茍萬里，李自英，武心華，文雙喜，楊 智

( 1.貴陽學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005； 2.青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)股份有限公司，山東 青島 266000 )

近些年來，集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展迅速，其高密度、高投餌的養(yǎng)殖方式在水體中累積了大量含氮排泄物和殘餌[1]，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體的富營(yíng)養(yǎng)化程度嚴(yán)重，尤其是養(yǎng)殖中后期，水體中的氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮含量普遍偏高甚至超標(biāo)[2]，給養(yǎng)殖動(dòng)物帶來潛在危害[3-4]。據(jù)研究，亞硝態(tài)氮作用于水生動(dòng)物體內(nèi)的血紅蛋白或銅藍(lán)蛋白、溶氧酶和抗氧化酶，影響水產(chǎn)動(dòng)物的血液載氧功能和免疫功能，水產(chǎn)動(dòng)物長(zhǎng)期處于亞硝態(tài)氮超標(biāo)的水體會(huì)出現(xiàn)“游塘”、“浮頭”、“偷死”、“冒底”等現(xiàn)象[5]。氨氮在高pH時(shí)以分子氨為主，分子氨影響魚類正常生理活動(dòng)，易造成暴發(fā)性出血病的流行[6]；影響蝦類生長(zhǎng)和變態(tài)，破壞血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，使鰓上皮細(xì)胞溶解、角質(zhì)層受損，鰓腔內(nèi)出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象等[7]。因此，如何控制池塘水體中的亞硝態(tài)氮和氨氮含量使之處于安全范圍之內(nèi)是高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境管理上的重要問題[8-9]。

微藻是池塘養(yǎng)殖中必不可少的低等植物，是水體的初級(jí)生產(chǎn)者和優(yōu)質(zhì)生物餌料，也能吸收利用各種形式的無機(jī)氮而起到凈化水體的作用[10]。研究表明，當(dāng)以氨氮、亞硝態(tài)氮或硝態(tài)氮為唯一氮源時(shí)，各類微藻對(duì)相應(yīng)的無機(jī)氮均具有良好的凈化能力[11-13]。當(dāng)培養(yǎng)體系中同時(shí)存在氨氮和硝態(tài)氮時(shí)，大多數(shù)微藻尤其是藍(lán)綠藻優(yōu)先凈化氨氮[14-15]；在總氮充足的條件下，水體中超過1 μmol/L的氨氮會(huì)抑制微藻對(duì)硝態(tài)氮的凈化，且其抑制程度受藻種、光照度、總氮量等因素的影響[16-18]。當(dāng)水體中同時(shí)存在硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮時(shí)，通常認(rèn)為硝態(tài)氮會(huì)抑制亞硝態(tài)氮的凈化[19]。當(dāng)水體中同時(shí)存在氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮時(shí)，有關(guān)微藻對(duì)這3類氮源凈化規(guī)律的報(bào)道不多，目前僅見以養(yǎng)殖魚、蝦的水為培養(yǎng)基的報(bào)道[20-22]，這種培養(yǎng)基除了含有上述3種無機(jī)氮外，還含有一定量的有機(jī)氮。目前，尚未見關(guān)于微藻在僅以氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮為氮源的水體中生長(zhǎng)時(shí)對(duì)這3種無機(jī)氮的凈化規(guī)律的研究報(bào)道。

為進(jìn)一步研究微藻對(duì)3種無機(jī)氮源的凈化規(guī)律，同時(shí)考慮到氨氮和亞硝態(tài)氮在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中的潛在危害，筆者在實(shí)驗(yàn)室條件下，以添加了少量氨氮和亞硝態(tài)氮且不含有機(jī)氮源的改良F/2培養(yǎng)基培養(yǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的6種餌料微藻，分析不同微藻培養(yǎng)液中亞硝態(tài)氮和氨氮含量的變化趨勢(shì)，研究微藻在混合無機(jī)氮源下凈化氨氮和亞硝態(tài)氮的優(yōu)先順序，以期為利用微藻控制水體亞硝態(tài)氮和氨氮含量提供參考依據(jù)，同時(shí)篩選出能快速凈化亞硝態(tài)氮和氨氮的候選藻種。

