蔣詩夢 黃仁志 蔣勇兵 賈超華 秦志雄

(湖南省蠶?？茖W研究所，湖南長沙 410127)

桑樹作為污染耕地替代種植的經(jīng)濟作物，對重金屬有一定的耐受性，其地上部分對鎘(Cd)、鉛(Pb)的富集系數(shù)小于1，富集能力有限[1]，而據(jù)文獻報道在土壤中添加螯合劑可以促進植物對重金屬的吸收，提高其對重金屬的富集轉(zhuǎn)移效率[2]，且不同螯合劑對同一種重金屬增溶效果不同，同一種螯合劑對不同金屬離子的螯合能力也不相同[3]。螯合劑在誘導植物修復污染土壤的過程中對植物生長的影響包括低濃度的螯合劑能促進鬼針草[4]、商陸[5]的生長，隨著螯合劑添加濃度的增加，玉米、苧麻中的重金屬含量會呈現(xiàn)增加的趨勢[6-7]，同時過高濃度的螯合劑又會對植物生長產(chǎn)生抑制作用[8-9]。目前，螯合劑對桑樹修復重金屬污染土壤的相關研究還未見報道，本文通過開展盆栽試驗，分別添加活化能力強-衰減緩慢型的螯合劑乙二胺四乙酸(C10H16N2O8，EDTA)、中等活化能力-衰減顯著型的二乙烯三胺五乙酸(C14H23N3O10，DTPA)、低活化能力型的檸檬酸(C6H8O7·H2O，CA)[10]來探討螯合劑添加種類、濃度對桑樹生長及土壤中Cd、Pb含量的影響，旨在篩選出在污染耕地中適合與桑樹聯(lián)合使用的螯合劑，為桑樹修復土壤重金屬污染的應用技術(shù)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土壤和桑苗 供試土壤取自湘西洞口縣花園鎮(zhèn)寶萬村的污染土壤，Cd含量為11.81±0.58 mg/kg，Pb含量為418.90±55.49 mg/kg，Cd、Pb含量分別為GB 15618—1995《土壤環(huán)境質(zhì)量標準》[11]中各自自然背景的59倍和12倍。試驗用的桑苗為農(nóng)桑14號的實生苗，購自射陽縣恒威蠶業(yè)專業(yè)合作社。

1.1.2 試驗藥劑與儀器 EDTA、DTPA、CA、丙酮均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；PBS磷酸鹽緩沖液，購自上海瑞楚生物科技有限公司；蛋白檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒、過氧化物酶(POD)測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；752N紫外可見分光光度計，上海分析儀器總廠產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 盆栽處理 將供試土壤拌好裝入盆中，每盆裝土12 kg，然后分別添加螯合劑EDTA、DTPA、CA，每種螯合劑分別設置低濃度(1.00 mmol/kg)、中濃度(5.00 mmol/kg)、高濃度(10.00 mmol/kg)和空白對照(CK)4組處理，每組處理均設置3個重復，共計36盆。每盆栽植1株桑苗，栽植后整形剪枝，每枝留3～4個芽苞，從3月至10月，做好盆栽苗的日常管理，定期澆水、施肥、松土。

1.2.2 桑苗生長狀況調(diào)查 7月中旬，統(tǒng)計每組盆栽桑苗的枝條總數(shù)，測量桑苗枝條長度、葉片數(shù)及最大葉幅，根據(jù)以上數(shù)值衡量桑苗的生長狀況。

1.2.3 葉綠素含量測定 9月中旬，在最終取樣前，用內(nèi)徑為13 mm的不銹鋼打孔器切取桑苗頂部的葉片，放入80%的丙酮溶液中過夜后提取葉綠素，分別用752N紫外可見分光光度計測定提取液的645 nm和663 nm的吸光度值，根據(jù)公式計算葉綠素含量：葉綠素含量(mg/dm2)=[0.5(20.29A+8.05A1)]/S，式中的A為645 nm吸光度值，A1為663 nm吸光度值，S為內(nèi)徑13 mm的打孔器切取的葉片面積。

1.2.4 抗氧化酶活性測定及MDA含量測定 10月最終取樣時，準確稱取葉片質(zhì)量，按葉片質(zhì)量(g)∶磷酸鹽緩沖液體積(mL)=1∶9的比例，加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，冰浴研磨，3 500 r/min離心10 min，取上清液制成10%的組織勻漿。取10%的組織勻漿，按照蛋白檢測試劑盒說明書中的操作步驟檢測葉片樣品中的蛋白濃度后，再分別用試劑盒檢測并計算葉片樣品中T-SOD、POD、CAT酶的活性及葉片中MDA的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 螯合劑種類及添加濃度對桑苗生長的影響情況

