王少賢 李振彬

【摘 要】目的：觀察膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠下丘腦視交叉上核（SCN）生物鐘基因Bmal1、Clock的表達(dá)變化，以及雷公藤多苷的調(diào)節(jié)作用。方法：建立CIA大鼠模型，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組，并設(shè)空白對(duì)照組，每組8只。醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組分別于20：00灌胃給藥，雷公藤多苷用藥量10.5 mg·kg-1·d-1，醋酸潑尼松片用藥量1.5 mg·kg-1·d-1;空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌服生理鹽水。連續(xù)給藥6周。觀測(cè)各組大鼠足爪、關(guān)節(jié)腫脹情況，ELISA法測(cè)定血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6水平，qRT-PCR和Western-blot法檢測(cè)SCN Bmal1、Clock基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果：①實(shí)驗(yàn)結(jié)束，與空白對(duì)照組比較，CIA模型大鼠左后踝關(guān)節(jié)圍長(zhǎng)、足跖厚度、足趾容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分均明顯增加（P < 0.05），血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高（P < 0.05），下丘腦SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表達(dá)均明顯下降（P < 0.05）。②與模型對(duì)照組比較，醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組均能明顯改善大鼠足爪、關(guān)節(jié)腫脹程度，降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，增加SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表達(dá)（P < 0.05），雷公藤多苷組對(duì)SCN Bmal1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于醋酸潑尼松組（P < 0.05）。結(jié)論：關(guān)節(jié)炎的發(fā)病影響了血清炎性細(xì)胞因子和下丘腦SCN生物鐘的表達(dá);雷公藤多苷治療CIA模型大鼠關(guān)節(jié)炎癥的作用機(jī)制與調(diào)控下丘腦SCN核心鐘基因表達(dá)和外周炎性細(xì)胞因子分泌水平相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎;雷公藤多苷;下丘腦視交叉上核;生物鐘;Bmal1;Clock;大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the expression of CLOCK and Bmall in suprachiasmatic nucleus（SCN）of hypothalamus in collagen induced arthritis（CIA）rats and the regulation of Tripterygium.Methods：The rat model of collagen induced arthritis was established and randomly divided into a model control group，a prednisone acetate group and a tripterygium glycosides group.There was a blank control group.There were 8 rats in each group.The prednisone acetate group and the tripterygium glycosides group were given intragastric administration at 20：00，respectively with dosage of 1.5 mg·kg-1·d-1 and 10.5 mg·kg-1·d-1，once a day.The blank control group and the model control group were given normal saline successively for?6 weeks.The paw and joint swelling of rats in each group were observed.ELISA was used to detected the levels of TNF-α，IL-1β and IL-6.The gene and protein expressions of CLOCK and Bmall in SCN were detected?by qRT-PCR and Western-blot.Results：①At the end of the experiment，the left posterior ankle joint circumference，plantar thickness，toe volume，arthritis index（AI）scores of CIA model rats were significantly increased compared with the blank control group（P < 0.05）.Levels of TNF-α，IL-1β，IL-6 were significantly increased（P < 0.05），and the gene and protein expressions of CLOCK and Bmall in SCN significantly decreased（P < 0.05）.②Compared with the model control group，the swelling degree of joint and paw could be significantly improved，the levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 decreased and the gene and protein expressions of CLOCK and Bmall in SCN increased in the prednisone acetate group and the tripterygium glycosides group.The regulatory effect of in the tripterygium glycosides group on Bmall expression in SCN was better than that in the prednisone acetate group（P < 0.05）.Conclusion：The pathogenesis of arthritis affects the expression of serum inflammatory cytokines and hypothalamic SCN circadian clock;the mechanism of Tripterygium wilfordii polyglycoside in treating CIA model rats is related to the regulation of hypothalamic SCN core clock gene expression and peripheral inflammatory cytokine secretion level.

