王晨曄 丁彩飛 張 偉 鮑嚴(yán)鐘

體外受精-胚胎移植（in vitro fertilizstion and embryo transfer，IVF-ET）目前被廣泛應(yīng)用于不孕癥的治療；其單周期妊娠率最高可達(dá)60%，但總體妊娠率30%～45%，這與反復(fù)胚胎移植失敗（repeated implantation failure，RIF）密切相關(guān)[1]。毓麟珠加減方為國家級名老中醫(yī)鮑嚴(yán)鐘醫(yī)師臨證經(jīng)驗方，由《景岳全書·婦人規(guī)》“毓麟珠”方加減而成，臨床可提高RIF患者再移植臨床妊娠率，但機(jī)制尚不明確。本研究擬從中醫(yī)證候、血清miRNA-31 水平、子宮內(nèi)膜叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)入手，探討此經(jīng)驗方治療RIF 患者子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)制，報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2017 年1 月—2019 年5 月于浙江省中西結(jié)合醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科門診或住院治療確診為腎虛型RIF 患者移植前（非移植周期）30 例為治療組，欲行人工受精的曾有妊娠史的已婚育齡期女性30 例為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，符合《赫爾辛基宣言》中的相關(guān)要求，研究對象簽署知情同意書。

1.2 對照組納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）40 歲以下，育齡婦女；（2）月經(jīng)周期規(guī)律，基礎(chǔ)體溫雙相；（3）近3 個月未服用激素治療；（4）B 超檢查子宮、卵巢無器質(zhì)性病變；（5）B 超檢測顯示排卵日子宮內(nèi)膜厚度≥7mm；（6）未同時參加其他臨床試驗的患者；（7）曾有正常妊娠史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有甲狀腺、腎上腺疾患及糖尿病等內(nèi)分泌疾病；（2）患有心、腦、肝、腎等嚴(yán)重疾??；（3）精神病患者。

1.3 RIF 治療組納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合RIF 診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]；（2）符合中醫(yī)辨證分型診斷標(biāo)準(zhǔn):“不孕癥”腎虛型，具體參照新世紀(jì)全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材《中醫(yī)婦科學(xué)》第2 版的有關(guān)內(nèi)容[3]。（3）近3 個月內(nèi)未服激素類藥物及其他影響生殖內(nèi)分泌的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者；（2）存在染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、生殖道感染、自身免疫性疾病等病因；（3）存在未治愈的子宮內(nèi)膜疾?。ㄏ⑷?、宮腔粘連、宮腔疤痕），重度子宮內(nèi)膜異位癥，多囊卵巢綜合征排卵障礙者，傳染病活動期，輸卵管重度積水等；（4）精神病患者；（5）未按規(guī)定用藥治療無法判斷療效，或者資料不全無法判斷結(jié)果者；（6）參加其他臨床試驗的患者。

2 方 法

2.1 治療方法 RIF 治療組給予毓麟珠方加減（生曬參9g，白術(shù)、茯苓、川芎各12g，巴戟天、雞血藤、熟地、白芍、當(dāng)歸、菟絲子、杜仲各15g，鹿角霜、制首烏、覆盆子各10g，柴胡6g，紫河車粉3g 等），水煎服，每天1 劑，煎取200mL 分早、晚2 次服；從月經(jīng)周期第5 天開始，連續(xù)服用21 天為1 個療程，連續(xù)治療3 個療程。對照組不予任何藥物治療。囑研究對象在研究過程中使用阻隔性避孕方法，排除由于接觸伴侶的精液可能會影響子宮內(nèi)膜中的細(xì)胞因子表達(dá)。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 腎虛證候評分[4-5]RIF 治療組患者治療前后腎虛證候評分變化（由2 名固定中醫(yī)主治醫(yī)師共同完成）。

2.2.2 qRT-PCR 法檢測血清miRNA-31 水平 對照組及RIF 治療組治療前后均于黃體中期（排卵后第7 天），收集患者外周靜脈血5mL，行外周血單一核細(xì)胞（PBMC）的分離：EDTA 抗凝，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離PBMC，用于血清miRNA-31 水平測定。按照Trizol（Invitrogen，美國）說明書操作提取分離PBMC 的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。miRNA-31、內(nèi)參U6 引物通過PUBMED primer-blast 設(shè)計，由杭州旸明生物技術(shù)有限公司合成。序列如下：miRNA-31正向引物：5＇-AGGCAAGATGCTGGC-ATAGCT-3＇；miRNA-31 反向引物：5＇-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；內(nèi)參U6 正向引物：5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3′；內(nèi)參U6 反向引物：5′-GAGAGCACAGAATACGAC-3′。所有反應(yīng)均設(shè)立3 個復(fù)孔，PCR條件：95℃30s 預(yù)變性，95℃5s，60℃30s，72℃30s進(jìn)行40 個循環(huán)。以U6 作為內(nèi)參基因。PCR 擴(kuò)增參照試劑說明書。在2.0%的瓊脂糖凝膠下行電泳，電泳條帶結(jié)果用VDS 圖像分析系統(tǒng)分析。以miRNA-31的吸光度與U6 吸光度的比值，表示miRNA-31 相對表達(dá)水平。

