王曉群，李小江，孔凡銘，王洪武，趙林林，潘 攀，劉筱迪，賈英杰

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

肺癌是目前世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。2019年美國(guó)和中國(guó)癌癥中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示肺癌發(fā)病率和病死率均占惡性腫瘤病死率的首位[1-2]。目前，西醫(yī)治療肺癌除了手術(shù)、放化療、靶向治療以外，免疫治療受到越來(lái)越多的重視。腫瘤能夠通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)免疫抑制細(xì)胞的產(chǎn)生，這是造成腫瘤免疫逃逸及腫瘤免疫治療失敗的主要原因。髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）具有強(qiáng)大的免疫抑制活性，能夠協(xié)助腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫逃逸[3]，是腫瘤免疫抑制微環(huán)境的主要成分之一，大量研究證實(shí)MDSCs可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[4-5]。MDSCs是阻礙抗腫瘤免疫的重要因素之一。因此，通過(guò)阻斷MDSCs來(lái)增強(qiáng)抗腫瘤免疫顯得尤為重要。

MDSCs來(lái)源于骨髓中的骨髓祖細(xì)胞和未成熟髓細(xì)胞（IMCs）。正常情況下，是粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和巨噬細(xì)胞（MF）的前體，能迅速地分化為成熟的粒細(xì)胞、DC和MF，并進(jìn)入相應(yīng)的器官、組織，發(fā)揮正常免疫功能。病理狀態(tài)下，這些髓系來(lái)源的前體細(xì)胞成熟受阻，停留在各個(gè)分化階段，成為具有免疫抑制功能的MDSCs[6]。小鼠體內(nèi)所有的MDSCs均可以表達(dá)CD11b，可根據(jù)其表達(dá)的LY6G和LY6C的差異，分為PMN-MDSC（CD11b+LY6G+LY6C-）和 M-MDSC（CD11b+LY6G-LY6C+）兩種亞型。

中醫(yī)藥在提高患者免疫力、提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)，中國(guó)著名中醫(yī)腫瘤學(xué)專家賈英杰教授認(rèn)為腫瘤免疫抑制微環(huán)境的本質(zhì)為“本元虧虛”，因此，其經(jīng)驗(yàn)方消巖湯以黃芪和太子參為君藥，前期通過(guò)研究已經(jīng)證實(shí)消巖湯能夠增強(qiáng)T細(xì)胞和自然（NK）細(xì)胞活性而提高腫瘤免疫功能[7-9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以免疫抑制細(xì)胞MDSCs為切入點(diǎn)，進(jìn)一步研究消巖湯重塑腫瘤免疫微環(huán)境的機(jī)制，為臨床研究及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株與動(dòng)物 Lewis細(xì)胞由天津賽爾生物技術(shù)有限公司提供；SPF級(jí)C57BL/6小鼠30只，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供（合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0004），近交系，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，飼養(yǎng)于天津賽爾生物公司動(dòng)物房。

1.2 藥物 注射用環(huán)磷酰胺0.2g，批號(hào)：H20110407，Baxter Oncology GmbH生產(chǎn)。消巖湯成分為生黃芪30 g，太子參15 g，郁金 10 g，姜黃 15 g，夏枯草 10 g，生牡蠣15 g，白花蛇舌草10 g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供并進(jìn)行質(zhì)控。按傳統(tǒng)煎法，先煎40 min，二煎30 min，兩煎合兌。根據(jù)成人每日需要的生藥量140 g換算為小鼠每日生藥量30 g/kg體質(zhì)量，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮為全方28.77 g/mL。置于冰箱4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑及儀器 流式試劑：Anti-Mouse CD11b PE，F(xiàn)ITC Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C，PerCP-Cy5.5 Anti-Mouse Ly-6C，APC Anti-Mouse Ly-6G均購(gòu)自美國(guó)Becton-Dicknson公司；白細(xì)胞介素（IL）-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。FAC sort型流式細(xì)胞儀，Becton-Dicknson，美國(guó)；酶標(biāo)儀，Rayto，RT-6100，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