【Keywords】 collagen induced arthritis;tripterygium glycosides;suprachiasmatic nucleus of hypothalamus;biological clock;Bmall;Clock;rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）為慢性全身性免疫性疾病，其主要臨床表現(xiàn)如關(guān)節(jié)僵硬、疼痛、腫脹等晨起明顯，具有明顯的晝夜節(jié)律特點(diǎn);與RA相關(guān)的多種炎癥因子[白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6等]及抗炎因子（Cotisol）也呈現(xiàn)明顯的晝夜變化[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，這種節(jié)律變化與生物鐘基因表達(dá)變化密切相關(guān)[5-7]。

本研究擬觀察雷公藤多苷對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠下丘腦視交叉上核（SCN）生物鐘基因Clock、Bmal1的表達(dá)，以及模型大鼠關(guān)節(jié)炎癥和外周血炎性細(xì)胞因子的變化，旨在從生物鐘基因角度探討雷公藤多苷治療RA的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠60只，6～7周齡，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011。清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，室溫（21±1）℃，相對(duì)濕度40%～60%，固定光照明、暗各12 h（明7：00～19：00，暗19：00～7：00），自由攝食、飲水。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中盡可能減少動(dòng)物的痛苦和死亡。

1.2 藥 物 雷公藤多苷（純度98%，南京澤郎生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)ZL170225-LGTDG）;醋酸潑尼松片（辰欣藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)160813201）;雷公藤多苷和醋酸潑尼松片均以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的羧甲基纖維素鈉溶解灌胃給藥。

1.3 主要試劑和儀器 弗氏完全佐劑（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)F-5881）;牛Ⅱ型膠原（美國(guó)Chondrex公司，貨號(hào)20022）;腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-6 ELISA kit（德國(guó)IBL International GmbH公司，貨號(hào)分別為BE45471、BE45411、BE45361）;TRNzol Universal總RNA提取試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、FastFire快速熒光定量PCR預(yù)混試劑（SYBR Green）、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)分別為DP424、KR118、FP207、PA115];RIPA Buffer（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，貨號(hào)89900）;β-actin小鼠單克隆一抗（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab8226）;Clock小鼠單克隆一抗（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，貨號(hào)sc-271603）;Bmal1小鼠單克隆一抗（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，貨號(hào)sc-373955）;二抗羊抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體（IgG-HRP，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)ZDR-5307）;YLS-7C足趾容積測(cè)量?jī)x（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，3K15型）;低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司，ND2000型）;微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（美國(guó)ABI公司）;凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）。

1.4 CIA大鼠模型制備與分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)

1周，根據(jù)體質(zhì)量編號(hào)隨機(jī)分為空白對(duì)照組8只，造模組52只。將弗氏完全佐劑與含牛Ⅱ型膠原的0.05 mol·L-1醋酸溶液等體積振蕩混勻，充分乳化，最終膠原含量為1 mg·mL-1。于造模組大鼠右后足爪、背部、尾根部皮下多點(diǎn)注射膠原溶液0.2 mL，第15天每只大鼠再次注射膠原溶液0.1 mL，加強(qiáng)免疫?？瞻讓?duì)照組大鼠在相同部位注射等體積生理鹽水。關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評(píng)分采用5級(jí)評(píng)分法評(píng)定[8]。0分，關(guān)節(jié)、足趾無(wú)紅腫;1分，趾關(guān)節(jié)紅腫;2分，足趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3分，踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹;4分，踝關(guān)節(jié)和足爪均明顯腫脹。每只大鼠單肢評(píng)分最高4分，四肢累計(jì)得分為AI評(píng)分，最高16分。

