文簡(jiǎn)要概述了主要經(jīng)濟(jì)雙殼貝類性別分化分子機(jī)制研究進(jìn)展，介紹國(guó)內(nèi)外研究性別分化和性別決定的代表性雙殼貝類物種及主要研究成果，主要涉及牡蠣科(Ostreidae)、扇貝科(Pectinidae)、珍珠貝科(Pteriidae)等常見的經(jīng)濟(jì)物種，分子層面涵蓋了核酸、蛋白質(zhì)和激素等，通過綜述這些物種相關(guān)研究的現(xiàn)狀，展望雙殼貝類性別分化研究的發(fā)展趨勢(shì)，以期加深對(duì)雙殼貝類性別分化和性腺發(fā)育的認(rèn)識(shí)，為解析蝦夷扇貝()及其他雙殼貝類性別分化分子機(jī)制研究理清思路。

雙殼貝類；性別分化；基因；分子；核酸；激素；蛋白質(zhì)

貝類繁殖機(jī)制與性別分化一直是生物學(xué)研究目標(biāo)之一，因種類繁多、方式各異，目前對(duì)軟體動(dòng)物繁殖的分子機(jī)制仍知之甚少(Song, 2017; Zhang, 2014)。海洋軟體動(dòng)物，尤其雙殼貝類存在雌雄同體現(xiàn)象，但關(guān)于雌雄同體形成及性別分化的數(shù)據(jù)，包括性別分化和性別決定過程的分子數(shù)據(jù)，還不多見(Teaniniuraitemoana, 2014)。隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的快速發(fā)展，研究者們圍繞雙殼貝類性腺發(fā)育、繁殖特性及性別分化和性別決定開展的研究越來越深入。結(jié)合作者目前在蝦夷扇貝()性腺發(fā)育和性別分化開展的研究工作，本文簡(jiǎn)要介紹牡蠣科(Ostreidae)、扇貝科(Pectinidae)、珍珠貝科(Pteriidae)等常見的經(jīng)濟(jì)物種性別分化、性別決定和性腺發(fā)育的研究現(xiàn)狀，重點(diǎn)探討雙殼貝類性別分化研究的發(fā)展趨勢(shì)，以期加深對(duì)雙殼貝類性別分化和性腺發(fā)育的認(rèn)識(shí)。一般來說，有機(jī)體的性別由 2個(gè)因素決定：遺傳因素或環(huán)境因素。、、Gata型鋅指蛋白I (zglp1)、蛋白o(hù)vo(ovo)和基因參與了貝類的遺傳性別決定與分化。激素用量、溫度、污染、養(yǎng)殖條件等因素也影響著貝類的性別決定，有時(shí)會(huì)引起性別逆轉(zhuǎn)。雙殼貝類性別分化或變化的分子機(jī)制研究綜述如下。

1 牡蠣科性腺發(fā)育與性別分化分子機(jī)制

牡蠣()俗稱海蠣子，是世界第一大養(yǎng)殖貝類。除了可食用外，牡蠣也是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，對(duì)內(nèi)灣和近海水域藻華的調(diào)控有重要作用。牡蠣種類也很多，有些牡蠣有性生殖系統(tǒng)比較神奇，由雌雄異體、性別變化和偶爾的雌雄同體組成，盡管很多研究人員已經(jīng)對(duì)牡蠣進(jìn)行了大量研究，但對(duì)性別決定和分化的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然存在很多盲區(qū)，關(guān)于繁殖調(diào)控的分子通路研究也很少。有關(guān)牡蠣性腺發(fā)育和性別分化相關(guān)研究見表1。