1 材料與方法

1.1 藻種及其培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用的柵藻(Scenedesmussp.)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、小新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)、塔胞藻(Pyramimonassp.)由中國(guó)海洋大學(xué)藻種庫(kù)引進(jìn)，在本試驗(yàn)中的編號(hào)依次為KDN7、KDN13、KDN18、KDN20、KDN21。一株由筆者分離的硅藻，根據(jù)形態(tài)初步鑒定為雙眉藻屬(Amphorasp.)，其編號(hào)為KDN17，顯微鏡下的形態(tài)見圖1。

圖1 雙眉藻KDN17的顯微照片(×400)

以F/2培養(yǎng)基[23]擴(kuò)繁各株綠藻，以添加了50 mg/L NaSiO3·9H2O(分析純)的F/2培養(yǎng)基擴(kuò)繁各株硅藻。其他試驗(yàn)所用培養(yǎng)基均去掉擴(kuò)繁用培養(yǎng)基中的維生素，其余成分保持不變，同時(shí)添加一定量分析純級(jí)的硫酸銨、亞硝酸鈉以提供氨氮和亞硝態(tài)氮。所用水均為蒸餾水。

1.2 藻類的擴(kuò)繁

將上述各藻種的儲(chǔ)備培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接在新鮮無菌的培養(yǎng)基中，于溫度25 ℃、光照度12 000 lx、光照周期14 L∶10 D、早晚各搖瓶1次的條件下培養(yǎng)4～5 d，經(jīng)檢查達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，再轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基中，如此反復(fù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2～3次，用生長(zhǎng)旺盛并處于對(duì)數(shù)期的藻液做后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 混合氮源下微藻的生長(zhǎng)及其對(duì)氨氮、亞硝態(tài)氮的凈化

以擴(kuò)增繁殖用的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，向其中加入一定量的(NH4)2SO4和NaNO2，使培養(yǎng)基中的氨氮質(zhì)量濃度為2.0 mg/L，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度為1.0 mg/L。取1.2中擴(kuò)增繁殖至對(duì)數(shù)期的新鮮藻液30 mL于8000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液，用新配制的培養(yǎng)基懸浮沉淀，于同樣條件下離心，再用30 mL新配制的培養(yǎng)基懸浮沉淀，取懸浮藻液接種入新鮮培養(yǎng)基中。每個(gè)藻株做3個(gè)平行，每個(gè)平行的培養(yǎng)體積為3000 mL，盛于滅菌過的5000 mL帶塞錐形瓶中，接種后立即取藻液20 mL，檢測(cè)初始氨氮、亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度及初始藻細(xì)胞密度，之后每日于光照結(jié)束時(shí)搖勻后取適量藻液(第1～2 d取50 mL藻液，第3～6 d取100 mL藻液)，檢測(cè)其中的氨氮、亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度和藻細(xì)胞密度，按下式計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)：

1.4 相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法

氨氮的檢測(cè)采用靛酚藍(lán)比色法[24]；亞硝態(tài)氮含量的檢測(cè)采用鹽酸萘乙二胺比色法[25]；藻細(xì)胞密度采用血球計(jì)數(shù)板顯微直接計(jì)數(shù)法[26]。

1.5 各指標(biāo)變化趨勢(shì)圖繪制

采用Origin 8.5繪圖，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以藻細(xì)胞密度、氨氮質(zhì)量濃度、亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，獲得各株微藻的生長(zhǎng)曲線以及在培養(yǎng)過程中各藻株培養(yǎng)液中氨氮質(zhì)量濃度和亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化趨勢(shì)圖。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以每日的氨氮相對(duì)凈化率、亞硝態(tài)氮相對(duì)凈化率為橫坐標(biāo)獲得各藻株對(duì)氨氮、亞硝態(tài)氮凈化情況的柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合無機(jī)氮源下各株藻的生長(zhǎng)情況及其培養(yǎng)液中氨氮、亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)