從不同螯合劑不同添加濃度對盆栽桑苗的枝條總數(shù)、枝條長度、葉片數(shù)及葉片最大葉幅的影響情況(表1)可以看出：整個生長周期中，添加不同濃度CA的桑苗長勢均較好，添加中濃度、高濃度EDTA和高濃度DTPA的桑苗長勢較差，葉片過早出現(xiàn)掉落、黃化、止芯的現(xiàn)象；隨著螯合劑添加濃度的升高，桑苗枝條總數(shù)、葉片最大葉幅總體呈下降的趨勢。另外，桑苗枝條長度的統(tǒng)計分析結(jié)果表明：添加不同濃度的CA對枝條長度無顯著影響，而添加中濃度、高濃度的DTPA和EDTA可使枝條長度顯著低于對照組；添加不同濃度的DTPA和CA對桑苗葉片數(shù)無顯著影響，而添加高濃度的EDTA使桑苗葉片數(shù)顯著低于對照組(表1)。

表1 不同螯合劑不同添加濃度對盆栽桑苗的枝條總數(shù)、枝條長度、葉片數(shù)及葉片最大葉幅的影響情況

2.2 螯合劑種類及添加濃度對桑苗葉片中葉綠素含量、抗氧化酶活性及MDA含量的影響情況

從不同螯合劑不同添加濃度對盆栽桑苗的葉綠素含量、抗氧化酶活性及MDA含量的影響情況(表2)可以看出，添加不同濃度的CA對桑苗葉片的葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量、抗氧化酶活性及MDA含量均無顯著影響，添加低濃度的EDTA對桑苗葉片的葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量、抗氧化酶活性及MDA含量也無顯著影響；添加不同濃度的DTPA對桑苗葉片的SOD酶活性、CAT酶活性、MDA含量無顯著影響，添加低濃度、中濃度的DTPA對桑苗葉片的葉綠素含量無顯著影響，但添加中濃度、高濃度的DTPA使葉片蛋白質(zhì)含量顯著低于對照組，添加高濃度的DTPA使桑苗葉片POD酶活性顯著高于對照組。試驗還發(fā)現(xiàn)，添加中濃度、高濃度EDTA的桑苗出現(xiàn)接連死亡的情況，導致樣品不足，所有數(shù)據(jù)均缺失。

表2 不同螯合劑不同添加濃度對盆栽桑苗的葉綠素含量、抗氧化酶活性及MDA含量的影響情況

2.3 螯合劑種類及添加濃度對桑苗根部土壤與桑苗根部Cd、Pb含量的影響情況

從不同螯合劑不同添加濃度對盆栽桑苗根部土壤與桑苗根部Cd含量的影響情況(表3)可以看出：添加不同濃度的CA對桑苗根部土壤Cd含量無顯著影響；但添加DTPA、EDTA對桑苗根部土壤中的Cd含量有顯著影響，其中添加中濃度、高濃度的DTPA和高濃度的EDTA均使桑苗根部土壤Cd含量顯著低于對照組。從表3還可以看出，隨著添加螯合劑濃度的增加，桑苗根部Cd含量值會出現(xiàn)差異，但統(tǒng)計分析表明差異并未達到顯著水平。

表3 不同螯合劑不同添加濃度對盆栽桑苗根部土壤與桑苗根部Cd含量的影響情況

從不同螯合劑不同添加濃度對盆栽桑苗根部土壤與桑苗根部Pb含量的影響情況(表4)可以看出：添加不同濃度的CA對桑苗根部土壤Pb含量無顯著影響；但添加DTPA、EDTA對盆栽桑苗根部土壤Pb含量有顯著影響，其中添加中濃度的DTPA使桑苗根部土壤Pb含量顯著高于對照組，添加高濃度的EDTA使桑苗根部土壤Pb含量顯著低于對照組。添加3種不同的螯合劑，除了添加高濃度的DTPA使桑苗根部Pb含量顯著高于對照組外，其它螯合劑不同濃度處理的桑苗根部Pd含量均無顯著差異(表4)。

表4 不同螯合劑不同添加濃度對盆栽桑苗根部土壤與桑苗根部Pb含量的影響情況

3 小結(jié)與討論

隨著添加螯合劑濃度的升高，盆栽桑苗葉片的部分指標與對照組相比呈現(xiàn)下降的趨勢，尤其是EDTA高濃度組最早出現(xiàn)桑苗止芯、死亡的現(xiàn)象，這表明高濃度的螯合劑會抑制桑苗的生長。這與相關研究結(jié)果一致，如有研究表明：隨著添加螯合劑[谷氨酸N，N-二乙酸(GLDA)、DTPA]時間的延長(第16天)，在玉米中會出現(xiàn)螯合劑毒性導致生物量大幅下降，最后重金屬提取量增高不大甚至大幅下降的情況[10]；添加EDTA在促進苧麻各部分Cd吸收的同時，也會對苧麻的生長產(chǎn)生不利影響[12]；添加較高濃度(7.50 mmol/kg)的EDTA對棉花產(chǎn)生了毒害作用[13]。本文在此基礎上檢測了各組桑苗葉片中的葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量、MDA含量及抗氧化酶活性，植物通過抗氧化保護酶系統(tǒng)的變化來清除由重金屬脅迫造成的自由基失衡，不同螯合劑種類及添加濃度有不同的表現(xiàn)。有研究表明，添加EDTA前期(開始10 d)，地被竹會通過增加SOD、POD、CAT酶活性和可溶性蛋白質(zhì)含量抵抗Pb脅迫[14]，EDTA的添加還能引起苧麻根系的CAT酶活性急劇下降[7]；此外，移栽50 d后，高濃度的EDTA會導致苧麻葉片中的MDA含量增加[15]。從本文數(shù)據(jù)中僅能看出添加EDTA、DTPA對重金屬污染土壤中栽植的桑苗生長存在影響，如顯著降低了桑苗的枝條長度，但桑苗葉片的葉綠素含量、SOD酶活性、CAT酶活性、MDA含量等均未體現(xiàn)出明顯差異，數(shù)據(jù)顯示，只有添加DTPA降低了葉片的蛋白質(zhì)含量，提高了葉片的POD酶活性。不能排除的是，由于試驗周期設置太長，導致以上指標的變化未能通過及時檢測而明晰。