表1 牡蠣科性腺發(fā)育及性別分化過程中的分子生物學(xué)研究

續(xù)表1

續(xù)表1

相關(guān)文獻(xiàn)以品種和報(bào)道時(shí)間為序排布，從表1可以看出，長(zhǎng)牡蠣()因?yàn)榉植挤秶鷱V泛，對(duì)其性腺發(fā)育和性別分化的研究開展得最多。從20世紀(jì)90年代起，至2008年前后，科研人員嘗試檢測(cè)性激素含量和分析促性腺激素釋放激素受體基因表達(dá)情況，來闡述性腺發(fā)育或性別分化的過程；2012~2013年期間，也有關(guān)于長(zhǎng)牡蠣GnRH樣肽前體基因的表達(dá)位點(diǎn)和生物活性的報(bào)道，及性腺轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β ()在牡蠣生殖過程中的作用，又如Ni等(2013)用酶聯(lián)免疫吸附法研究福建牡蠣雌二醇-17β(E2)和睪酮(Testosterone, T)含量的變化，獲得一個(gè)編碼牡蠣雌激素受體(ER)，認(rèn)為ER可能在牡蠣性腺發(fā)育中起重要作用；Naimi等(2009)分別觀察了長(zhǎng)牡蠣、和基因()在雌雄配子發(fā)生周期中的表達(dá)特征；同年，F(xiàn)abioux等(2009)采用RNA干擾技術(shù)敲除性腺細(xì)胞中的基因，從而證明對(duì)牡蠣生殖細(xì)胞發(fā)育具有重要意義，開啟了一系列性別分化相關(guān)基因鑒定及功能的研究。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組、基因組、蛋白質(zhì)組和代謝組等組學(xué)分析技術(shù)和精密檢測(cè)設(shè)備的研發(fā)，使進(jìn)一步揭示牡蠣性腺發(fā)育和性別分化機(jī)制終將成為可能，并明確了牡蠣性別分化過程是個(gè)多基因參與、環(huán)境和遺傳因素相互作用的遺傳通路，這些研究也為扇貝、珠母貝等其他貝類的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。從最早的激素含量檢測(cè)分析，到性別分化相關(guān)基因的序列及功能分析，再到組學(xué)分析，目標(biāo)只有一個(gè)，就是探討牡蠣性別分化機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)牡蠣的性別和繁殖調(diào)控，有利于牡蠣的遺傳改良。

2 扇貝科性腺發(fā)育與性別分化分子機(jī)制

櫛孔扇貝()是中國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，然而，頻繁的大規(guī)模病害已嚴(yán)重影響到產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，遺傳連鎖圖譜對(duì)櫛孔扇貝的遺傳改良和選擇性育種有借鑒作用。因此，研究人員構(gòu)建了櫛孔扇貝性別相關(guān)AFLP遺傳連鎖圖譜，其中，有1個(gè)性別標(biāo)記在雌性第19個(gè)連鎖組上，重組率為0，LOD為27.3，而對(duì)應(yīng)的雄性中沒有這個(gè)標(biāo)記，雌性中這個(gè)特殊的標(biāo)記(P2f230)一旦得到證實(shí)，將來可以分離、克隆、測(cè)序和轉(zhuǎn)化為Sequence characterized amplified region (SCAR)，將其定位于染色體上作為性別決定的基因(Li, 2005)。在雙殼貝類雌雄間性狀無明顯差異、尚未見有性染色體的報(bào)道及性別決定因子或性別決定機(jī)制不清楚的情況下，構(gòu)建分子標(biāo)記高密度遺傳連鎖圖譜將為品種改良奠定基礎(chǔ)，多種雙殼貝類遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中均發(fā)現(xiàn)，雄性遺傳連鎖圖譜中基因重組率要低于雌性，說明減數(shù)分裂時(shí)，雌性基因連鎖互換的頻率要高于雄性，櫛孔扇貝(Wang, 2005)和蝦夷扇貝(Chen, 2012)也是如此，與(Liu, 2017)、長(zhǎng)牡蠣(Li, 2004)和貽貝() (Lallias, 2007)相似。

