張婷婷， 蔡小姚， 滕 麗，3， 周 靜， 劉紅美*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控省部共建教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

真菌病毒是指可以侵染絲狀真菌、酵母和卵菌，并能在其中復(fù)制的病毒。在植物病原真菌中存在著大量的真菌病毒[1-3]。大多數(shù)情況下，真菌病毒侵染寄主真菌后不會使其出現(xiàn)明顯的外部癥狀，僅有少數(shù)真菌病毒侵染寄主后會對其造成影響[4]。此外，研究表明，大多數(shù)真菌病毒是雙鏈RNA(dsRNA)病毒。目前，具有dsRNA基因組的真菌病毒在分類學(xué)上被分為6個科：呼腸孤病毒科(Reoviridae)、全病毒科(Totiviridae)、雙分病毒科(Paritiviridae)、產(chǎn)黃青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分體病毒科(Quadriviridae)、巨型雙節(jié)段病毒科(Megabirnaviridae)，以及最近提議的Botybirnaviridae科[5]。但仍存在許多未被分類的真菌病毒。近幾年已經(jīng)報道了諸多未分類的真菌病毒[6-9]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是一種自由生活的真菌，常見于土壤和根系生態(tài)系統(tǒng)中。其生存能力較強、分布較廣且能拮抗植物病原真菌，在農(nóng)業(yè)和工業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。木霉菌具有無污染、對人、動物和環(huán)境無毒性、生長速度快、孢子產(chǎn)量高、容易生產(chǎn)等優(yōu)點，世界各國已將木霉菌應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、加工中，成為生物防治、生物肥料和土壤調(diào)節(jié)劑[10]。中國是農(nóng)業(yè)大國，大型農(nóng)作物對生物制劑的需求量很大。因此，木霉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了較大的經(jīng)濟效益[11]。木霉菌種(如曲霉菌、哈茨木霉和阿曲韋德菌)是許多土壤傳播植物病原體的有效生物防治劑，部分菌種能增強植物生長的能力[12-14]。棘孢木霉(Trichodermaasperellum)是2005年中國記錄的木霉屬物種[15]，但其開發(fā)利用仍處于初步階段[16-17]。在木霉屬物種中，先前已經(jīng)報道了dsRNA真菌病毒的存在[6,18]。但目前尚無完全測序的真菌病毒感染棘孢木霉菌的報道。在此基礎(chǔ)上，筆者側(cè)重于獲取棘孢木霉菌株中攜帶真菌病毒的全基因組序列，并且對其進行基因組解析，從而明確病毒的分類學(xué)地位，并將此病毒命名為TrichodermaasperellumUnassigned Virus 1(TaUV1)，以進一步了解真菌病毒的致病性、進化、生命周期以及病毒與寄主真菌之間互作等內(nèi)容。而且，未分類真菌病毒的發(fā)現(xiàn)和新的真菌病毒能豐富病毒分類學(xué)，有利于研究真菌病毒的分類和進化，以及促進病毒學(xué)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 棘孢木霉菌株從貴州省興仁縣交樂村的高砷煤礦土壤中分離得到，長期保存于-80℃。

1.1.2 主要試劑及儀器 DNase I酶、S1 Nuclease酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Klenow酶、pMD18-T載體、T4RNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DNA膠回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；2×PCR mix購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱購自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；電泳儀購自北京六一公司；凝膠成像儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；恒溫振蕩器購自太倉市實驗設(shè)備廠；PCR儀購自美國ABI公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，切片，用去離子水1.4 L煮沸，過濾，量取1 L浸出液，加入葡萄糖20 g，瓊脂15 g，121℃恒溫高壓濕氣滅菌20 min。LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 L，121℃恒溫高壓濕氣滅菌20 min。

1.1.4 引物設(shè)計 試驗引物由武漢天一輝遠公司合成，引物及序列見表1。

1.2 菌株的分離

稱取高砷煤礦土壤1 g放入50 mL錐形瓶中，加入適量的去離子水后放入搖床搖勻，取出靜置5 min，吸取100 μL上清液稀釋5個梯度，每個梯度吸取100 μL液體分別涂布在PDA培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)，待有菌落長出，挑取不同的單菌落接在新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，從而分離得到單個菌株。