2.1.1 柵藻KDN7

柵藻KDN7藻細(xì)胞密度在第0～3 d先升后降，但變化幅度不大，此階段的相對(duì)生長(zhǎng)速率為0.155(遲滯期)；第3～5 d細(xì)胞密度由4.10×104個(gè)/L快速增至3.52×105個(gè)/L，相對(duì)生長(zhǎng)速率為1.075(對(duì)數(shù)期)；第6 d由3.52×105個(gè)/L降至2.69×105個(gè)/L，相對(duì)生長(zhǎng)速率為-0.134(衰亡期)?？梢姡麄€(gè)培養(yǎng)期該藻經(jīng)歷了一個(gè)相對(duì)完整的生長(zhǎng)周期，細(xì)胞生長(zhǎng)充分(圖2a)。

由亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度趨勢(shì)線(圖2b)可知，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度先略微上升然后較快下降；第0～2 d，由1.000 mg/L升至1.033 mg/L，相對(duì)凈化速率為-0.016 mg/(L·d)，即每日產(chǎn)生亞硝態(tài)氮0.016 mg/L；第2～6 d，由1.033 mg/L降至0.692 mg/L，相對(duì)凈化速率為0.085 mg/(L·d)。

由氨氮質(zhì)量濃度的趨勢(shì)線(圖2c)可知，氨氮質(zhì)量濃度呈先降后升趨勢(shì)。第0～2 d，由1.999 mg/L降至0.086 mg/L，氨氮相對(duì)凈化速率為0.957 mg/(L·d)；第2～6 d，由0.086 mg/L迅速升至0.980 mg/L，相對(duì)凈化速率為-1.217 mg/(L·d)，即每日產(chǎn)生1.217 mg/L氨氮。

圖2 柵藻KDN7培養(yǎng)液中細(xì)胞密度(a)、亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度(b)、氨氮質(zhì)量濃度(c)的變化情況

比較氨氮質(zhì)量濃度和亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度趨勢(shì)線可知，在氨氮質(zhì)量濃度快速下降階段(即第0～2 d)，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度輕微上升；在亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度較快下降階段(即第3～6 d)，氨氮質(zhì)量濃度卻以較快的速度升高。

2.1.2 三角褐指藻KDN13

三角褐指藻KDN13在接種后即迅速生長(zhǎng)，細(xì)胞密度在第0～4 d由8.30×104個(gè)/L快速增至2.62×106個(gè)/L，相對(duì)生長(zhǎng)速率為0.863(對(duì)數(shù)期)；第4～6 d，細(xì)胞密度略下降后又明顯增加，相對(duì)生長(zhǎng)速率為0.193(穩(wěn)定期)(圖3a)?？梢娬麄€(gè)培養(yǎng)期該藻經(jīng)歷了一個(gè)相對(duì)完整的生長(zhǎng)周期，細(xì)胞生長(zhǎng)充分。

由亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度趨勢(shì)線(圖3b)可知，第0～3 d，由1.000 mg/L升至1.051 mg/L，相對(duì)凈化速率為-0.025 mg/(L·d)，即平均每日產(chǎn)生亞硝態(tài)氮0.025 mg/L；第3～6 d，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度小幅波動(dòng)，相對(duì)凈化速率為0.004 mg/(L·d)。

由氨氮質(zhì)量濃度趨勢(shì)線(圖3c)可知,氨氮質(zhì)量濃度呈先快速降低后緩慢升高的趨勢(shì)；第0～3 d，由2.003 mg/L降至0.013 mg/L，相對(duì)凈化速率為0.663 mg/(L·d)；第3～6 d，由0.013 mg/L緩慢升至0.068 mg/L，相對(duì)凈化速率為0.018 mg/(L·d)。

圖3 三角褐指藻KDN13培養(yǎng)液中細(xì)胞密度(a)、亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度(b)、氨氮質(zhì)量濃度(c)的變化情況