AI評(píng)分≥4分視為造模成功[9]。本次實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笫状蚊庖咦⑸浜蟮?1天AI評(píng)分≥4分共計(jì)30只（占57.69%），隨機(jī)分為模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組，每組10只。最終每組納入8只大鼠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 給藥方法 雷公藤多苷組、醋酸潑尼松組分別于20：00灌胃相應(yīng)藥物，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌服生理鹽水。按照大鼠與70 kg成人體質(zhì)量折算系數(shù)為7計(jì)算大鼠每日用藥量，雷公藤多苷組用藥量10.5 mg·kg-1·d-1（雷公藤多苷組成人用量1.5 mg·kg-1·d-1），每日1次;醋酸潑尼松片用藥量1.5 mg·kg-1·d-1（醋酸潑尼松片成人每日15 mg），每日1次。連續(xù)給藥6周后取材。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 足爪、關(guān)節(jié)腫脹情況 觀察比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠左后足趾容積、足跖厚度、踝關(guān)節(jié)圍長(zhǎng)并評(píng)定四肢AI得分，綜合評(píng)定治療用藥后大鼠足爪和關(guān)節(jié)腫脹變化程度。左后足爪容積、足跖厚度、踝關(guān)節(jié)圍長(zhǎng)測(cè)定：采用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量每只大鼠左后足趾容積（mL），游標(biāo)卡尺測(cè)定左后足跖厚度、踝關(guān)節(jié)圍長(zhǎng)（mm）。

1.6.2 ELISA法測(cè)定血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔麻醉大鼠，斷頭，取血，離心機(jī)在4 ℃以3500 r·min-1離心20 min，離心半徑8.2 cm，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明，測(cè)定各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.6.3 qRT-PCR和Western-blot法檢測(cè)SCN中Bmal1、Clock基因和蛋白表達(dá) 取血同時(shí)，快速取腦，液氮速凍，摳取SCN組織，進(jìn)行qRT-PCR和Western-blot檢測(cè)。

1.6.3.1 qRT-PCR主要步驟 ①總RNA提取：大鼠SCN組織50 μg，加入1 mL TRNzol Universal試劑提取總RNA。②cDNA合成：根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，配置20 μL反應(yīng)體系：5× FastKing-RT SuperMix 4 μL，RNA提取液5 μL（含total RNA 1 μg/樣本），RNase-Free dd H2O 11 μL。

于PCR儀上，42 ℃ 15 min，然后95 ℃加熱3 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。③PCR擴(kuò)增：以cDNA為模板，根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系：2×FastFire qPCR PreMix 25 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL，cDNA模板1 μL，ROX Reference Dye 5 μL，去離子水16 μL。DNA模板預(yù)變性95 ℃ 1 min，然后PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)：變性95 ℃ 5 s，模板與引物退火58 ℃ 10 s，引物延伸72 ℃ 31 s，于72 ℃引物延伸時(shí)采集熒光信號(hào)。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。β-actin：上游引物（5'至3'）GGTCATCACCATTGGCAA，下游引物（5'至3'）GAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGA，105 bp。Clock：上游引物（5'至3'）TCGGCAGCAAGAAGAACTAAG，下游引物（5'至3'）AGAACCAAGATTCAGTCCAGG，109 bp。Bmal1：上游引物（5'至3）TGCCACCAACCCATACAC，下游引物（5'至3'）CCTCGGTCACATCCTACGAC，120 bp。β-actin為內(nèi)參照基因。PCR擴(kuò)增完畢后，采用SDSV 1.3軟件分析獲得Ct值，根據(jù)RQ = 2-△△Ct計(jì)算各樣本Clock、Bmal1 mRNA相對(duì)表達(dá)量（RQ值），其中空白對(duì)照組1號(hào)樣本RQ值被設(shè)定為1。各樣本RQ值最終納入統(tǒng)計(jì)分析。