蝦夷扇貝是中國(guó)和日本重要的養(yǎng)殖貝類。除具有商業(yè)價(jià)值，還因其養(yǎng)殖群體中一定比例的雌雄同體在性別決定和分化機(jī)制研究中的價(jià)值而備受關(guān)注。為確定蝦夷扇貝分子性別分化的開始，篩選早期性別鑒定的分子標(biāo)記，對(duì)5~13月齡貝的性腺進(jìn)行組織學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)10月齡在性腺形態(tài)上發(fā)生性別分化，8個(gè)性別決定或分化候選基因的性腺表達(dá)譜顯示，只有2個(gè)基因表現(xiàn)出性別二型表達(dá)，雌性性腺中含有豐富的FOXL2，雄性性腺中含有大量DMRT1L，研究將有助于更好地理解雙殼類性別分化的分子機(jī)制(Li, 2018)。利用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)成熟期雄性和雌性性腺轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行配對(duì)和末端測(cè)序，通過BlastX與Swiss-Prot和NR開放數(shù)據(jù)庫(kù)相比，9354個(gè)unigenes與已知的獨(dú)特蛋白質(zhì)顯著匹配。根據(jù)注釋信息，至少有30個(gè)與性別決定和分化相關(guān)的基因，如、、和被篩選和鑒定(Yang, 2016)。也有研究對(duì)蝦夷扇貝3個(gè)雌性和3個(gè)雄性性腺的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和分析，研究了先前在脊椎動(dòng)物中報(bào)道的關(guān)鍵性別決定基因，并推測(cè)存在于雙殼類貝類中，即、、和等。這些基因均具有保守的功能結(jié)構(gòu)域，并在性腺中被檢測(cè)到，其中，偏向雌性，和偏向雄性，表明這3個(gè)基因可能是扇貝性別決定或分化的關(guān)鍵候選基因(Li, 2016)。為進(jìn)一步研究雙殼類性別決定和分化的分子機(jī)制提供了資料。

許多軟體動(dòng)物常發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，性激素可能會(huì)參與這一過程。在成體蝦夷扇貝中，促性腺激素釋放激素和17β-雌二醇(E2)參與了雄貝的性成熟過程。成熟期，和分別在扇貝的雌性和雄性性腺中表達(dá)。性逆轉(zhuǎn)期，扇貝性腺器官培養(yǎng)時(shí)，性激素處理降低了性逆轉(zhuǎn)期大部分扇貝性腺的表達(dá)。然而，在培養(yǎng)的成熟性腺中，無論是E2還是睪酮(T)作用，和的表達(dá)都沒有明顯的變化，提示性激素處理可能影響性逆轉(zhuǎn)期的性腺發(fā)育(Otani, 2017)。促性腺激素釋放激素(GnRH)是控制脊椎動(dòng)物生殖周期的核心，由于GnRH同源激素也存在于無脊椎動(dòng)物中，因此，可能在雙殼貝類中的也具有共同的祖先GnRH樣肽。比較蝦夷扇貝GnRH樣肽前體的cDNA轉(zhuǎn)錄本與其他無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的未加工的和成熟的氨基酸序列，確定了它的表達(dá)位點(diǎn)和生物活性。用抗章魚GnRH樣肽免疫細(xì)胞化學(xué)證明，扇貝神經(jīng)組織中存在GnRH樣肽，扇貝GnRH樣肽對(duì)體外培養(yǎng)的扇貝雄性性腺精原細(xì)胞分裂有促進(jìn)作用，但對(duì)體外培養(yǎng)的鵪鶉垂體細(xì)胞釋放LH無促進(jìn)作用(Treen, 2012)。

3 珍珠貝科性腺發(fā)育與性別分化分子機(jī)制

珍珠貝養(yǎng)殖是近年來備受關(guān)注的一種集約化珍珠生產(chǎn)方式，珠母貝是生產(chǎn)珍珠的主要生物。這吸引了專家對(duì)珠母貝的生長(zhǎng)和繁殖進(jìn)行研究，研究的目標(biāo)是通過利用控制繁殖的育種計(jì)劃生產(chǎn)有活力的珠母貝種群。在許多動(dòng)物中，基因同源序列常被用作特定生殖細(xì)胞檢測(cè)的分子標(biāo)記。珠母貝()成熟親貝和稚貝基因同源序列(povlg1)原位雜交結(jié)果表明，1月齡幼貝中，內(nèi)臟團(tuán)兩側(cè)對(duì)稱分布的一團(tuán)生殖細(xì)胞最初由多個(gè)細(xì)胞組成。2月齡幼貝，這些細(xì)胞遷移到內(nèi)臟團(tuán)的腹側(cè)邊緣。4月齡幼貝，這些細(xì)胞團(tuán)沿內(nèi)臟團(tuán)的外圍遷移，遷移過程中細(xì)胞數(shù)量和大小不斷增加。這種對(duì)未成熟生殖細(xì)胞分布和遷移的觀察，將為控制性腺發(fā)育和珍珠質(zhì)量提供有用的信息(Sano, 2015)。馬氏珠母貝()是我國(guó)人工培育海水珍珠的最主要珠母貝，在其養(yǎng)殖群體中，有少數(shù)雌雄同體個(gè)體，并在一定條件下出現(xiàn)性轉(zhuǎn)化。因此，克隆鑒定馬氏珠母貝的基因既可豐富基因家族的成員，探討基因在貝類中的保守性，也為進(jìn)一步克隆貝類的性別決定和分化的候選基因及探討貝類性別決定和分化機(jī)制提供基礎(chǔ)資料(于非非等, 2007)。