比較氨氮質(zhì)量濃度和亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的趨勢(shì)線可知，三角褐指藻KDN13在其生長(zhǎng)周期的前半段(第0～3 d)，氨氮質(zhì)量濃度快速下降，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度緩慢上升；在其生長(zhǎng)周期的后半段(4～6 d)，亞硝態(tài)氮濃度小幅波動(dòng)，氨氮質(zhì)量濃度則小幅緩慢上升。

2.1.3 雙眉藻KDN17

雙眉藻KDN17細(xì)胞密度在第0～2 d由2.30×104個(gè)/L增至7.80×104個(gè)/L，相對(duì)生長(zhǎng)速率為0.28(遲滯期)；第2～5 d細(xì)胞度密度由7.80×104個(gè)/L快速增至4.50×106個(gè)/L，相對(duì)生長(zhǎng)速率為2.028(對(duì)數(shù)期)；培養(yǎng)期最后的生長(zhǎng)速率為0.265(穩(wěn)定期)(圖4a)。可見雙眉藻在培養(yǎng)期經(jīng)歷了一個(gè)相對(duì)完整的生長(zhǎng)周期，細(xì)胞生長(zhǎng)充分。

由亞硝態(tài)氮和氨氮質(zhì)量濃度變化情況(圖4b～c)可知，第0～2 d，亞硝態(tài)氮和氨氮的質(zhì)量濃度均快速下降，分別由1.002 mg/L和1.999 mg/L降至0.358 mg/L和0.081 mg/L，兩者的相對(duì)凈化速率分別為0.322 mg/(L·d)和0.959 mg/(L·d)；第2～6 d，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度先升至0.388 mg/L后降至0.305 mg/L，而氨氮質(zhì)量濃度則由0.081 mg/L緩慢降至0.049 mg/L，此階段兩者的相對(duì)凈化速率分別為0.013 mg/(L·d)和0.008 mg/(L·d)。

圖4 雙眉藻KDN17培養(yǎng)液中細(xì)胞密度(a)、亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度(b)、氨氮質(zhì)量濃度(c)的變化情況

2.1.4 小新月菱形藻KDN18

小新月菱形藻KDN18細(xì)胞密度在第0～4 d由7.60×104個(gè)/L迅速增至2.504×106個(gè)/L，相對(duì)生長(zhǎng)速率為0.874(對(duì)數(shù)期)；第4～6 d細(xì)胞密度由2.50×106個(gè)/L緩慢增加至2.96×106個(gè)/L，相對(duì)生長(zhǎng)速率為0.041(穩(wěn)定期)(圖5a)。

由亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的趨勢(shì)線(圖5b)可知，接種后第0～1 d，由0.998 mg/L輕微降至0.963 mg/L；第2～6 d由0.963 mg/L緩慢升至1.098 mg/L，相對(duì)凈化速率為-0.027 mg/(L·d)，即每日產(chǎn)生0.027 mg/L的亞硝態(tài)氮。

由氨氮質(zhì)量濃度變化情況(圖5c)可知，氨氮質(zhì)量濃度在第0～3 d由2.001 mg/L快速降至0.086mg/L，相對(duì)凈化速率為0.958 mg/(L·d)；在第2～4 d呈先降后緩慢上升趨勢(shì)，相對(duì)凈化速率為-0.009 mg/(L·d)，即每日產(chǎn)生氨氮0.009 mg/L。

圖5 小新月菱形藻KDN18培養(yǎng)液中細(xì)胞密度(a)、亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度(b)、氨氮質(zhì)量濃度(c)的變化情況

在氨氮快速下降的階段(第0～2 d)，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度先略降后略升；在亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度緩慢上升階段(第2～6 d)，氨氮質(zhì)量濃度也緩慢上升，但兩者上升的幅度均很小。