2.2.3 qRT-PCR 法檢測子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS mi-RNA 表達(dá) 對照組患者入組后、RIF 治療組患者治療前后，均于黃體中期（排卵后第7 天）用PiPette 管（寧波天益公司）吸取子宮內(nèi)膜組織，取材后用0.9%氯化鈉溶液沖洗雜質(zhì)后，于-80℃保存，用于子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS miRNA 表達(dá)測定。按照Trizol 說明書操作提取子宮內(nèi)膜組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。Foxp3、eNOS 及內(nèi)參GAPDH 引物通過PUBMED primer-blast 設(shè)計，由杭州旸明生物技術(shù)有限公司合成。序列如下：Foxp3 miRNA 正向引物：5′-CTGACCAAGGCTTCATCTGTG-3′；Foxp3 miRNA 反向引物：5′-ACTCTGGGAATGTGCTGTTTC-3′；eNOS miRNA正向引物：5′-GCACATGGCCTTGGACTGA-3′；eNOS miRNA 反向引物：5′-TCCCAGTTCTTCACACGAGG-3′；內(nèi)參GAPDH 正向引物：5′-GCTGGCGCTGAGTACGTCGT-3′；內(nèi)參GAPDH 反向引物：5′-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3′。所有反應(yīng)均設(shè)立3 個復(fù)孔，PCR 條件：95℃30s 預(yù)變性，95℃5s，60℃30s，72℃30s 進(jìn)行40 個循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參基因。PCR擴(kuò)增參照試劑說明書。電泳條帶結(jié)果用VDS 圖像分析系統(tǒng)分析。以Foxp3 的吸光度與GAPDH 吸光度的比值，表示Foxp3 miRNA 相對表達(dá)水平；以eNOS 的吸光度與GAPDH 吸光度的比值，表示eNOS miRNA相對表達(dá)水平。

2.2.4 不良反應(yīng) 試驗中如出現(xiàn)不良反應(yīng)，予以記錄、隨訪。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；血清miRNA-31 水平與子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS miRNA 相對表達(dá)水平的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 兩組研究對象一般資料比較 RIF 治療組30例，年齡（32.32±2.79）歲，體質(zhì)指數(shù)（BMI）（22.19±3.28）kg/m2；對照組30 例，年齡（31.56±2.83）歲，BMI（22.35±2.67）kg/m2。兩組研究對象年齡、BMI 比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 RIF 治療組治療前后中醫(yī)證候評分比較 RIF治療組治療后中醫(yī)證候評分（12.23±2.01）分，顯著低于同組治療前（17.97±3.59）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3.3 兩組研究對象黃體中期血清miRNA-31 表達(dá)水平比較 黃體中期，RIF 治療組患者治療前血清miRNA-31 水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；RIF 治療組患者治療后血清miRNA-31水平顯著低于同組治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組研究對象黃體中期血清miRNA-31 表達(dá)情況比較（）

表1 兩組研究對象黃體中期血清miRNA-31 表達(dá)情況比較（）

注：RIF 治療組給予毓麟珠方加減治療3 個療程；對照組不予任何藥物治療；RIF 為反復(fù)胚胎移植失?。慌c對照組比較，aP＜0.01；與同組治療前比較，bP＜0.01

3.4 兩組研究對象黃體中期子宮內(nèi)膜Foxp3 miRNA、eNOS miRNA 表達(dá)水平比較 黃體中期，RIF 治療組治療前子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS miRNA 水平均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；RIF 治療組治療后子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS miRNA 水平均顯著高于同組治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

3.5 RIF 治療組黃體中期血清miRNA-31 與子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS miRNA 表達(dá)相關(guān)性分析 相關(guān)分析結(jié)果顯示，黃體中期RIF 治療組血清miRNA-31 水平與子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS miRNA 表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.459，P=0.042；r=-0.503，P=0.035）。

表2 兩組研究對象黃體中期子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS miRNA表達(dá)水平比較（）

表2 兩組研究對象黃體中期子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS miRNA表達(dá)水平比較（）

注：RIF 治療組給予毓麟珠方加減治療3 個療程；對照組不予任何藥物治療；RIF 為反復(fù)胚胎移植失?。籉oxp3 為子宮內(nèi)膜叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3；eNOS 為內(nèi)皮型一氧化氮合酶；與對照組比較，aP＜0.01；與同組治療前比較，bP＜0.01

