孟 乾，張志勇，張志偉，張曹進(jìn)，陳淑吟，祝 斐，賈超峰，曹廣勇

( 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇省海水魚類遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南通 226007 )

在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中，編碼同一種氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼子，而不同基因在蛋白質(zhì)編碼過(guò)程中會(huì)傾向于使用一些特定的同義密碼子，叫作同義密碼子的使用偏性，不同物種及不同功能基因的密碼子使用偏性均存在差異[1-5]。線粒體DNA(mtDNA)具有進(jìn)化速率快、核苷酸替代率高及母性遺傳等特點(diǎn)，已成為魚類進(jìn)化、鑒定及種質(zhì)遺傳等研究的重要遺傳分子標(biāo)記，mtDNA的密碼子偏性研究有助于推進(jìn)魚類的鑒定、發(fā)育及遺傳育種等研究。

斑石鯛(Oplegnathuspunctatus)和條石鯛(O.fasciatus)均屬鱸形目、石鯛科、石鯛屬，在我國(guó)沿海均有分布，且具有美觀、營(yíng)養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)快及抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，具有較高的觀賞與經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)具有發(fā)展前景[6-9]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)條石鯛和斑石鯛的研究主要集中在選擇育種、人工繁殖技術(shù)、病害及分類等方面[7-15]，而在mtDNA水平研究較少。孫鵬等[16]以mtCOX1和Cytb片段探討了條石鯛野生種群多樣性。此外，斑石鯛和條石鯛間已實(shí)現(xiàn)人工雜交，二者在基于mtCOX1、Cytb基因和D-loop序列片段的遺傳差異比較中顯示親緣關(guān)系較近[17-18]。筆者以斑石鯛和條石鯛mtDNA編碼蛋白基因序列為研究對(duì)象進(jìn)行密碼子偏好性分析，并與斑馬魚(Daniorerio)、金鼓魚(Scatophagusargus)、黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)和真鯛(Pagrosomusmajor)mtDNA編碼蛋白質(zhì)的基因序列進(jìn)行比對(duì)和密碼子偏好性聚類分析，探討石鯛科與其他物種間的親緣關(guān)系，以期為探討兩者間的近緣雜交育種、種質(zhì)資源等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列材料

本研究所用斑石鯛、條石鯛、斑馬魚、金鼓魚、黑鯛和真鯛的線粒體基因組基因序列均來(lái)源于美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(表1)。

表1 斑石鯛、條石鯛及其他物種的登錄號(hào)

1.2 密碼子分析指標(biāo)和方法

相對(duì)密碼子使用度，是指對(duì)于某一特定的密碼子在編碼對(duì)應(yīng)氨基酸的同義密碼子間的相對(duì)概率，可直觀地反映密碼子使用的偏好性。當(dāng)某一密碼子相對(duì)密碼子使用度=1，代表該密碼子的使用沒(méi)有偏好性；相對(duì)密碼子使用度>1時(shí)，表明該密碼子為使用相對(duì)較多的密碼子，反之亦然。第i個(gè)氨基酸的第j個(gè)密碼子的相對(duì)密碼子使用度(RSCUij)的計(jì)算公式[3]如下：

式中,xij是編碼第i個(gè)氨基酸的第j個(gè)密碼子的出現(xiàn)次數(shù)，ni是編碼第i個(gè)氨基酸的同義密碼子的數(shù)量(值為1～6)。

用CodonW對(duì)斑石鯛和條石鯛mtDNA中編碼蛋白基因序列分別進(jìn)行分析,得出每條序列中各密碼子的相對(duì)密碼子使用度以及密碼子的第3位堿基中A、U、G、C的含量在第3位堿基總量中所占的比率(分別為A3s、U3s、G3s、C3s)；用Microsoft Excel 2006統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