1.6.3.2 Western-blot主要步驟 ①提取總蛋白：SCN組織置EP管，加RIPA Buffer 1 mL勻漿，冰浴反應(yīng)30 min，充分裂解，離心機(jī)以8000 r·min-1離心10 min，離心半徑8.2 cm，取上清，提取總蛋白，根據(jù)BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。②電泳、轉(zhuǎn)膜：30 μg? 蛋白/樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離目標(biāo)蛋白條帶，然后電泳轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。③封閉：轉(zhuǎn)膜完畢，蒸餾水振蕩沖洗5 min × 3次，以5%脫脂奶粉室溫下封閉60 min。④一抗、二抗孵育：TTBS洗膜5 min×3次，加Clock（1∶300）或Bmal1（1∶300）或β-actin（1∶500）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜;TTBS洗膜5 min×3次，加入1∶3000羊抗小鼠IgG-HRP，4 ℃孵育60 min。⑤蛋白檢測(cè)：TTBS室溫洗膜10 min×3次，TBS洗膜5 min，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)獲得目標(biāo)條帶，凝膠成像系統(tǒng)成像。β-actin為參照條帶，采用Image-Pro Plus 6.0分析目標(biāo)條帶積分光密度值（IOD），以IOD目標(biāo)條帶/IODβ-actin公式計(jì)算Bmal1、Clock蛋白表達(dá)相對(duì)含量，納入統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊組間比較采用SNK-q法，方差不齊組間比較采用Dunnett's T3法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠足爪、關(guān)節(jié)腫脹程度比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，CIA模型大鼠左后踝關(guān)節(jié)圍長(zhǎng)、足跖厚度、足趾容積、四肢AI評(píng)分均較空白對(duì)照組大鼠明顯增加（P < 0.05）;醋酸潑尼松組和雷公藤多苷組大鼠左后足爪各個(gè)指標(biāo)均明顯下降（P < 0.05），2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，ELISA法測(cè)得CIA模型大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平較空白對(duì)照組大鼠均明顯升高（P < 0.05）;醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組均可降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;醋酸潑尼松組與雷公藤多苷組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠下丘腦SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠下丘腦SCN Bmal1、Clock蛋白和基因表達(dá)均明顯下降（P < 0.05）;雷公藤多苷組、醋酸潑尼松組SCN Bmal1、Clock表達(dá)較模型對(duì)照組均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;雷公藤多苷組大鼠SCN Bmal1、Clock表達(dá)較醋酸潑尼松組均有所增加，且Bmal1表達(dá)2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表3和圖1。

3 討 論

自20世紀(jì)60年代至今，RA晝夜節(jié)律特點(diǎn)和機(jī)制受到越來(lái)越多學(xué)者關(guān)注。RA患者臨床癥狀晝輕夜重的規(guī)律特征，與體內(nèi)炎性細(xì)胞因子、褪黑素（MLT）、糖皮質(zhì)激素的晝夜振蕩有關(guān)[10]。課題組前期研究和相關(guān)研究文獻(xiàn)均表明，IL-6、TNF-α、IL-1、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）等炎性因子分泌水平在2：00～7：00達(dá)到高峰[11-17]，MLT也在凌晨達(dá)到高峰[18]，并且MLT會(huì)刺激IL-6等促炎細(xì)胞因子分泌增加以加重RA病情[19-20];另一方面，內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素在RA患者機(jī)體內(nèi)分泌嚴(yán)重不足，且在夜間降至最低水平，皮質(zhì)醇作為體內(nèi)關(guān)鍵抗炎物質(zhì)，則在夜間無(wú)法抑制持續(xù)的免疫炎癥反應(yīng)[21]，導(dǎo)致RA癥狀夜間加重，晨起關(guān)節(jié)僵硬不適等表現(xiàn)明顯。

