張超 曲曉翰 韓立波

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（沈陽110001）

肺癌（lung cancer）是支氣管黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生病變所導(dǎo)致的惡性腫瘤［1］，既是最常見的惡性腫瘤，同時也較難治愈［2］。在中國，肺癌已經(jīng)成為惡性腫瘤致死的最主要原因［3］。由于現(xiàn)代工業(yè)和經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，在吸煙、可吸入顆粒物增加以及巨大社會心理壓力等的作用下，肺癌的發(fā)病率不斷上升［4］。盡管目前我國肺癌男性發(fā)病率高于女性，但近年來由于烹飪油煙等的危害，導(dǎo)致女性發(fā)病率也在逐年攀升［5］。按照不同的組織病理學(xué)特征及生物學(xué)行為，肺癌可分為腺癌、大細(xì)胞癌和鱗癌等類型［6-7］。其中，肺腺癌（lung adenocarcinoma）已經(jīng)成為目前肺癌發(fā)病率較高，同樣也是較難治愈的一種類型。大部分肺腺癌在檢出時就處于中晚期［8］，手術(shù)不能完全治愈，因此患者還需要輔助放化療等其他治療方法。但該病對放化療接受力較差，因此沒有特別有效的治療方法，導(dǎo)致肺腺癌的預(yù)后通常較差［9］。盡管許多學(xué)者對肺腺癌已經(jīng)進(jìn)行了大量的臨床實(shí)驗(yàn)研究，但肺腺癌的發(fā)病機(jī)理仍不明確［10］。因此，尋找該病的發(fā)病原因，探究在該病的發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)胞內(nèi)基因和蛋白的表達(dá)關(guān)系，有望成為預(yù)防和治療肺腺癌的有效途徑，并對今后醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中肺腺癌的研究起到重要促進(jìn)作用［11-12］。近年研究［13-14］發(fā)現(xiàn)HOX 基因在哺乳動物中均有表達(dá)，其含有183 個核苷酸序列并具有嚴(yán)密保守性。大量研究［15-16］表明，HOX 基因在多種腫瘤中都有表達(dá)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與遷移并對DNA 合成和轉(zhuǎn)錄過程起關(guān)鍵的調(diào)控作用。位于染色體7p15-p14 上的HOXA6/7 所編碼的蛋白質(zhì)能識別特定的DNA 序列進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移［17-19］。因此，本文通過TUNEL 法、CCK-8 法、劃痕實(shí)驗(yàn)、Western blot 法及RT-PCR 法分析單純?nèi)朔蜗侔┘?xì)胞株與HOXA-AS3 轉(zhuǎn)染的人肺腺癌細(xì)胞株之間細(xì)胞凋亡、增殖、遷移能力、HOXA6/7 蛋白表達(dá)及HOXA6/7 mRNA 表達(dá)的差異，研究HOXAAS3 通過調(diào)控HOXA6/7 基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞增殖凋亡的作用機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)控制肺腺癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移提供臨床幫助。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞分組與培養(yǎng)將ATCC 細(xì)胞庫購買的人肺腺癌細(xì)胞株在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中與孵育箱中（37 ℃，5%CO2）培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到80% ～90%時，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。經(jīng)800 r/min 離心5 min 后收集細(xì)胞并加入培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重懸細(xì)胞，按13 傳代。待細(xì)胞生長至80%左右，隨機(jī)分為2 組：第1 組為對照組（LA組，單純?nèi)朔蜗侔┘?xì)胞株），第2 組為實(shí)驗(yàn)組（EX組，HOXA-AS3 轉(zhuǎn)染的人肺腺癌細(xì)胞株）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑臺式高速離心機(jī)（德國HETTICH）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國Corning）；酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad）；熒光顯微鏡（日本Olympus）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；PCR 電泳儀（濟(jì)南九宏公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海酶聯(lián)公司）；恒溫?fù)u床（成都蘇凈器材公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將HOXA-AS3 溶于49 μL 無血清培養(yǎng)基中混勻，溫育5 min。將肺腺癌細(xì)胞稀釋至2×105/mL，平鋪到24 孔板中。待肺腺癌細(xì)胞密度生長至70% ～80%時，將稀釋的肺腺癌細(xì)胞加入培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染4 h 左右。隨后棄去上層液體，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2 TUNEL 法檢測肺腺癌細(xì)胞凋亡情況將不同組份的細(xì)胞進(jìn)行低溫低速離心（2 000 r/min，4 ℃）5 min 后，對貼壁細(xì)胞用0.25%不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化后再離心收集并按TUNEL 試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記染色。每張切片隨機(jī)選取視野，使用顯微鏡（SP×400）觀察每個視野的細(xì)胞凋亡數(shù)量。