采用第二代測(cè)序方法和RNAseq技術(shù)，對(duì)生產(chǎn)黑珍珠的黑唇珠母貝()不同發(fā)育階段的雄性和雌性性腺標(biāo)本進(jìn)行了測(cè)序，在Illumina測(cè)序、組裝和注釋之后，差異表達(dá)分析鑒定了1993種不同類型性腺間差異表達(dá)的contigs；樣本聚類分析解釋了性腺基因差異表達(dá)的大部分變異；對(duì)這些contigs的分析揭示了已知的編碼與性別決定和/或分化有關(guān)的蛋白質(zhì)的特異基因的存在，如雄性的和，雌性的和卵黃原蛋白特異性表達(dá)基因、和，在不同生殖階段(性別不確定、性反轉(zhuǎn)和性腺衰退)的表達(dá)譜表明這3個(gè)基因可能參與了黑唇珠母貝的精卵轉(zhuǎn)換。這些為研究雌雄同體海洋軟體動(dòng)物的繁殖提供了一種新的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法，鑒定了雄性先熟、雌雄同體黑唇珠母貝的性別分化和潛在的性別決定基因(Teaniniuraitemoana, 2014)。同樣是基于RNAseq數(shù)據(jù)集，嚴(yán)格的表達(dá)分析鑒定了1937個(gè)在性腺組織學(xué)分類中差異表達(dá)的contigs；9個(gè)候選基因被鑒定為性別通路的標(biāo)記：7個(gè)為雌性通路，2個(gè)為雄性通路(Teaniniuraitemoana, 2015)。這些是探究該物種和其他相關(guān)物種性別反轉(zhuǎn)、性別分化和性別決定論的有用工具。

具有家族的典型特征，與簇有顯著的同源性。定量PCR反應(yīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，配子發(fā)生過程中性腺中的mRNA在成熟個(gè)體中表達(dá)量最高；經(jīng)原位雜交證實(shí)，在精子、精細(xì)胞、卵母細(xì)胞和卵黃原細(xì)胞中均有表達(dá)；用RNA干擾技術(shù)敲除，導(dǎo)致mRNA表達(dá)水平下降，注射-dsRNA組為排放期雄性性腺，濾泡破裂，精子釋放。結(jié)果表明，的可能參與雄性性腺發(fā)育，維持雄性生殖功能(Wang, 2018)。采用RACE-PCR技術(shù)，從馬氏珠母貝雄性性腺的SMART cDNA中克隆了基因的全長(zhǎng)cDNA序列。同源性比對(duì)顯示，編碼的氨基酸序列與海膽()、線蟲()、青鳉()、斑馬魚()、爪蟾()和小鼠()的基因的同源性并不高，但它們的DM結(jié)構(gòu)域是高度保守的。RT-PCR結(jié)果認(rèn)為，基因可能參與了馬氏珠母貝性別發(fā)育的調(diào)控(于非非等, 2009)。利用RACE-PCR技術(shù)從SMART cDNA文庫(kù)中克隆到一個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)，通過熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)該基因在不同組織及發(fā)育不同時(shí)期性腺中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，馬氏珠母貝這個(gè)基因與長(zhǎng)牡蠣基因的同源性最高，為80%，故命名為；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析也顯示，與長(zhǎng)牡蠣基因的親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR分析組織表達(dá)特異性及時(shí)序表達(dá)圖譜顯示，基因可能在馬氏珠母貝早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和性別發(fā)育的調(diào)控方面起重要作用(于非非等, 2016)。利用RACE-PCR技術(shù)獲得企鵝珍珠貝()基因cDNA的全長(zhǎng)序列，通過熒光定量PCR分析基因在各組織中的表達(dá)特征，以及在早期雌性性腺、成熟期雌性性腺、早期雄性性腺、成熟期雄性性腺和排放期雄性性腺中的表達(dá)變化結(jié)果，推測(cè)可能與企鵝珍珠貝雄性性腺的發(fā)育有關(guān)，可能參與了企鵝珍珠貝雄性性別分化和性腺發(fā)育的生理過程(潘珍妮等, 2017)。同樣地，企鵝珍珠貝基因與黑蝶真珠蛤()和馬氏珠母貝有高度同源性(>81%)；在企鵝珍珠貝各組織中均有表達(dá)，在足中表達(dá)量最高(<0.05)，雄性性腺中其次；在成熟期雄性性腺中檢測(cè)到最大表達(dá)量(<0.05)，在發(fā)育早期的雄性性腺、退化期雄性性腺和成熟期雌性性腺中表達(dá)量較低，其中，發(fā)育早期雌性性腺表達(dá)量最低(<0.05)(許開航等, 2018)。