2 方法

2.1 造模 Lewis細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，至80%密度為宜，用胰酶消化細(xì)胞成單個(gè)，計(jì)數(shù)后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）調(diào)整濃度到1×107/mL，所用液體均預(yù)熱，細(xì)胞離心2 000 r/min（離心半徑10 cm），5 min，棄培養(yǎng)液，取80 μL無(wú)血清培養(yǎng)基小心混合細(xì)胞（總體積約100 μL）；然后用1 mL注射器吸取細(xì)胞懸液，排空氣泡，將細(xì)胞接種于小鼠右前肢腋背部皮下，每3天觀察一次腫瘤的生長(zhǎng)情況。2周后，處死小鼠，剝離生長(zhǎng)旺盛期的瘤組織，選取1.0 mm×0.5 mm×0.3 mm左右生長(zhǎng)良好的腫塊，按腫瘤（g）∶生理鹽水（mL）為1∶3比例勻漿，調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×106/mL。在無(wú)菌條件下，每只小鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.2 mL。1周后小鼠腋下可觸及明顯腫塊，說(shuō)明荷瘤模型成功建立。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 30只小鼠，6只為空白組，另外造模的24只小鼠隨機(jī)分為模型組、環(huán)磷酰胺（CTX）組、消巖湯組、聯(lián)合組，每組6只。空白組、模型組：每日灌胃0.2 mL生理鹽水；消巖湯組：每日予濃度為28.77g/mL的中藥湯劑灌胃2次，每次0.2mL；CTX組：腹腔注射CTX 0.2 mL（給藥劑量以60 mg/kg計(jì)，用生理鹽水稀釋，濃度為6 mg/mL）；聯(lián)合組：每日中藥湯劑灌胃2次，每次0.2 mL+腹腔注射CTX 0.2 mL。連續(xù)給藥7 d后，眼眶取血后處死小鼠，完整剝離皮下移植瘤，無(wú)菌摘取脾臟和胸腺。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.3.1 抑瘤率、脾指數(shù)、胸腺指數(shù) 處死小鼠剝離腫瘤組織，拍照并稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。無(wú)菌摘取脾臟和胸腺，濾紙吸去表面液體，稱取質(zhì)量，計(jì)算脾指數(shù)、胸腺指數(shù)。

抑瘤率（%）=（1-治療組平均瘤質(zhì)量/模型組平均瘤質(zhì)量）×100%

脾/胸腺指數(shù)（mg/g）=脾/胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

2.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟中MDSCs水平 脾臟研磨后，制成單細(xì)胞懸液，加PBS，反復(fù)兩次。加紅細(xì)胞裂解液，靜置5 min，配平后離心5 min，棄上清。再加入PBS重懸細(xì)胞兩次，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至107/mL，至于碎冰上待用。每個(gè)流式加入CD11b、Gr-1（Ly-6G and LY-6C）、LY6C 和 LY6G 各 2 μL，加入制備好的脾臟單細(xì)胞懸液100 μL，震蕩混勾后，冰上避光孵育30 min。加入PBS 2 mL混勻，洗1次。洗2次后，重懸于PBS 300 μL中，避光4℃保存。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3.3 ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中IL-6、TGF-β水平 各組小鼠給藥7 d后眼眶取血，室溫避光靜置30～60 min，通過(guò)低溫高速離心機(jī)，3 500 r/min（離心半徑10 cm），離心20 min后取上清，-80°C低溫保存。擇期通過(guò)ELISA試劑盒（按照試劑盒說(shuō)明操作），分別檢測(cè)白細(xì)胞介素（IL）-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料分別以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）組間兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠臟器指數(shù)及抑瘤率 如表1所示，與空白組相比，模型組小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，消巖湯組及聯(lián)合組脾指數(shù)及胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與CTX組相比，消巖湯組及聯(lián)合組脾指數(shù)顯著升高（P＜0.05），聯(lián)合組胸腺指數(shù)顯著增高（P＜0.05）；此外，收集各組小鼠腫瘤，計(jì)算抑瘤率結(jié)果表明，消巖湯、環(huán)磷酰胺及聯(lián)合用藥干預(yù)均可抑制腫瘤生長(zhǎng)，抑瘤率分別為20.3%、49.7%及56.7%。見(jiàn)圖1。

表1 各組小鼠臟器指數(shù)及抑瘤率比較Tab.1 Comparison of visceral index and tumor inhibition rate of mice in each group

圖1 各組小鼠瘤體照片F(xiàn)ig.1 Tumors images of mice in each group

3.2 MDSCs百分比 與空白組相比，模型組小鼠脾臟中MDSCs百分比顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，消巖湯組、CTX組及聯(lián)合組小鼠脾臟中MDSCs百分比不同程度顯著降低（P＜0.05）；與CTX組相比，聯(lián)合組小鼠脾臟中MDSCs百分比顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表 2、圖 2。

表2 各組小鼠脾臟中MDSCs百分比比較（±s）Tab.2 Comparison of MDSCs percentage in spleen of mice in each group（±s）%

表2 各組小鼠脾臟中MDSCs百分比比較（±s）Tab.2 Comparison of MDSCs percentage in spleen of mice in each group（±s）%

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) MDSCs空白組 6 42.56±5.58模型組 6 77.70±7.61*消巖湯組 6 68.80±5.15#CTX 組 6 61.23±6.66#聯(lián)合用藥組 6 54.68±4.99*#