1.3 病毒RNA的提取與純化

將目的菌株接種至加有玻璃紙的PDA平板中擴大培養(yǎng)，將菌絲體放入研缽中，用液氮將其研磨成粉末狀，取約0.5 g裝入2.0 mL無菌離心管中。將0.6 mL 2×GPS、0.6 mL苯酚、0.6 mL氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)和138 μL 10% SDS依次加入樣品中，室溫下充分震蕩，12 000 r/min離心10 min。將0.04 g無離子纖維素粉末(CF-11)稱入2.0 mL無菌離心管中，取0.6 mL上清液緩慢移入管中，并且每0.6 mL上清液加114 μL無水乙醇，混勻后放置4℃冰箱中過夜。然后離心機12 000 r/min離心5 min后棄上清，倒扣濾紙上吸干殘液，移液器加入0.6 mL清洗緩沖液，混勻后靜置1 min；重復(fù)洗脫3次，加入640 μL 1× STE，混合搖勻，12 000 r/min離心8 min并吸取0.6 mL上清至1.5 mL的無菌離心管，加入60 μL的3 mol/L醋酸鈉(pH 5.2)，0.6 mL的異丙醇(或1.2 mL無水乙醇)，混勻，-20℃下預(yù)沉淀2 h，4℃離心機12 000 r/min離心30 min，去除上清液，沉淀用500 μL 75%酒精進行洗脫，4℃下12 000 r/min離心5 min，瀝干上清液，并在37℃恒溫箱中干燥待其酒精揮發(fā)干凈，用20 μL DEPC-H2O溶解沉淀，即為粗提的RNA樣品。用DNaseI酶和S1核酸酶處理樣品，去除樣品中的DNA和單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)污染。樣品在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用0.1 μg/mL溴化乙錠染色，紫外下觀察RoRV1的條帶特征。

1.4 病毒RNA基因組序列的獲取

將純化的dsRNA樣品作為模板，采用隨機引物擴增法獲得RoRV1的中間序列[19]，即將純化的dsRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用隨機引物RACE-3擴增得到大量隨機片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈彌散條帶，切下750～1 000 bp隨機片段進行膠回收，過夜連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，Amp篩選陽性克隆，挑選單克隆進行PCR鑒定，結(jié)果在1%瓊脂糖凝膠上呈大小不一的單一片段，挑取較大的隨機片段送公司進行測序。病毒末端克隆的方法參考POTGIETER等[20]采用的方法，首先在dsRNA的兩末端加上一段已知序列的接頭片段，然后將加上接頭的dsRNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈，最后用與該序列互補的一段寡核苷酸作為引物，另一引物根據(jù)已測定序列設(shè)計，進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)獲取dsRNA末端的序列。將擴增的cDNA產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，并熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，鑒定陽性克隆，進行測序分析。

1.5 序列拼接及系統(tǒng)進化樹建立

序列拼接和開放閱讀框(ORF)的預(yù)測使用DNAMAN 5.0軟件；序列同源性搜索使用NCBI網(wǎng)站的在線BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域鑒定使用 NCBI網(wǎng)站的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫搜索程序(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?)；氨基酸多序列比對使用 MAFFT軟件；系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建使用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)。ML樹的計算使用 MEGA 5.0軟件，采用默認參數(shù)設(shè)置，并以自展法(bootstraP)對 ML樹進行評估，重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000。系統(tǒng)進化樹分析中所用的病毒如表2所示。選擇的25種RNA病毒包括13種Totiviridae科病毒，3種Chrysoviridae科病毒，以及通過BLAST搜索的9種未分類的大型單分子樣雙鏈RNA病毒。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

如圖1所示，棘孢木霉菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后會形成同心環(huán)狀的菌落，且會產(chǎn)生綠色稠密的分生孢子。接近中央的分生孢子呈暗綠色，靠近培養(yǎng)皿邊緣的分生孢子由于剛剛形成所以顏色較淺，氣生菌絲稀疏，培養(yǎng)基上無色素滲透。

2.2 菌株中真菌病毒的分離與純化

經(jīng)DNase I酶和S1核酸酶處理，菌株攜帶的真菌病毒為dsRNA真菌病毒。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，在10 kb附近可見到1條單一的明顯條帶(圖2)。該病毒命名為TrichodermaasperellumUnassignedVirus 1(TaUV1)。

2.3 TaUV1序列

由圖3可見，TaUV1全長9 838個堿基，G+C含量為47.8%。通過隨機引物擴增法得到TaUV1的隨機片段(圖3中1～19)，經(jīng)序列拼接發(fā)現(xiàn)，并不能完全拼接出1條完整的全基因序列。隨后，根據(jù)已獲取的基因組序列設(shè)計特異性的搭橋引物A～D和末端引物a～d，通過PCR克隆出未獲得的基因組序列，最后通過拼接得到1條完整的TaUV1基因組序列。