4 總結(jié)與展望

雙殼貝類常有性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，從已有的研究報(bào)道來看，除環(huán)境因素之外，遺傳物質(zhì)對(duì)性別的調(diào)控作用是主要因素，性激素可能會(huì)參與這一過程。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是動(dòng)物性食物生產(chǎn)增長(zhǎng)速度最快的領(lǐng)域，貝類是水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要對(duì)象之一，采用現(xiàn)代生物技術(shù)以滿足人們對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量增長(zhǎng)的需求日益迫切。然而，主要經(jīng)濟(jì)貝類種類較多，且繁殖特性和性別分化各有特點(diǎn)，盡管開展了大量相關(guān)研究，仍有很多未知亟待解答。通過對(duì)蝦夷扇貝雌雄2個(gè)性別3個(gè)不同發(fā)育階段的大樣本量性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)turquoise和green基因模塊的基因與雄性性狀密切相關(guān)，coral1和black基因模塊的基因與雌性性狀密切相關(guān)，在性別決定和性別分化中起非常重要的作用(Zhou, 2019)，目前，我們正在開展、、等基因功能驗(yàn)證分析。隨著轉(zhuǎn)錄組、基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，使得我們能以更開闊的視野探尋雙殼貝類性別分化的分子機(jī)制，將來有望對(duì)雙殼貝類進(jìn)行性別和生殖調(diào)控，培育高產(chǎn)、抗逆、抗病新品種(系)貝類，保護(hù)和增殖瀕?；蛘湎∝愵愘Y源。

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Review: Molecular Mechanism of Sex Differentiation in Major Economic Bivalves

ZHOU Liqing1,2, ZHAO Dan2, WU Zhou3, WU Lei4, YANG Jinlong2①

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. Marine Science and Technology College, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316000; 4. College of Marine Life and Fisheries, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005)

In this review, we have provided an overview of the current knowledge on the different molecular mechanisms of sex differentiation in major economic bivalves. The representative species of bivalves were introduced to understand the different mechanisms of sex differentiation or sex determination. The review provides a brief summary of the recent discoveries on sex differentiation in oysters, scallops, pearl oysters, and other common economically important bivalve species. The review highlights the various sex differentiation-associated molecular mechanisms by focusing on the involvement of nucleic acids, proteins, hormones, and so on. The current research trends on sex differentiation in bivalves have been discussed, which may help to advance our understanding of the sex differentiation and gonadal development of the Yesso scallop and other bivalves.

Bivalves; Sex differentiation; Genes; Molecule; Nucleic acid; Hormone; Protein

YANG Jinlong, E-mail: jlyang@shou.edu.cn

S917.4

A

2095-9869(2020)05-0023-09

10.19663/j.issn2095-9869.20191213001

http://www.yykxjz.cn/

周麗青, 趙丹, 吳宙, 吳磊, 楊金龍. 主要經(jīng)濟(jì)雙殼貝類性別分化的分子機(jī)制概述. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(5): 194–202

Zhou LQ, Zhao D, Wu Z, Wu L, Yang JL. Review: Molecular mechanism of sex differentiation in major economic bivalves. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 194–202

* 國(guó)家自然科學(xué)基金(31672637)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2018YFD0900800)和浙江重中之重開放基金(KF2018008)共同資助[This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31672637), National Key Research and Development Program of China (2018YFD0900800), and Zhejiang Provincial Top Discipline of Bioengineering (Level A) of China (KF2018008)]. 周麗青，E-mail: zhoulq@ysfri.ac.cn

楊金龍，教授，E-mail: jlyang@shou.edu.cn

2019-12-13,

2020-02-08

(編輯 馮小花)