除外體內(nèi)炎性因子和激素水平變化與RA病變密切相關(guān)，生物鐘也深度參與了RA的病理過(guò)程[5，21-25]。在分子水平上，生物鐘由高度進(jìn)化保守的基因控制，包括激活因子（Clock和Bmal1）和抑制因子（Per1/2和Cry1/2）[22]。缺乏生物鐘調(diào)節(jié)的小鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)形態(tài)異常和對(duì)炎癥性關(guān)節(jié)炎的敏感性增加[23-24]，關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程中通常在分離的軟骨細(xì)胞中觀察到促炎細(xì)胞因子（如IL-1β、TNF-α等）并伴隨著鐘基因表達(dá)中斷[25]，提示晝夜節(jié)律、炎癥和關(guān)節(jié)炎之間存在密切關(guān)系[26]。在原代培養(yǎng)的RA滑膜細(xì)胞中，TNF-α可通過(guò)雙鈣依賴途徑調(diào)節(jié)Bmal1表達(dá)[27]，TNF-α還可通過(guò)D-box結(jié)合蛋白在RA滑膜細(xì)胞中調(diào)控Per2基因的表達(dá)[28]，從而參與RA的發(fā)病機(jī)制。有研究報(bào)道，RA患者血樣中白細(xì)胞Clock基因的表達(dá)，可作為預(yù)測(cè)改善病情抗風(fēng)濕藥物如TNF抑制劑、IL-6抑制劑、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4在RA治療中的疾病活性和療效的生物標(biāo)志物[29]。鐘基因變化可影響炎性細(xì)胞因子的分泌規(guī)律和濃度水平，同時(shí)炎性細(xì)胞因子的異常又可擾亂鐘基因的表達(dá)，鐘基因與炎性細(xì)胞因子相互影響，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥狀加重。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，位于下丘腦前部的SCN是生物鐘晝夜節(jié)律的起搏點(diǎn)，可通過(guò)神經(jīng)和激素信號(hào)通路對(duì)外周生物鐘進(jìn)行調(diào)節(jié)[30]，而Clock和Bmal1為SCN中整個(gè)晝夜節(jié)律生物鐘轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路的核心鐘基因和原始動(dòng)力[31-32]。本研究觀測(cè)到伴隨踝關(guān)節(jié)、足爪的明顯腫脹和血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，CIA模型大鼠下丘腦SCN中Bmal1、Clock蛋白和基因表達(dá)均明顯下降，說(shuō)明關(guān)節(jié)炎的發(fā)病不但促使炎性細(xì)胞因子的表達(dá)增加，同時(shí)也影響了核心鐘基因的表達(dá)。

雷公藤多苷是從雷公藤根中提取的一種總皂苷，是雷公藤抗炎、免疫調(diào)節(jié)的主要活性成分[33]。目前，雷公藤多苷在臨床已被廣泛應(yīng)用于治療RA等炎癥性疾病，系統(tǒng)評(píng)價(jià)雷公藤多苷聯(lián)合改善病情抗風(fēng)濕藥物可明顯減輕RA患者關(guān)節(jié)腫脹程度、疼痛評(píng)分和握力、晨僵程度，降低紅細(xì)胞沉降率和C-反應(yīng)蛋白水平[34-35]。機(jī)制研究表明，雷公藤多苷可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、淋巴細(xì)胞、酶類、核轉(zhuǎn)錄因子-κB的表達(dá)，抑制炎性細(xì)胞因子分泌和炎癥通路的激活，抑制血管生成和誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡，保護(hù)軟骨和基因調(diào)控等方面發(fā)揮抗RA作用[36-39]。本課題組近年來(lái)致力于RA晝夜節(jié)律變化及雷公藤多苷藥效機(jī)制研究，前期觀測(cè)到雷公藤多苷、來(lái)氟米特在炎癥上升期擇時(shí)用藥可以更加有效地抑制炎癥、減緩病情[11-12]，但其分子機(jī)制有待深入研究。

本研究初步觀察到雷公藤多苷、醋酸潑尼松在20：00給藥均能明顯降低CIA大鼠血清炎性細(xì)胞因子水平和增加下丘腦SCN鐘基因Bmal1、Clock的表達(dá)。提示雷公藤多苷臨床治療RA的作用機(jī)制，可能與調(diào)控SCN核心鐘基因表達(dá)和外周炎性細(xì)胞因子分泌水平相關(guān)，但下丘腦CNS核心鐘基因與外周關(guān)節(jié)炎這一“腦-關(guān)節(jié)軸”之間復(fù)雜的相互作用及其機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] CUTOLO M，MASI AT.Circadian rhythms and arthr-itis[J].Rheum Dis Clin North Am，2005，31（1）：115-129.