1.3.3 CCK-8 法檢測肺腺癌細(xì)胞增殖情況配置濃度為5 × 105/mL 的細(xì)胞懸液，分別接種于96 孔板中（100 μL/孔），放入孵育箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h，隨后加入10 μL 的CCK-8 溶液繼續(xù)孵育4 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度（OD值）。

1.3.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測肺腺癌細(xì)胞遷移能力配置200 μL 濃度為5 × 105/mL 的細(xì)胞懸液，加入0.05%胰蛋白酶并置于不含血清的DMEM 培養(yǎng)基中。稀釋至5 × 102個/孔后接種于6 孔板中。等細(xì)胞附著于壁后，用20 μL 槍頭均勻刮劃，并使用PBS（pH 7.4）洗滌3 次。隨后在培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，使用顯微鏡（SP × 100）記錄細(xì)胞運(yùn)動的距離。

1.3.5 Western blot 法檢測肺腺癌細(xì)胞中HOXA6/7 蛋白表達(dá)配置200 μL 濃度為5 × 105/mL 的細(xì)胞懸液，加入0.25%胰蛋白酶后加RIPA裂解液，冰浴，離心，取上層液體。使用SDSPAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加5%脫脂奶粉，密封1 h，用BCA 法檢測蛋白濃度。加入一抗GAPDH（1∶5 000）培育24 h，培育后取出并用PBS（pH 7.4）洗滌，隨后加入二抗（1∶12 000），在室溫、無光的條件下培育1 h。HOXA6/7 蛋白表達(dá)量使用QuantityOne 軟件進(jìn)行分析。

1.3.6 RT-PCR 法檢測肺腺癌細(xì)胞中HOXA6/7 mRNA 表達(dá)在細(xì)胞中加入氯仿，經(jīng)搖蕩、離心，使溶液呈乳白狀。隨后在4 ℃下12 000 r/min 離心并加入異丙醇。再次離心后加75%乙醇。最后離心、干燥并于-80 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄體系使用表1的引物序列，設(shè)計(jì)為94 ℃處理10 min，94 ℃處理15 s，60 ℃處理34 s，72 ℃處理30 s 以及72 ℃處理10 min，重復(fù)40 次并計(jì)算HOXA6/7 mRNA 表達(dá)量。

PCR 反應(yīng)結(jié)束后，配置2%瓊脂糖凝膠，避光放置1 h，然后依次向每孔中加入各個PCR 產(chǎn)物5 μL，在180 V 電壓下電泳，使溴酚藍(lán)與起始點(diǎn)完全分開后結(jié)束電泳，將凝膠放置在成像儀下觀察并采集凝膠電泳數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 22.0 軟件分析LA組、EX 組之間肺腺癌細(xì)胞凋亡、增殖、遷移能力、HOXA6/7 蛋白表達(dá)及HOXA6/7 mRNA 表達(dá)的差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL 法檢測肺腺癌細(xì)胞凋亡情況經(jīng)TUNEL 染色，LA 組肺腺癌細(xì)胞凋亡較多、分布明顯稀疏，EX 組肺腺癌細(xì)胞凋亡數(shù)量較少、細(xì)胞凋亡率明顯下降（P＜0.05）。見圖1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.2 CCK-8 法檢測肺腺癌細(xì)胞增殖情況組間比較表明LA 組和EX 組之間的OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EX 組肺腺癌細(xì)胞的增殖數(shù)量較多，LA 組肺腺癌細(xì)胞的增殖數(shù)量較少，EX 組肺腺癌細(xì)胞的增殖明顯高于LA 組（P＜0.05），見圖2。

圖1 兩組肺腺癌細(xì)胞凋亡情況（SP，×400）Fig.1 Apoptosis of lung adenocarcinoma cells in two groups（SP，×400）

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測肺腺癌細(xì)胞遷移能力細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測肺腺癌細(xì)胞水平運(yùn)動遷移能力的結(jié)果如圖3所示，各組劃痕24 h 后，LA 組肺腺癌細(xì)胞穿過Trangwell 小室的細(xì)胞數(shù)為（137.8 ±17.5），顯示較寬無細(xì)胞區(qū)域，EX 組肺腺癌細(xì)胞穿過Trangwell 小室的細(xì)胞數(shù)為（39.2 ± 14.3），顯示較窄無細(xì)胞區(qū)域，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 Western blot 法檢測肺腺癌細(xì)胞中HOXA6/7蛋白表達(dá)使用Western blot 法對LA 組、EX 組肺腺癌細(xì)胞內(nèi)HOXA6/7 蛋白的免疫印跡檢測表明，LA 組的HOXA6/7 蛋白表達(dá)含量較低而EX 組的HOXA6/7 蛋白含量明顯升高（均P＜0.05），見圖4。HOXA6/7 的蛋白表達(dá)水平與腫瘤T 分期（P=0.028）、腫瘤臨床分級（P= 0.029）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P= 0.012）均呈正相關(guān)，且肺腺癌細(xì)胞內(nèi)的HOXA6/7 表達(dá)明顯高于正常值時。

