余 芳，鄭 萍，劉晴晴

(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 a.健康學(xué)院; b.江蘇省食品安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇 南京 211168)

烏飯樹是杜鵑花科越橘屬植物，又名南燭、烏飯子、染菽等，廣泛分布于長江以南各地區(qū)，多生長在山坡灌木叢或馬尾松林內(nèi)，屬杜鵑花科四季常綠的灌木，其葉子為卵形或橢圓形，秋季開白色花，其漿果為球狀，熟時呈紫黑色，味甜可食。每年陰歷四月初八，南京地區(qū)有用烏飯樹葉打成汁水浸泡大米、煮烏米飯食用的傳統(tǒng)。唐代陸龜蒙在《道室書事》中有“烏飯新炊筆服香，道家齋日以為?！敝Z。明代《正德江寧縣志》卷2記載：“四月八日吱烏飯?！崩顣r珍在《本草綱目》中稱：“烏飯乃仙家服食之法?！睘躏垬淙~全緣或有鋸齒狀，表面平坦有光澤，味苦、平、無毒。清代《本草新編》中記載，烏飯葉“益精氣，強筋骨，明目，止泄”，是重要的藥材，具有抗衰老、抗炎癥、改善血液循環(huán)等多種藥理功效。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，烏飯枝葉性味苦、平、無毒，止泄除睡，強筋益氣，久服輕身明目，黑發(fā)駐顏，可以調(diào)補脾腎、舒筋活絡(luò)、助陽補陰，日常食用對人體有一定的益處。烏飯葉中含有多酚類物質(zhì)、黃酮、熊果酸、β-谷甾醇、藍黑色素、對羥基桂皮酸、內(nèi)消旋肌醇、α-亞麻酸以及鈣、鉀、鋅、鐵、錳、銅、鍶等大量的微量元素。吳鳳桐等從烏飯葉的石油醚提取物中分離鑒定出2種物質(zhì)結(jié)晶：烏索酸(ursolic acid)、齊墩果酸(olanolic acid)。其含有的多酚類物質(zhì)抗氧化能力很強，具有抗疲勞及延緩衰老的作用。α-亞麻酸具有降低血壓、調(diào)節(jié)血脂、減少血栓的作用，熊果酸有降血糖的作用。

本實驗以新鮮烏飯葉為原料，采用單因素實驗和正交試驗，探索烏飯葉中多酚類物質(zhì)的提取方法，優(yōu)化提取工藝，確定最佳工藝參數(shù)，為進一步開發(fā)利用傳統(tǒng)烏飯葉資源提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

烏飯葉，市售當(dāng)年新葉，5月間采于江蘇省南京市江寧區(qū)青龍山。

1.2 實驗試劑

實驗所需試劑見表1。

表1 實驗所需試劑

1.3 主要設(shè)備

BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司； SHA-C電熱恒溫水浴鍋，上海路達實驗儀器有限公司；JH722可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；DS-1高速組織搗碎機，上海精密儀器儀表有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 試樣制備

當(dāng)日采摘新鮮烏飯葉，洗凈葉面灰塵后，自然瀝水至葉面無水分殘留，分裝入塑料包裝袋，于冰箱中冷藏備用。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

酒石酸鐵溶液的配制：準(zhǔn)確稱取1 g硫酸亞鐵和5 g酒石酸鉀鈉，將所稱取固體放入燒杯，加適量蒸餾水溶解，分次轉(zhuǎn)入1000 mL容量瓶，稀釋定容至刻度。

pH 7.5磷酸緩沖液的配制：準(zhǔn)確稱取60.20 g磷酸氫二鈉和5 g磷酸二氫鈉，將所稱取固體放入燒杯，加適量蒸餾水溶解，分次轉(zhuǎn)入1000 mL容量瓶，稀釋定容至刻度。

1.4.3 多酚含量的測定

準(zhǔn)確吸取不同處理條件下提取過濾后獲得的待測液體4 mL(需現(xiàn)配現(xiàn)用)，分別放入100 mL容量瓶，再吸取16 mL蒸餾水、20 mL酒石酸鐵溶液，用磷酸緩沖液定容至刻度線處。同時做一個空白樣，準(zhǔn)確吸取20 mL蒸餾水和20 mL酒石酸鐵溶液放入100 mL容量瓶，用磷酸緩沖液定容至刻度線。放置10 min后，將1 cm的玻璃比色杯置于540 nm處，測定其吸光度。根據(jù)吸光度等于1時，多酚含量為7.826 mg計算：