[2] PAGANELLI R，PETRARCA C，DI GIOACCHINO M.Biological clocks：their relevance to immune-allergic diseases[J].Clin Mol Allergy，2018，16（1）：1-8.

[3] PERRY MG，KIRWAN JR，JESSOP DS，et al.Overnight variations in cortisol，interleukin 6，tumour necrosis factor alpha and other cytokines in people with rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，2009，68（1）：63-68.

[4] 李振彬.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎研究的熱點(diǎn)——時(shí)間生物學(xué)[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2012，16（11）：721-723.

[5] HAND LE，HOPWOOD TW，DICKSON SH，et al.The circadian clock regulates inflammatory arthritis[J].FASEB J，2016，30（11）：3759-3770

[6] DE CATA A，D'AGRUMA L，TARQUINI R，et al.Rheumatoid arthritis and the biological clock[J].Expert Rev Clin Immunol，2014，10（5）：687-695.

[7] GIBBS JE，RAY DW.The role of the circadian clock in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Res Ther，2013，15（1）：205.

[8] 楊漸，蔡宏達(dá)，曾玉蘭，等.大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型的建立及評(píng)價(jià)[J].海峽藥學(xué)，2014，26（9）：27-31.

[9] 王潔，王亞南，陸妍，等.藤莓湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜PPARγ/NF-κB信號(hào)途徑的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，37（4）：458-463.

[10] 吳曉，陳白露，陳貴全.基于晝夜節(jié)律研究針灸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的概況[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2019，37（4）：901-904

[11] 李振彬，張英杰，齊靜，等.佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠外周血TNF-α、IL-1β、MIF與MLT的晝夜節(jié)律[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2014，26（5）：1-4.

[12] 宋哲.雷公藤多苷對(duì)大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的時(shí)間治療學(xué)研究[D].唐山：華北理工大學(xué)，2016.

[13] 馬文彬，劉旭光，周海燕.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與晝夜節(jié)律相關(guān)性的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014，35（7）：1123-1125.

[14] 馬文彬，劉旭光，覃勇，等.艾灸對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠腫瘤壞死因子-α?xí)円构?jié)律的調(diào)控[J].廣東醫(yī)學(xué)，2015，53（24）：3746-3749.

[15] 馬文彬，劉旭光，覃勇，等.艾灸調(diào)整實(shí)驗(yàn)性RA大鼠炎性因子IL-1晝夜節(jié)律的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015，27（2）：493-496.

[16] 馬文彬，劉旭光，覃勇，等.辰時(shí)麥粒灸對(duì)RA模型大鼠炎性因子IL-6晝夜節(jié)律的影響[J].中國(guó)針灸，2016，36（4）：396-401.

[17] 馬文彬，劉旭光，周海燕.擇時(shí)艾灸對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠下丘腦 -垂體-腎上腺軸晝夜節(jié)律的影響[J].針刺研究，2016，41（2）：100-107.

[18] AFKHAMIZADEH M，SAHEBARI M，SEYYED-HOSEINI SR.Morning melatonin serum values do not correlate with disease activity in rheumatoid arthritis：a cross- sectional study[J].Rheumatol Int，2014，34（8）：1145-1151.

[19] CUTOLO M，MAESTRONI GJ.The melatonin-cytokine connection in rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，2005，64（8）：1109-1111.