1.3 因子相關(guān)性及聚類分析

將各密碼子含量以標(biāo)準(zhǔn)得分存為變量作為橫軸，相對(duì)密碼子使用度值以1為原點(diǎn)作為縱軸，以Microsoft Excel 2006作散點(diǎn)圖；每個(gè)物種的mtDNA編碼蛋白質(zhì)的基因作為一個(gè)對(duì)象，將密碼子的相對(duì)密碼子使用度作為變量，以偏好性密碼子的相對(duì)密碼子使用度(大于1)對(duì)基因的密碼子使用偏好性進(jìn)行聚類分析；去除斑石鯛等6個(gè)物種的mtDNA的ATP8、ND3和ND4L(序列長(zhǎng)度較短)，每個(gè)基因(ND1、ND2、COX1、COX2、ATP6、COX3、ND6、ND4、ND5、Cytb)各自看成一類并以Mega 5.1進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑石鯛與條石鯛mtDNA編碼蛋白質(zhì)基因的密碼子偏好性

斑石鯛和條石鯛的mtDNA編碼蛋白基因中的C3s分別為31.21%和35.86%，均大于A3s、U3s、G3s(表2)，可見(jiàn)斑石鯛和條石鯛的mtDNA編碼蛋白基因偏愛(ài)使用以C堿基結(jié)尾密碼子，避免使用以G結(jié)尾密碼子。

表2 斑石鯛和條石鯛mtDNA編碼蛋白質(zhì)基因密碼子的A3s、U3s、G3s、C3s %

斑石鯛以UUC、ACC等30個(gè)密碼子的相對(duì)密碼子使用度均大于1(表3)，為斑石鯛mtDNA編碼蛋白基因的偏好性密碼子，條石鯛比斑石鯛的mtDNA編碼蛋白基因的偏好性密碼子少2個(gè)(CCA和GUC)，其中尤其偏愛(ài)使用以C結(jié)尾的密碼子(斑石鯛除AUC外,條石鯛除AUC和GUC外，其余的均為偏好性密碼子)，其次偏愛(ài)以A結(jié)尾的密碼子(特別是CGA，其相對(duì)密碼子使用度分別為2.96和3.32)；盡量避免使用以G結(jié)尾的密碼子(除斑石鯛CGG的相對(duì)密碼子使用度值為0.86，其余相對(duì)密碼子使用度均小于0.5)。

表3 斑石鯛和條石鯛線粒體編碼蛋白基因序列偏好密碼子的相對(duì)密碼子使用度

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

依據(jù)密碼子編碼氨基酸原理進(jìn)行計(jì)算，斑石鯛和條石鯛線粒體中的各種氨基酸含量基本一致，含量較高的4種氨基酸依次為亮氨酸>異亮氨酸>丙氨酸>蘇氨酸，其中除異亮氨酸偏好密碼子為AUU，其余3種氨基酸的偏好密碼子也均以AC結(jié)尾(圖1)。

圖1 斑石鯛和條石鯛各種氨基酸含量

2.2 因子相關(guān)性分析

斑石鯛與條石鯛線粒體編碼蛋白序列因子相關(guān)性分析x、y兩軸的分析結(jié)果表明，該2種魚線粒體編碼蛋白序列中，AC結(jié)尾的密碼子與GU結(jié)尾的密碼子明顯分開，距離中心較近的AC結(jié)尾與GU結(jié)尾密碼子比例相近，但A、C含量相對(duì)較高(圖2)，表明該2種魚較偏好使用AC結(jié)尾的密碼子。

圖2 斑石鯛和條石鯛線粒體編碼蛋白序列的因子相關(guān)性分析

2.3 偏好性密碼子及基因序列的聚類分析

在對(duì)基因密碼子使用概率進(jìn)行聚類分析的過(guò)程中，將每個(gè)物種的mtDNA編碼蛋白質(zhì)的基因作為一個(gè)對(duì)象，將密碼子的相對(duì)密碼子使用度作為變量。除去相對(duì)密碼子使用度始終為1的編碼色氨酸和甲硫氨酸的密碼子UGG和AUG,再除去3個(gè)不編碼氨基酸的終止密碼子，取余下的59個(gè)中偏好性密碼子的相對(duì)密碼子使用度(大于1)對(duì)基因的密碼子使用偏好性進(jìn)行聚類分析。

聚類結(jié)果見(jiàn)圖3，大致分為2類：斑石鯛與條石鯛首先聚類，然后與金鼓魚聚為一類；金鼓魚和黑鯛首先聚為一類，說(shuō)明它們的密碼子使用的偏好性相似。此外，斑石鯛與金鼓魚幼魚階段形態(tài)相似：金鼓魚體黃褐色，體扁、吻短，散布許多黑圓斑，腹部銀白；斑石鯛體色較淡呈灰褐色，各鰭暗色，頭部、體側(cè)、胸鰭及各奇鰭基部密布許多黑斑(圖4)。