因為添加螯合劑DTPA與EDTA中濃度(5.00 mmol/kg)和高濃度(10.00 mmol/kg)處理組的桑苗先后出現(xiàn)止芯死亡的現(xiàn)象，桑葉掉落，致使整株桑苗Cd含量的數(shù)據(jù)不具代表性，所以通過最終分析桑苗根部土壤、桑苗根部Cd、Pb含量的變化來評判螯合劑對桑苗吸收重金屬Cd、Pb的影響。有文獻表明，隨著EDTA施用濃度的增加，土壤中Cd和Pb含量顯著降低[15]；施用EDTA處理根際土壤Cd含量與對照相比降低了25%[16]；但在栽植欒樹幼苗的盆栽中添加不同濃度的EDTA則發(fā)現(xiàn)，EDTA提高了土壤中重金屬的解吸能力，在添加90 d后，土壤Cd含量達到最高值，而360 d后土壤中的Pb含量才達到最高值，同時期土壤重金屬含量EDTA較低濃度處理(0.25 mmol/kg、0.50 mmol/kg)高于中低濃度處理(2.00 mmol/kg、4.00 mmol/kg)[17]。本文添加低濃度、中濃度的EDTA，土壤中的Cd、Pb含量與對照相比差異不顯著，而添加高濃度的EDTA可使根部土壤Cd、Pb含量顯著低于對照及低濃度、中濃度處理組數(shù)據(jù)，且添加不同濃度的EDTA對桑苗根部的Cd、Pb含量無顯著影響，推測添加高濃度的EDTA有利于土壤中Cd、Pb被桑苗吸收與向地上部分的轉(zhuǎn)移，從而對桑苗表現(xiàn)出了毒性。

本試驗中，隨著添加DTPA濃度的增加，根部土壤中Cd含量下降，添加中濃度、高濃度DTPA的根部土壤Cd含量與對照相比達到了顯著水平，但桑苗根部的Cd含量沒有隨著添加DTPA濃度的增加而表現(xiàn)出顯著差異，推測中濃度、高濃度的DTPA有利于桑苗對Cd的吸收與Cd向地上部分的轉(zhuǎn)移。桑苗根部土壤中的Pb含量隨著添加DTPA濃度的增加與對照相比出現(xiàn)了與Cd含量變化不同的趨勢，添加中濃度的DTPA顯著增加了根部土壤中的Pb含量，添加低濃度、高濃度的DTPA桑苗根部土壤中的Pb含量與對照相比無顯著差異，推測添加中濃度的DTPA有利于土壤中的Pb聚集在桑苗根部，同時添加高濃度的DTPA時桑苗根部的Pb含量顯著高于對照組和添加低濃度、中濃度處理組的數(shù)據(jù)，推測添加高濃度的DTPA有利于桑苗根部對Pb的吸收。

添加CA可提高土壤質(zhì)量[18]，可以促進苧麻生長，增強苧麻對Cd的吸收和轉(zhuǎn)移，但對Pb的吸收轉(zhuǎn)移效果不顯著[19]；也有研究表明CA能有效促進Pb在魚腥草體內(nèi)向地上部分轉(zhuǎn)移，對Cd則表現(xiàn)出抑制作用[9]。但在本文中，添加不同濃度的CA對桑苗根部土壤Cd、Pb含量無顯著影響，對桑苗根部的Cd、Pb含量也無顯著影響。

本試驗研究了不同種類、不同濃度螯合劑對土壤與桑苗Cd、Pb含量的影響，結(jié)果表明，除CA外，添加中濃度、高濃度的DTPA與高濃度的EDTA時，桑苗根部土壤中的Cd、Pb含量與對照相比變化顯著，但考慮添加高濃度的螯合劑會對桑苗的生長產(chǎn)生毒性作用使桑苗死亡，在土壤中添加中濃度的DTPA或許是適合與桑樹聯(lián)合修復污染農(nóng)田的措施，這還需要后續(xù)試驗加以驗證，通過跟蹤監(jiān)測各數(shù)據(jù)，結(jié)合桑苗生長的不同時期探索施加螯合劑發(fā)揮作用的最佳時間，也可考慮在桑苗生長過程中分次添加低濃度的螯合劑，以降低螯合劑的毒性，最大限度地發(fā)揮螯合劑的作用。