[20] 郭子楨，朱德昊，陳廣潔.晝夜節(jié)律通過(guò)褪黑素和糖皮質(zhì)激素影響RA[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2019，39（5）：420-423.

[21] 曾邕萍，米存東.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者皮質(zhì)醇分泌節(jié)律與炎性細(xì)胞因子的關(guān)系[J].內(nèi)科，2011，6（2）：147-150.

[22] BUHR ED，TAKAHASHI JS.Molecular components of the mammalian circadian clock[J].Handb Exp Pharmacol，2013，217（3）：3-27.

[23] DUDEK M，GOSSAN N，YANG N，et al.The chondrocyte clock gene Bmal1 controls cartilage homeostasis and integrity[J].J Clin Invest，2016，126（1）：365-376.

[24] GOSSAN N，ZEEF L，HENSMAN J，et al.The circadian clock in murine chondrocytes regulates genes controlling key aspects of cartilage homeostasis[J].Arthritis Rheum，2013，65（9）：2334-2345.

[25] GUO B，YANG N，BORYSIEWICZ E，et al.Catabolic cytokines disrupt the circadian clock and the expression of clock-controlled genes in cartilage via an NF-кB dependent pathway[J].Osteoarthr Cartil，2015，23（11）：1981-1988.

[26] KRAWETZ RJ.Resetting the clock on arthritis[J].Arthritis Res Ther，2019，21（1）：37.

[27] YOSHIDA K，NAKAI A，KANESHIRO K，et al.TNF-α induces expression of the circadian clock gene Bmal1 via dual calcium-dependent pathways in rheumatoid synovial cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2018，495（2）：1675-1680.

[28] YOSHIDA K，HASHIRAMOTO A，OKANO T，et al.TNF-α modulates expression of the circadian clock gene Per2 in rheumatoid synovial cells[J].Scand J Rheumatol，2013，42（4）：276-280.

[29] KENTA K，KOHSUKE Y，KANTA M，et al.Expressions of circadian clock genes represent disease activities of RA patients treated with biological DMARDs[J].Mod Rheumatol，2020，30（2）：293-300.

[30] GOLOMBEK DA，ROSENSTEIN RE.Physiology of circadian entrainment[J].Physiol Rev，2010，90（3）：1063-1102.

[31] 王春燕，廖萍，劉曉黎，等.生物鐘紊亂與相關(guān)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].臨床與病理雜志，2015，35（4）：676-680.

[32] PILORZ V，HELFRICH-F?RSTER C，OSTER H.The role of the circadian clock system in physiology[J].Pflugers Arch，2018，470（2）：227-239.

[33] 田振，劉志宏，宋洪濤.雷公藤有效部位提取純化工藝研究進(jìn)展[J].中草藥，2012，43（2）：408-412.

[34] XU X，LI QJ，XIA S，et al.Tripterygium Glycosides for Treating Late-onset Rheumatoid Arthritis：A Systematic Review and Meta-analysis[J].Altern Ther Health Med，2016，22（6）：32-39.

[35] ZHOU YY，XIA X，PENG WK，et al.The Effectiveness and Safety of Tripterygium wilfordii Hook.F Extracts in Rheumatoid Arthritis：A Systematic Review and Meta-Analysis[J].Front Pharmacol，2018，16（9）：356.

[36] 姜海平，張艷艷.雷公藤多苷治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的抗炎機(jī)制研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2017，13（21）：57-58.

[37] 謝艷，郭云鵬.雷公藤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2013，2（4）：72-75.

[38] ZHANG W，LI F，GAO W.Tripterygium wilfordii inhibiting angiogenesis for rheumatoid arthritis treatment[J].J Natl Med Assoc，2017，109（2）：142-148.

[39] FAN D，GUO Q，SHEN J，et al.The effect of Triptolide in rheumatoid arthritis：from basic research towards clinical translation[J].Int J Mol Sci，2018，19（2）：E376.

收稿日期：2020-04-20;修回日期：2020-05-30