圖4 斑石鯛和金鼓魚外形

圖3 斑石鯛、條石鯛與其他物種的mtDNA編碼蛋白質(zhì)的基因密碼子偏好性聚類

將所研究的6個(gè)物種的每個(gè)mtDNA編碼蛋白質(zhì)的每個(gè)基因(ND1、ND2、COX1、COX2、ATP6、COX3、ND6、ND4、ND5、Cytb)各自看成一類，對(duì)每個(gè)基因序列進(jìn)行聚類分析。其結(jié)果為斑石鯛和條石鯛均首先聚為一類，它們的距離相對(duì)較近；斑石鯛、條石鯛2種魚在ATP6、ND2、COX1、ND5中首先聚類后，其次與金鼓魚聚為一類，這與密碼子偏好性聚類結(jié)果一致(圖5)。

圖5 最大似然法對(duì)斑石鯛、條石鯛及其他物種mtDNA編碼蛋白基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹

3 討 論

3.1 密碼子偏好性分析

基因是生物遺傳信息的載體，蛋白質(zhì)是發(fā)揮生物功能的主要分子。密碼子是聯(lián)系兩者的元件，記錄了長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中物種內(nèi)在的功能適應(yīng)性變化，其使用情況必然具有重要的生物學(xué)意義。斑石鯛和條石鯛mtDNA編碼蛋白的序列偏好使用以AC結(jié)尾的密碼子，最高使用頻率的密碼子是CGA(相對(duì)密碼子使用度分別為2.96和3.32)，其次是AAA(1.97和1.89) ，但總體而言以C結(jié)尾比A結(jié)尾密碼子偏好性略高，這與分析金魚(Carassiusauratus)[19]轉(zhuǎn)錄組偏好使用GC結(jié)尾密碼子分析結(jié)果存在差異，說(shuō)明物種密碼子使用在進(jìn)化過(guò)程中存在保守性，相近物種的密碼子使用偏好性相似，反之則密碼子的使用存在差異。斑石鯛和條石鯛mtDNA以G結(jié)尾密碼子避免使用，且與其線粒體COX1、Cyt b和D-loop 3種片段上組成分布一致[18]。以密碼子編碼氨基酸的原理計(jì)算，理論上亮氨酸的氨基酸含量最高，且含量較高的亮氨酸(CUA、CUC、CUU)、異亮氨酸 (AUU)、蘇氨酸(ACC、ACA)及丙氨酸(GCC、GCA)4種氨基酸均偏愛(ài)相同的密碼子，表明不同氨基酸組成也一定程度影響密碼子使用。

3.2 聚類分析

宋喬喬等[20]對(duì)牛亞科動(dòng)物線粒體基因密碼子偏好性進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)基于密碼子偏好性差異可以揭示物種間的親緣關(guān)系，可用于物種的分類研究。不同物種的密碼子偏好性差異與其親緣關(guān)系也密切相關(guān)，密碼子偏好性差異小，則親緣關(guān)系近；反之，親緣關(guān)系遠(yuǎn)[21]。Duan等[22]比較了14種鲌亞科魚類密碼子偏好性的差異，發(fā)現(xiàn)屬間物種的密碼子偏好性是具有物種特異性，主要是受到進(jìn)化過(guò)程中的突變與自然選擇的影響?；蛲蛔兙哂械皖l性，故近緣物種密碼子在使用偏好性上總體相似，又有輕微差別。在本研究中，密碼子偏好性的聚類分析和基因序列的進(jìn)化分析結(jié)果顯示,密碼子偏好性的聚類分析中斑石鯛和條石鯛聚為一類；基因序列的進(jìn)化分析結(jié)果也顯示，黑鯛與真鯛在ATP6、ND2、Cytb、ND1、ND4、ND5、ND6聚為一類，表明斑石鯛與條石鯛、黑鯛與真鯛親緣關(guān)系較近，這與傳統(tǒng)分類學(xué)一致。斑石鯛、條石鯛與斑馬魚在基因序列(除ND4)及偏好密碼子聚類中均遺傳距離最遠(yuǎn)，說(shuō)明石鯛科與斑馬魚在進(jìn)化過(guò)程中親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。斑石鯛、條石鯛2種魚在密碼子偏好性聚類中首先聚為一類后，其次與金鼓魚聚為一類；基因序列的分析結(jié)果也顯示，在ATP6、ND2、COX1、ND5上存在相同結(jié)論，且金鼓魚和斑石鯛在幼魚階段外觀相似，表明石鯛科與金鼓魚親緣關(guān)系較近，與傳統(tǒng)分類學(xué)存在一定差異。密碼子偏好聚類中，黑鯛與金鼓魚先聚為一類，后與真鯛聚為一類，體現(xiàn)了金鼓魚較真鯛與黑鯛親緣關(guān)系更近，這與發(fā)育進(jìn)化樹及傳統(tǒng)分類學(xué)[23]存在較大分歧。Christianson[24]認(rèn)為，基于密碼子的偏好性進(jìn)行聚類，其結(jié)果與真實(shí)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不一定完全一致，這一指標(biāo)在較小的分類單元里比較可靠，但是在分歧較大的分類單元里，這一方法主要還是作為傳統(tǒng)系統(tǒng)樹構(gòu)建方法的補(bǔ)充和參考。