2.1.5 亞心形扁藻KDN20

亞心形扁藻KDN20細(xì)胞密度在第0～1 d略有上升，由1.00×104個(gè)/L升至1.60×104個(gè)/L，相對(duì)生長(zhǎng)速率為0.470(遲滯期)；第1～5 d細(xì)胞密度由1.60×104個(gè)/L升至2.50×105個(gè)/L，相對(duì)生長(zhǎng)速率為1.010(對(duì)數(shù)期)；第6 d由2.50×105個(gè)/L升至2.56×105個(gè)/L，相對(duì)生長(zhǎng)速率為0.024(穩(wěn)定期)(圖6a)?？梢妬喰男伪庠錕DN20在整個(gè)培養(yǎng)階段經(jīng)歷了一個(gè)生長(zhǎng)周期，細(xì)胞生長(zhǎng)充分。

由亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的趨勢(shì)線(圖6b)可知，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度在第0～5 d總體呈緩慢下降趨勢(shì)，但下降幅度很小，此階段的相對(duì)凈化速率為0.019 mg/(L·d)，第6 d亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度略為升高，相對(duì)凈化速率為-0.044 mg/(L·d)。

由氨氮質(zhì)量濃度的趨勢(shì)線(圖6c)可知，氨氮質(zhì)量濃度在第0～3 d由2.002 mg/L快速降至0.001 mg/L，相對(duì)凈化速率為0.667 mg/(L·d)，之后氨氮質(zhì)量濃度一直維持在檢出最低限以下。

圖6 亞心形扁藻KDN20培養(yǎng)液中細(xì)胞密度(a)、亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度(b)、氨氮質(zhì)量濃度(c)的變化情況

整個(gè)培養(yǎng)期，無論是氨氮質(zhì)量濃度快速下降階段，還是維持穩(wěn)定階段，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度一直小幅度緩慢下降。

2.1.6 塔胞藻KDN21

塔胞藻KDN21細(xì)胞密度在第0～1 d略微增加，相對(duì)生長(zhǎng)速率為0.100(遲滯期)；第2～4 d細(xì)胞密度由0.30×105個(gè)/L快速升至2.80×105個(gè)/L，相對(duì)生長(zhǎng)速率為0.745(對(duì)數(shù)期)，第5～6 d細(xì)胞密度明顯下降，進(jìn)入衰亡期(圖7a)?？梢娫撛逶? d的培養(yǎng)期內(nèi)經(jīng)歷了一個(gè)比較完整的生長(zhǎng)周期。

由亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的趨勢(shì)線(圖7b)可知，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度在0～2 d緩慢下降，相對(duì)凈化速率為0.01 mg/(L·d)；第2～5 d亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度下降較快，相對(duì)凈化速率為0.065 mg/(L·d)；第6 d亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度略有上升，相對(duì)凈化速率為-0.014 mg/(L·d)。

由氨氮質(zhì)量濃度的趨勢(shì)線(圖7c)可見，氨氮在第0～2 d快速由1.999 mg/L降至0.001 mg/L，相對(duì)凈化速率為0.999 mg/(L·d)，之后氨氮質(zhì)量濃度一直低于檢出下限。

圖7 塔胞藻KDN21培養(yǎng)液中細(xì)胞密度(a)、亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度(b)、氨氮質(zhì)量濃度(c)的變化情況

亞硝態(tài)氮和氨氮質(zhì)量濃度變化存在一定的先后順序：第0～2 d氨氮幾乎被完全凈化，而亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度僅下降了0.019 mg/L；第3～6 d氨氮質(zhì)量濃度均為0.000 mg/L，而亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度總體上呈緩慢下降趨勢(shì)。