3.3 小鼠血清中IL-6、TGF-β水平 與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-6和TGF-β水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，消巖湯組、CTX 組及聯(lián)合組小鼠血清中IL-6和TGF-β水平有不同程度降低（P<0.05）；與CTX組相比，聯(lián)合組小鼠血清中TGF-β 水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 各組小鼠血清中細(xì)胞因子水平（±s）Tab.3 Serum cytokine levels of mice in each group（±s）pg/mL

表3 各組小鼠血清中細(xì)胞因子水平（±s）Tab.3 Serum cytokine levels of mice in each group（±s）pg/mL

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 CTX 組比較，△P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) IL-6 TGF-β空白組 6 77.91±10.29 140.74±25.47模型組 6 155.24±11.17* 212.10±13.28*消巖湯組 6 124.88±9.68# 186.30±6.29#CTX 組 6 109.20± 9.01# 180.69±12.78#聯(lián)合用藥組 6 106.81±15.13# 148.11±23.60#△

4 討論

圖2 各組小鼠脾臟中MDSCs流式圖Fig.2 MDSCs flow diagram in spleen of mice in each group

肺癌屬于中醫(yī)“肺積”“息賁”等范疇。賈英杰教授認(rèn)為在肺癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中虛、毒、瘀、濁貫穿始末，基于此，提出黜濁培本治癌法則。臨證時(shí)秉承“始終扶正培本，時(shí)時(shí)黜癌濁，以益氣為第一要?jiǎng)?wù)”，其認(rèn)為益氣培本莫過(guò)于黃芪?！侗静萸笳妗分赋觯骸包S芪為補(bǔ)氣諸藥之長(zhǎng)，是以有耆之稱?！辟Z英杰教授認(rèn)為非重劑不足以治重病，喜用重劑黃芪以培固本元[10]，黃芪也是其經(jīng)驗(yàn)方消巖湯的核心所在。消巖湯以黃芪、太子參扶正培本共為君藥，白花蛇舌草、生牡蠣、夏枯草消癌解毒共為臣藥，郁金、姜黃行氣活血為佐藥，解毒化瘀之品共同截?cái)喟嵘桑浞克烟藿?jīng)絡(luò)中之癌濁為使藥。諸藥相伍，共奏扶正、解毒、祛瘀之功效。本研究結(jié)果表明，消巖湯對(duì)肺癌有一定的抑制作用，與化療藥物聯(lián)用抑瘤效果更佳。且消巖湯對(duì)小鼠脾臟和胸腺有一定的保護(hù)作用。

MDSCs是參與腫瘤免疫微環(huán)境形成的主要免疫抑制性細(xì)胞，活化和擴(kuò)增后的MDSCs通過(guò)直接和間接機(jī)制抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[11]，研究證實(shí)MDSCs通過(guò)高表達(dá)Arg-1、iNOS途徑抑制T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的抗腫瘤作用[12]，越來(lái)越多的研究證實(shí)中醫(yī)藥能降低MDSCs的免疫抑制，從而達(dá)到降低腫瘤免疫逃逸的目的。國(guó)內(nèi)外通過(guò)臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)逐步證明中醫(yī)藥對(duì)MDSCs有調(diào)控作用[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明荷瘤狀態(tài)下MDSCs可大量擴(kuò)增，消巖湯可降低小鼠脾臟中MDSCs水平，與化療藥物聯(lián)用效果更顯著。

腫瘤微環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生大量炎性因子，這些炎性因子能使MDSCs募集、擴(kuò)增和激活，啟動(dòng)免疫抑制。IL-6和TGF-β都在腫瘤免疫中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，IL-6能上調(diào)致癌轉(zhuǎn)錄因子STAT3[14]，進(jìn)而啟動(dòng)JAK/STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)MDSCs擴(kuò)增。TGF-β能活化JAK1-STATl通路，激活MDSCs[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明消巖湯能協(xié)助化療藥物下調(diào)IL-6、TGF-β的表達(dá)，抑制MDSCs擴(kuò)增，重塑免疫微環(huán)境。

中醫(yī)藥治療腫瘤的主要優(yōu)勢(shì)在于改善機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，尤其是重塑腫瘤相關(guān)的微環(huán)境，MDSCs是腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵成分，如今中醫(yī)藥以腫瘤微環(huán)境里的MDSCs為作用靶點(diǎn)也為腫瘤治療提供新思路[16-18]。目前有多種策略可以阻抑MDSCs的免疫抑制，主要包括：1）誘導(dǎo)髓系細(xì)胞向正性調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化。2）抑制MDSCs的增殖與活化。3）增加MDSCs的消耗[19]。但是MDSCs在腫瘤免疫逃逸方面的作用機(jī)制極其復(fù)雜，在今后的研究中將更加多層次、多靶點(diǎn)、多通路的探討中醫(yī)藥調(diào)控MDSCs的分子機(jī)制，并將研究深入到MDSCs的具體亞型。