圖2 兩組肺腺癌細(xì)胞增殖情況Fig.2 Proliferation of lung adenocarcinoma cells in two groups

2.5 RT-PCR 法檢測肺腺癌細(xì)胞中HOXA6/7 mRNA 表達(dá)RT-PCR 法檢測肺腺癌細(xì)胞中HOXA6/7 mRNA 表達(dá)量的結(jié)果表明，LA 組肺腺癌細(xì)胞內(nèi)的HOXA6/7 mRNA 表達(dá)量較低，EX 組肺腺癌細(xì)胞內(nèi)的HOXA6/7 mRNA 表達(dá)量明顯升高（均P＜0.05），見圖5。HOXA6/7 蛋白主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)且在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常肺組織，表明HOXA6/7 在肺腺癌組織中的異常高表達(dá)狀態(tài)可能與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，可參與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)。

圖3 兩組肺腺癌細(xì)胞的遷移能力（SP，×100）Fig.3 Migration ability of two groups of lung adenocarcinoma cells（SP，×100）

3 討論

圖4 兩組肺腺癌細(xì)胞內(nèi)的HOXA6/7 蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of HOXA6/7 protein of lung adenocarcinoma cells in two groups

圖5 兩組肺腺癌細(xì)胞內(nèi)的HOXA6/7 mRNA 表達(dá)Fig.5 Expression of HOXA6/7 mRNA of lung adenocarcinoma cells in two groups

HOX 基因家族在胚胎發(fā)育以及癌癥的發(fā)生發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用［20］，作為一種嵌入HOX 基因簇的長鏈非編碼RNA，越來越多的研究表明HOXA-AS3 可能與多種腫瘤的進(jìn)展相關(guān)。WU 等［21］通過高通量測序篩選出HOXA-AS3 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量顯著上調(diào)，并探討了其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物行為學(xué)功能的影響從而開啟了HOXA-AS3 在實(shí)體腫瘤中的研究序幕。很快，有學(xué)者證實(shí)HOXA-AS3 參與了肝細(xì)胞癌［22］、胰腺癌［23］、口腔癌［24］的發(fā)生發(fā)展。在非小細(xì)胞肺癌領(lǐng)域，有研究表明HOXA-AS3 在腫瘤組織及細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于癌旁組織及正常支氣管上皮細(xì)胞，但其對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的調(diào)控及具體機(jī)制尚不明確。

本研究通過TUNEL 實(shí)驗(yàn)、CCK-8 實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)HOXA-AS3 可顯著抑制肺腺癌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其增殖與遷移能力。作為非編碼RNA 中的一種反義轉(zhuǎn)錄本，HOXA-AS3 可通過與相鄰基因的mRNA 形成雙鏈RNA 進(jìn)而保護(hù)相鄰基因mRNA 免受核糖核酸酶的降解，增強(qiáng)其穩(wěn)定性［25-26］。前期有研究表明在腫瘤組織中HOXA-AS3的表達(dá)與其臨近編碼基因HOXA6/7 mRNA 表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。筆者在肺腺癌細(xì)胞中上調(diào)HOXA-AS3，發(fā)現(xiàn)HOXA6/7 基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平隨之升高。這些結(jié)果表明HOXA-AS3 對肺腺癌細(xì)胞生物行為學(xué)的影響是通過調(diào)控HOXA6/7來實(shí)現(xiàn)的。但HOXA-AS3 對HOXA6/7 的調(diào)控機(jī)制目前尚未完全闡明，是否也是基于與HOXA6/7 mRNA 形成雙鏈并增強(qiáng)其穩(wěn)定性，這些將是筆者下一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述，本研究表明lncRNA HOXA-AS3 可以通過調(diào)節(jié)HOXA6/7 進(jìn)而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。對其分子機(jī)制的深入研究可能給我們提供了一個治療肺腺癌的潛在靶點(diǎn)，進(jìn)而為控制肺腺癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移提供臨床幫助。