3.6 不良反應(yīng) 研究過程中RIF 治療組患者均未發(fā)生明顯不良反應(yīng)。

4 討論

目前RIF 的發(fā)病機(jī)制仍不十分明確。子宮內(nèi)膜免疫功能紊亂、內(nèi)膜下血管新生異常，都可降低子宮內(nèi)膜容受性，并與RIF 和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent miscarriage，RM）密切相關(guān)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-31 在不明原因RM 患者蛻膜組織表達(dá)高于正常妊娠組[8]。由于RIF 和RM 密切相關(guān)，推測miRNA-31 可能對評價RIF 子宮內(nèi)膜容受能力有一定臨床價值。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3 作為Fox 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，RIF 患者外周血和子宮內(nèi)膜組織中Foxp3+Tregs 表達(dá)量減少[9]。Foxp3 表達(dá)量增高，可使母體免疫系統(tǒng)不排斥胚胎的植入和發(fā)育[10]。子宮內(nèi)膜eNOS 是一氧化氮同工酶的亞型之一。動物實驗發(fā)現(xiàn)，eNOS/NO 能夠促進(jìn)著床信號的啟動，并能改善子宮內(nèi)膜的血供，增進(jìn)蛻膜化程度，從而增加妊娠的機(jī)會[11]。

鮑嚴(yán)鐘認(rèn)為，腎為沖任之本，胎之所系，腎虛則胎孕難成；若腎氣腎陽充沛，胞宮得以溫煦，則能攝精成孕。故采用“毓麟珠”方加減治療RIF 患者，方中八珍湯榮養(yǎng)一身之氣血，濡養(yǎng)胞宮、胞脈、沖任二脈；杜仲、菟絲子、覆盆子補(bǔ)腎益精；鹿角霜、巴戟天溫補(bǔ)腎精腎陽；女貞子益腎養(yǎng)陰；雞血藤補(bǔ)血活血通絡(luò)，柴胡疏肝理氣。全方補(bǔ)腎與益氣養(yǎng)血并重，通絡(luò)胞脈，促胞胎受孕。藥理研究表明，八珍湯有提高細(xì)胞免疫能力[12]。補(bǔ)腎中藥有內(nèi)分泌激素樣作用，可提高子宮局部雌激素水平，促進(jìn)受孕[13]。鹿角膠具有抗炎作用[14]。活血化瘀藥物可抗凝血，改善子宮卵巢血液供給[15]。

本研究結(jié)果顯示，RIF 治療組黃體中期血清miRNA-31 水平顯著高于對照組（P＜0.01），RIF 治療組治療后黃體中期血清miRNA-31 水平顯著低于同組治療前（P＜0.01）。提示毓麟珠方加減可能通過調(diào)節(jié)血清miRNA-31 水平發(fā)揮改善子宮內(nèi)膜容受性的作用。本研究還顯示，RIF 治療組治療前子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS miRNA 水平均顯著低于對照組（P＜0.01），RIF 治療組治療后子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS miRNA 水平均顯著高于同組治療前（P＜0.01），提示RIF 患者可能存在子宮內(nèi)膜母胎界面免疫調(diào)控紊亂以及內(nèi)膜血管新生障礙，從而影響胚胎的成功植入；毓麟珠方加減可增加RIF 患者種植窗口期子宮內(nèi)膜Foxp3、eNOS 表達(dá)，調(diào)控母胎界面免疫平衡紊亂，促進(jìn)血管新生，促進(jìn)胚胎植入。此外，RIF 治療組血清miRNA-31 水平與子宮內(nèi)膜Foxp3 miRNA 表達(dá)水平的Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），這與既往文獻(xiàn)報道結(jié)果基本一致[11]。而血清miRNA-31 水平與子宮內(nèi)膜eNOS miRNA 表達(dá)水平的Pearson 相關(guān)分析結(jié)果也顯示，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），考慮miRNA-31 表達(dá)上調(diào)可能抑制eNOS 表達(dá)，而eNOS 表達(dá)下降導(dǎo)致種植窗期血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，影響內(nèi)膜血管重塑，這可能是IVF-ET 中RIF 的原因之一。

綜上可見，miRNA-31 對無創(chuàng)評價RIF 子宮內(nèi)膜容受性具有一定的臨床意義。毓麟珠方加減治療RIF 患者移植前，可改善子宮內(nèi)膜容受性，且未見不良反應(yīng)。但由于本次研究樣本量有限，研究結(jié)果可能存在一定局限性。以期在之后的研究中，增加樣本量，以及開展實驗相關(guān)研究，以此豐富RIF 子宮內(nèi)膜容受性中醫(yī)藥研究的機(jī)制內(nèi)容。