2.2 各微藻對(duì)氨氮、亞硝態(tài)氮凈化情況的比較

所有藻株對(duì)氨氮均表現(xiàn)出很好的凈化能力(圖8)，除柵藻KDN7外，所有藻株第3 d時(shí)的氨氮相對(duì)凈化率均達(dá)到95%以上且一直保持到試驗(yàn)結(jié)束，柵藻KDN7的氨氮相對(duì)凈化率呈先快速升高后緩慢降低的變化趨勢(shì)，說明該藻前期能快速凈化氨氮，后期卻產(chǎn)生了一定量的氨氮；大部分藻株對(duì)亞硝態(tài)氮的凈化能力較弱，相對(duì)凈化率均未超過35%，有的藻株甚至產(chǎn)生了少量亞硝態(tài)氮(相對(duì)凈化率為負(fù)數(shù))，只有雙眉藻KDN17具有較強(qiáng)的亞硝態(tài)氮凈化能力，第2 d時(shí)即能凈化64%的亞硝態(tài)氮，最高時(shí)對(duì)亞硝態(tài)氮的凈化率接近70%；除雙眉藻KDN17外，所有藻種的氨氮相對(duì)凈化率快速上升階段(第0～2 d)，亞硝態(tài)氮相對(duì)凈化率均很低，說明這些藻在快速凈化氨氮時(shí)，并不明顯凈化亞硝態(tài)氮；雙眉藻KDN17的氨氮相對(duì)凈化率快速上升時(shí)亞硝態(tài)氮相對(duì)凈化率也快速上升(第0～2 d)，說明此藻株能同時(shí)較快地凈化氨氮和亞硝態(tài)氮。

圖8 各微藻對(duì)氨氮、亞硝態(tài)氮的相對(duì)凈化率

3 討 論

3.1 混合無機(jī)氮源下微藻對(duì)氨氮和亞硝態(tài)氮的凈化規(guī)律

所有藻株在整個(gè)試驗(yàn)期均生長(zhǎng)充分，都經(jīng)歷了一個(gè)相對(duì)完整的生長(zhǎng)周期。在生長(zhǎng)周期的初期(培養(yǎng)至第2～3 d)，所有藻均能快速凈化氨氮(相對(duì)凈化率均超過95%)，尤以柵藻KDN7最快，僅2 d即可將培養(yǎng)基中的氨氮消耗殆盡；大部分藻株對(duì)亞硝態(tài)氮的凈化能力很弱，相對(duì)凈化速率均未超過0.035 mg/(L·d)，只有雙眉藻KDN17能以每日凈化0.639 mg/L的速率較快地凈化亞硝態(tài)氮。在生長(zhǎng)周期的中后期，絕大多數(shù)藻株的氨氮質(zhì)量濃度保持在極低水平，但柵藻KDN7的氨氮質(zhì)量濃度出現(xiàn)大幅度上升，日增加1.217 mg/L；各藻株對(duì)亞硝態(tài)氮的凈化能力仍然很弱，大部分微藻在此階段的相對(duì)凈化速率均低于0.010 mg/(L·d)，相對(duì)凈化率均未超過35%。上述結(jié)果表明，當(dāng)水體中的氮源僅有3種無機(jī)態(tài)氮時(shí)，在以硝態(tài)氮滿足藻細(xì)胞充分生長(zhǎng)的前提下，絕大部分微藻在生長(zhǎng)初期均優(yōu)先凈化氨氮；無論處于生長(zhǎng)周期的哪個(gè)階段，大部分微藻對(duì)亞硝態(tài)氮的凈化能力都很弱。

3.2 利用微藻控制水產(chǎn)養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的可能性

因施肥、細(xì)菌分解殘餌和糞便以及水產(chǎn)動(dòng)物氮代謝，水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中無機(jī)氮的最初形式主要是氨氮和硝態(tài)氮，水體中的氨氮在硝化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯鯌B(tài)氮和硝態(tài)氮，最終導(dǎo)致水體中同時(shí)存在氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮[27]，這3類無機(jī)氮的含量因水體生物群落、投餌量、天氣等因素的影響處于不斷變化之中[28]。雖然亞硝態(tài)氮不穩(wěn)定，在自然水體中的含量很低，但在高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖中，由于硝化細(xì)菌活性失調(diào)和脫氮作用過程的不平衡均會(huì)引起亞硝態(tài)氮的過量產(chǎn)生[29-30]，給水產(chǎn)動(dòng)物帶來危害。本次試驗(yàn)表明，絕大部分微藻優(yōu)先凈化氨氮，對(duì)亞硝態(tài)氮的凈化能力總是很弱。這一結(jié)果提示，當(dāng)養(yǎng)殖水體的亞硝態(tài)氮含量已經(jīng)超標(biāo)，若想通過向水體中投入人工培養(yǎng)的藻種降低其含量，須選用那些能同時(shí)利用氨氮和亞硝態(tài)氮的藻株(如雙眉藻KDN17)才可能有效果。