多酚(%)=[(A×7.826)/103]×[T/(V×M)]×102

其中：A——樣液的吸光度，T——供試液總量(mL)，V——吸取的樣液量(mL)，M——樣品質(zhì)量(g)。

1.5 單因素實驗

準(zhǔn)確稱取烏飯葉10 g，適當(dāng)剪碎，加適量溶劑，經(jīng)高速組織搗碎機搗碎，待提取多酚類物質(zhì)。通過單因素實驗，考察料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、水浴提取溫度、提取時間對烏飯葉多酚類物質(zhì)得率的影響。

1.5.1 料液比

按照料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時間30 min，水浴提取溫度60 ℃，測定烏飯葉多酚類物質(zhì)得率。

1.5.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%、60%，料液比為1∶10，提取時間為30 min，水浴提取溫度為60 ℃，測定烏飯葉多酚類物質(zhì)得率。

1.5.3 提取時間

設(shè)定提取時間為0.5、1、1.5、2、2.5 h，料液比為1∶10，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，水浴提取溫度為60 ℃，測定烏飯葉多酚類物質(zhì)得率。

1.5.4 提取溫度

設(shè)定水浴提取溫度為40、50、60、70、80 ℃，料液比為1∶10，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，提取時間為30 min，測定烏飯葉多酚類物質(zhì)得率。

1.6 正交試驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、水浴提取時間、提取溫度作為考察的 4個因素，每因素設(shè)置 3個水平，進行 L9(34)正交試驗優(yōu)化提取條件，確定最佳提取工藝，見表2。

表2 正交試驗因素水平表

1.7 數(shù)據(jù)處理

測定結(jié)果均平行重復(fù)3次(n=3)，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件對多酚類物質(zhì)得率的影響

2.1.1 料液比對多酚類物質(zhì)得率的影響

如圖1所示：當(dāng)料液比為1∶5時，在水浴提取過程中乙醇蒸發(fā)損失，導(dǎo)致可能存在料液比誤差，提取液過濾后獲得的樣液很少，在此過程中由于提取液被濃縮而顯示吸光值虛高；當(dāng)料液比增加到1∶10、1∶20、1∶30、1∶40后，吸光值呈現(xiàn)先增后減的趨勢，1∶40時已處于下降狀態(tài)，且料液比越大，多酚類物質(zhì)的提取得率越低。因此選擇料液比1∶10、1∶20、1∶30作為正交試驗的三個試驗水平。

圖1 料液比對多酚類物質(zhì)得率的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚類物質(zhì)得率的影響

如圖2所示：隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多酚類物質(zhì)的溶解度不斷增大，多酚類物質(zhì)得率呈現(xiàn)上升趨勢；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～50%時，多酚類物質(zhì)的溶解度達到較高狀態(tài)，60%后呈下降趨勢，溶解度降低。因而選擇乙醇濃度30%、40%、50%作為正交試驗乙醇體積分?jǐn)?shù)的三個試驗水平。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚類物質(zhì)得率的影響

2.1.3 提取時間對多酚類物質(zhì)得率的影響

由圖3可知，在提取時間為1.5～2.5 h時，隨著提取時間的延長，烏飯葉中多酚類物質(zhì)得率直線提升，可見反應(yīng)時間越長，提取越充分。但考慮提取時間越長，多酚類物質(zhì)越容易被氧化，對試驗結(jié)果影響程度較大，因此選擇1、1.5、2 h作為正交試驗提取時間的三個水平。

圖3 提取時間對多酚類物質(zhì)得率的影響

2.1.4 提取溫度對多酚類物質(zhì)得率的影響

由圖4可知，隨著水浴提取溫度的升高，多酚類物質(zhì)的溶解度不斷增大，多酚類物質(zhì)得率一直處于上升狀態(tài)，但溫度越高，提取溶劑乙醇溶液的蒸發(fā)速度越快，極易造成料液比的誤差和提取液的濃縮，從而導(dǎo)致吸光值虛高。因此選取60、70、80 ℃作為正交試驗提取溫度的三個水平。