2.4 TaUV1基因組序列

如圖4所示，從棘孢木霉菌中提取的TrichodermaasperellumUnassignedVirus 1(TaUV1)病毒，已獲取GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號為MG897472。基因組序列分析表明，TaUV1在其基因組正鏈上包含2個不連續(xù)的大的開放閱讀框(ORF)，ORF1和ORF2，其具有1個長1 176 bp的 5′-非翻譯區(qū)(UTR)和1個相對較短的長52 bp的3′-非翻譯區(qū)(UTR)。ORF1位于1 177～5 686 bp，總長4 509 bp，編碼的蛋白有1 502個氨基酸，分子量大小是165.2 kDa。ORF2不與ORF1重疊，位于5 802～9 786 bp，總長3 984 bp，編碼的蛋白有1 327個氨基酸，分子量為149.5 kDa。ORF2與ORF1間隔113 bp，在ORF1的終止密碼子TAA的5 684～5 686 bp發(fā)現(xiàn)了1個潛在的移碼序列七聚體(AAAAAAT，5 677～5 683 bp)，在此處發(fā)生了程序性-1的核糖體移碼機制，使2個ORFS被通讀，編碼1個融合蛋白。使用RNA Structure軟件對病毒TaUV1的-1核糖體移碼序列(AAAAAAT)后的113 bp序列進行RNA二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析顯示，TaUV1的-1核糖體移碼序列(AAAAAAT)后的113 bp序列處有復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。表明，-1核糖體移碼序列(AAAAAAT)后的113 bp序列形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，協(xié)助了-1核糖體移碼機制的發(fā)生，是該移碼機制的必須元件之一。

2.5 TaUV1與相關(guān)病毒的結(jié)構(gòu)

由表3可見，TaUV1與其他4個病毒的基因組大小均為8.5～10 kb；ORF1編碼的蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白(structure protein；SP)或假定蛋白(hypothetical protein；HP)，ORF2編碼的均為RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases；RdRp)；均有S7結(jié)構(gòu)域(S7 domain)；均有-1核糖體移碼現(xiàn)象，同時，也都含有假節(jié)或者莖環(huán)結(jié)構(gòu)(Pseudoknot or stem-loop structure)。雖在真菌病毒中發(fā)現(xiàn)了各種七聚體移碼序列，但僅在TaUV1中發(fā)現(xiàn)了相同的AAAAAAT七聚體移碼序列。

表3 TaUV1與相關(guān)病毒的比較

2.6 TaUV1與相關(guān)病毒的RdRp區(qū)域

如圖5所示，在TaUV1和7個病毒的RdRp區(qū)域發(fā)現(xiàn)了8個RdRp的保守結(jié)構(gòu)域(conserved motifs Ⅰ-Ⅷ)和1個S7結(jié)構(gòu)域。

2.7 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

如圖6所示，該系統(tǒng)進化樹顯示TaUV1與未分類的FvV1、FvV2、TaMV1、MpRV2、FpV2、FpV3、FgV3、SsRV-L和BcRV1聚成一簇，與其他病毒相距較遠，這簇病毒為新的未分類病毒科。因此，從TaUV1的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)系統(tǒng)進化的角度證實TaUV1是未分類病毒科的新成員。

3 結(jié)論與討論

通過棘孢木霉菌株攜帶的真菌病毒TaUV1獲取了TaUV1的全基因組信息，從TaUV1基因組結(jié)構(gòu)分析得知，TaUV1具有1條未分段的9 838 bp病毒條帶。其具有2個大的不連續(xù)的閱讀框(ORF)，即ORF1和ORF2。ORF1和ORF2分別編碼假定蛋白(HP)和RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)。2個閱讀框之間間隔113 bp，存在1個由七聚體移碼序列(AAAAAAT)引起的-1核糖體移碼現(xiàn)象，該移碼現(xiàn)象的存在將2個大的不連續(xù)閱讀框融合成1個大的閱讀框，提高了病毒的翻譯效率。未分段的病毒科中最具有代表性的是Totiviridae科病毒。但Totiviridae科病毒的基因組大小為4.6～6.5 kb。因此，TaUV1并不屬于Totiviridae科。

對棘孢木霉菌株JLM45-3所攜帶的真菌病毒TaUV1構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析得知，TaUV1與未分類的FvV1、FvV2、TaMV1、MpRV2、FpV2、FpV3、FgV3、SsRV-L和BcRV1聚成一簇，屬于Unassigned Virus科病毒。Unassigned Virus科病毒的特點：1)具有大的單一未分段病毒基因組；2)編碼2個大的閱讀框；3)2個閱讀框之間存在-1核糖體移碼現(xiàn)象，將2個大的閱讀框融合成1個閱讀框。

研究明確了TaUV1的基因組結(jié)構(gòu)和分類地位，下一步計劃獲取棘孢木霉菌株的脫毒菌株(TaUV1-)，與未脫毒的菌株(TaUV1+)同時培養(yǎng)，檢測兩者在生長速度、表型、次級代謝產(chǎn)物的異同，初步了解TaUV1的存在是否對其寄主有影響，以及對TaUV1與棘孢木霉菌株的互作關(guān)系進行初步研究。