3.3 研究意義

不同物種密碼子偏好性差異，產(chǎn)生原因可能是各物種生存環(huán)境不同，承受壓力不同，導(dǎo)致突變和選擇在物種之間程度有差異[25-26]，此外，基因序列長(zhǎng)度[27-28]、編碼區(qū)GC含量[29]、翻譯效率[30]和編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[31]等均可引起密碼子使用偏性，至于這些因素具體如何影響同義密碼子偏好性仍有待進(jìn)一步研究。同時(shí)有研究表明，密碼子的使用偏性與基因的表達(dá)強(qiáng)弱有關(guān)，高效表達(dá)的基因所使用的密碼子同低表達(dá)的基因相比較，它們具有明顯不同的基因使用頻率，高效表達(dá)的基因在密碼子使用上比非高效基因更有偏向性趨勢(shì)，它們通常使用一套偏好性同義密碼子，同時(shí)發(fā)生偏好性使用的密碼子還對(duì)應(yīng)著含量最豐富的tRNA，提高翻譯效率[31-33]。通過(guò)優(yōu)化與改造密碼子，可促進(jìn)翻譯效率及提高生物中外源基因的表達(dá)，如斑石鯛偏好密碼子的基因作為外源基因，可以不經(jīng)密碼子優(yōu)化，在條石鯛中獲得高效表達(dá)；若依據(jù)斑石鯛的密碼子偏好性信息進(jìn)行密碼子改造，可提高以斑石鯛偏好密碼子的外源基因在其他模式生物中的表達(dá)效率。對(duì)于今后石鯛科魚類轉(zhuǎn)基因過(guò)程中對(duì)構(gòu)建合適的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)具有重要的指導(dǎo)意義，從而提高特定蛋白的表達(dá)量，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因育種的效果。

同時(shí)，研究密碼子偏好性還有很多的意義。研究密碼子使用偏好性有利于改善靶基因在受體表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效果，通過(guò)對(duì)密碼子進(jìn)行改造優(yōu)化已經(jīng)成為提高外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)效率最有效且成功的途徑之一；通過(guò)對(duì)密碼子偏好性形成的主要因素探究，對(duì)于進(jìn)一步了解生物基因或基因組特征、分子進(jìn)化壓力及生態(tài)適應(yīng)等均具有重要啟示；還有許多其他方面的意義，如鑒定基因的表達(dá)水平高低，判斷是否發(fā)生基因重組，發(fā)現(xiàn)新基因等[34-36]。

4 結(jié) 論

本研究利用分析密碼子偏好性及聚類分析等生物信息學(xué)方法，在mtDNA水平上對(duì)斑石鯛和條石鯛編碼蛋白序列的密碼子使用特征進(jìn)行分析，明確了這2種魚的mtDNA密碼子偏好性，并比較與其他魚類密碼子使用偏好性差異。本研究結(jié)果可為探討斑石鯛和條石鯛新基因預(yù)測(cè)、功能基因組學(xué)與其他水生動(dòng)物在進(jìn)化中親緣關(guān)系等研究提供理論基礎(chǔ)。