圖4 提取溫度對多酚類物質(zhì)得率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

對單因素實驗結(jié)果進行極差分析，以確定最佳提取條件。以料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)作為4個考察因素，選取3個水平進行L9(34)正交試驗。每一水平K1、K2、K3中的最大值所對應(yīng)的條件即為該因素對應(yīng)的最佳提取條件。正交試驗結(jié)果見表3。

由表3可知，提取烏飯葉中多酚類物質(zhì)的最佳工藝條件為A1B3C3D3，即料液比1∶10 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù) 50%、提取時間2 h、提取溫度 80 ℃。4個因素對烏飯葉中多酚類物質(zhì)得率的影響大小依次為：A>B>C>D。其中料液比A的提取作用最為顯著。

表3 L9(34)正交試驗結(jié)果

續(xù)表3：

影響烏飯葉中多酚類物質(zhì)得率的主要因素有液料比、超聲波輔助提取、浸提溫度、浸提時間和提取次數(shù)等。

余清采用醇提法提取烏飯葉多酚類物質(zhì)，通過單因素實驗及正交試驗確定了最佳提取工藝為浸提溫度75 ℃、乙醇濃度50%、固液比1∶40、提取時間2 h、提取2次。方差分析結(jié)果表明固液比和提取時間對多酚類物質(zhì)的提取效果影響極顯著，確證實驗表明該條件下烏飯葉提取液中多酚含量達11.36%。

王芳等通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化烏飯葉黃酮、多酚的提取工藝。結(jié)果表明，烏飯葉黃酮、多酚的最佳提取工藝條件為提取溶劑50%乙醇，料液比1∶41，提取時間50 min，提取溫度83 ℃，該條件下黃酮、多酚類物質(zhì)得率分別為33.4、23.5 mg/g。

陳瑞嬌對烏飯樹葉多酚的超聲波輔助提取最佳工藝及其抗氧化活性進行研究。結(jié)果表明，烏飯樹葉多酚超聲波輔助提取最佳工藝條件為超聲溫度75 ℃、超聲時間40 min、料液比1∶30(g/mL)，在此條件下烏飯樹葉多酚提取量可達71.01 mg/g。

3 結(jié)論

采用單因素實驗和L9(34)正交試驗，以料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)作為4個考察因素，選取3個水平進行試驗，得出提取烏飯葉中多酚類物質(zhì)的最佳工藝條件為：料液比1∶10(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù) 50%、提取時間2 h、提取溫度 80 ℃。該試驗條件下烏飯葉提取液中的多酚類物質(zhì)得率為13.0%。四個因素對烏飯葉中多酚類物質(zhì)得率的影響大小依次為：A>B>C>D。即料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時間>提取溫度。

4 展望

烏飯樹主要產(chǎn)于我國浙江、江蘇、福建等長江以南地區(qū)。烏飯葉的食用方法以現(xiàn)采鮮食為主。烏飯葉在提取過程中所含有的多酚類物質(zhì)容易氧化，因此不易保存，其綜合利用引起了很多學(xué)者的關(guān)注。肖珊美以烏飯葉為原料，通過浸漬提取汁液、濃縮、制粒、干燥等方法制得顆粒劑保健品。唐旭東等申請了制備烏飯葉茶的專利，將烏飯樹葉蛋白酶解產(chǎn)物與烏飯樹葉茶粉混合、包裝、殺菌，制得降血壓烏飯樹葉袋泡茶產(chǎn)品。邵京等公開了烏飯葉釀制糯米酒的專利，以烏飯葉和糯米為主要原料，經(jīng)過原料預(yù)處理、烏飯葉提取液制備、滅菌、浸米、 煮制、配制、主發(fā)酵、后發(fā)酵、分離，最后制得產(chǎn)品。譚小丹等用烏飯葉制成的防腐物質(zhì)，不僅可用于食品加工之中，還可以作為天然食品添加劑使用。因此，無論是從藥用價值還是食療保健的角度，烏飯葉研究開發(fā)都具有廣闊的市場應(yīng)用前景，能產(chǎn)生較大的經(jīng)濟效益和社會效益。