3.3 微藻利用硝態(tài)氮過程中積累亞硝態(tài)氮或氨氮的可能性

作為一類低等植物，微藻對(duì)硝態(tài)氮的同化過程類似于植物[31]，即在硝酸還原酶和亞硝酸還原酶的先后作用下將NO3-還原為NO2-再還原為NH4+，最后NH4+分別在谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶的作用下形成谷氨酰胺和谷氨酸，實(shí)現(xiàn)從無機(jī)氮到有機(jī)氮的同化過程。從這一代謝過程可見，微藻細(xì)胞在將硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨氮的過程中出現(xiàn)亞硝態(tài)氮和氨氮的積累是有可能的。

有研究報(bào)道[32]，某些藻類在利用硝態(tài)氮時(shí)之所以會(huì)出現(xiàn)亞硝態(tài)氮積累，是因?yàn)橄跛徇€原酶和亞硝酸還原酶分別在細(xì)胞漿和葉綠體內(nèi)發(fā)揮作用，兩者的反應(yīng)過程并非同步進(jìn)行，而且硝酸還原酶的活性隨著培養(yǎng)基中硝態(tài)氮含量升高而升高，當(dāng)硝態(tài)氮過多導(dǎo)致產(chǎn)生過多的亞硝態(tài)氮，亞硝酸還原酶來不及將亞硝態(tài)氮還原為氨時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生亞硝態(tài)氮積累。王倩雅等[13]的研究表明，尖狀柵藻(S.acuminatus)在初始硝酸鈉濃度為18.0、9.0、6.0、3.6 mmol/L的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，前2 d均出現(xiàn)亞硝態(tài)氮濃度升高的現(xiàn)象，亞硝態(tài)氮濃度最高達(dá)到硝態(tài)氮濃度的1%。馬紅芳等[21]在用柵藻LX1處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水(含氨氮5.75 mg/L、亞硝態(tài)氮0.63 mg/L、硝態(tài)氮20.15 mg/L)時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似情況，接種藻種后培養(yǎng)至第1 d時(shí)亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度明顯升高，由最初的0.63 mg/L升至1.90 mg/L，之后逐漸下降，培養(yǎng)至約第12 d，水中亞硝態(tài)氮含量才開始低于初始值。本研究中，三角褐指藻KDN13和小新月菱形藻KDN18在耗盡氨氮后，藻細(xì)胞密度仍呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度不降反升，到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩種藻液中亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度比初始值分別增加了3.70%和10.02%，說明兩株藻在利用硝態(tài)氮維持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的過程中累積了少量亞硝態(tài)氮。

另外，本研究中，柵藻KDN7氨氮質(zhì)量濃度在降至0.086 mg/L之后逐漸上升，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)升至0.980 mg/L(圖2)，總上升量為0.894 mg/L，同期亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度由1.033 mg/L降至0.692 mg/L(圖2)，下降了33.01%。顯然在氨氮幾乎被耗盡后，柵藻KDN7利用硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮維持其自身生長(zhǎng)的同時(shí)，也產(chǎn)生了一定量的氨氮，這提示某些微藻在同化亞硝態(tài)氮或硝態(tài)氮時(shí)可能產(chǎn)生氨氮積累。由于尚未見到類似報(bào)道，有必要對(duì)此現(xiàn)象做更多研究，以進(jìn)一步揭示水體無機(jī)氮的轉(zhuǎn)換途徑。