張文天，劉杰，杜錦波

滄州市人民醫(yī)院，河北滄州 061000

結(jié)直腸癌是源自腸道上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中分別居第三位和第四位，對人類生命安全造成巨大危害[1]。結(jié)直腸癌起病隱匿，初期常無特異癥狀且易轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者確診時癌癥已經(jīng)處于進展期，手術(shù)效果較差，病死率和復發(fā)率均較高[2]。因此，進一步探尋結(jié)直腸癌的病變機制及關(guān)鍵靶點對研發(fā)靶向藥物和早期篩查至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)是一類在真核生物中常見的非編碼RNA，其與3′非翻譯區(qū)結(jié)合后能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄及翻譯過程，參與細胞增殖和凋亡等[3]。miR-92b-3p屬于miR-25家族，參與合成mRNA-蛋白復合物，在細胞周期中調(diào)控G1/S期，進而促進腫瘤細胞增殖[4]。相關(guān)研究[5]表明，miR-92b-3p在多種癌組織中表達上調(diào)，通過介導PI3K/Akt通路促進癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移。FBXW7是一種抑癌基因，位于4號染色體q31，其表達缺失或功能紊亂可以導致染色體不穩(wěn)及腫瘤發(fā)生率提高[6]。FBXW7主要受蛋白激酶C調(diào)控，通過靶向泛素化使多種轉(zhuǎn)錄激活因子及其癌蛋白失活，在腫瘤轉(zhuǎn)移、輔助診斷以及耐藥性等方面具有重要作用[7]。但miR-92b-3p和FBXW7在結(jié)直腸癌中的研究較少。因此，本研究觀察了結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p和FBXW7的表達情況，并探討其臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年4月～2019年5月我院收治的153例結(jié)直腸癌患者。納入標準：所有患者診斷符合《世界衛(wèi)生組織腫瘤分類診斷系統(tǒng)》[8]中的標準且經(jīng)術(shù)后病理確診為結(jié)直腸腺癌；均首次診斷為結(jié)直腸癌，且既往未接受過腸道手術(shù)或放化療；患者基本信息及病理資料完整，且同意配合本次試驗。排除標準：合并肛周瘺口、結(jié)腸穿孔、克羅恩病以及腸道結(jié)核等嚴重腸道疾病者；伴有其他原發(fā)惡性腫瘤(如膠質(zhì)瘤、胃癌以及乳腺癌等)者；肝腎功能失代償者；伴有先天遺傳缺陷者。其中男83例、女70例，年齡(56.29±8.51)歲；高分化89例、中分化51例、低分化13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移128例；臨床分期Ⅰ期63例、Ⅱ期60例、Ⅲ期21例、Ⅳ期9例；腫瘤直徑≤5 cm者81例，>5 cm者72例；有遠處轉(zhuǎn)移19例，無遠處轉(zhuǎn)移134例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p、FBXW7表達檢測 采用實時熒光定量PCR技術(shù)。術(shù)中分別采集癌組織及其癌旁5 cm處正常結(jié)腸組織，先在液氮中暫存，術(shù)后統(tǒng)一置于-80 ℃冰箱中。以上組織各取50 mg，先于冰上研磨，然后各加入1 mL TRIzol試劑(Invitrogen公司，批號:20170326)，依照操作規(guī)范提取總RNA。采用RT Enzyme Mix(Abcam公司，批號:20170322)將提取的10 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green Mix試劑盒(Thermo公司，批號20170329)定量檢測miR-92b-3p和FBXW7。反轉(zhuǎn)錄時miR-92b-3p和FBXW7的反應條件均為42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。miR-92b-3p的正向引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTATTGCACTCGTCCCGGC-3′、反向引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGAGGCC-3′;內(nèi)參基因U6的正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；FBXW7正向引物序列為5′-CGAACTCCAGTAGTATTGTGGACCT-3′、反向引物序列為5′-TTCTTTTCATTTTTGTTGTTTTTGTATAGA-3′;內(nèi)參基因GAPDH正向引物序列為5′-GCCGCATCTTCTTTTGCGTCGC-3′、反向引物序列為5′-TCCCGTTCTCAGCCTTGACGGT-3′。以上引物序列均由上海生工生物公司合成。miR-92b-3p和FBXW7的PCR反應體系為SYBR Green Mix 10 μL、正反向引物均為1 μL、dH2O 8 μL、cDNA template 1 μL，共計20 μL。miR-92b-3p和FBXW7的PCR反應條件均為預變性95 ℃ 2 min、變性94 ℃ 20 s、退火58 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 20 s，共計40個循環(huán)，每個樣本均測量3次。以2-ΔΔCt法計算miR-92b-3p和FBXW7的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織中miR-92b-3p、FBXW7表達比較 結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織中miR-92b-3p的相對表達量分別為7.82±1.53、1.69±0.71，而FBXW7的相對表達量分別為0.36±0.13、0.98±0.42。結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p相對表達量較癌旁正常組織高，F(xiàn)BXW7的相對表達量較癌旁正常組織低(t=44.954、17.443，P均<0.01)。

2.2 miR-92b-3p、FBXW7表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 miR-92b-3p、FBXW7表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p和FBXW7表達的相關(guān)性 結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p和FBXW7的表達呈負相關(guān)(r=-0.751，P=0.000)。

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其年均新增病例約140萬，且病死率在癌癥中位居第四位，對人類健康造成巨大危害[9]?；蛞赘行浴⒓易暹z傳、飲食習慣以及地域差異均能夠影響結(jié)直腸癌的發(fā)生。手術(shù)聯(lián)合化療是目前治療結(jié)直腸癌的常見手段，但由于早期診斷困難、癌癥易轉(zhuǎn)移和復發(fā)，因此療效較差。據(jù)相關(guān)研究[10]報道，早期診斷的結(jié)直腸癌患者5年存活率約為90%，然而，癌胚抗原(CEA)及糖類抗原(CA19-9)等腫瘤標志物的敏感度和特異性均較低，因此深入發(fā)掘結(jié)直腸癌病變機制及找尋關(guān)鍵靶點對早期診斷和延長患者生存時間意義重大。隨著表觀遺傳學和分子生物學的不斷發(fā)展，非編碼RNA、DNA甲基化、DNA磷酸化以及組蛋白修飾等過程均被證明能夠使信號傳導通路異常，使原癌基因和抑癌基因功能紊亂，在腫瘤發(fā)生及進展中起重要作用[11,12]。

miRNA是由18～25個核苷酸組成的短鏈小RNA，其不能編碼蛋白質(zhì)且具有高度保守性，但能夠結(jié)合3′端的非編碼區(qū)對細胞分化、增殖及遷移等過程起到調(diào)控作用。miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡比較復雜，其序列突變、表達異常以及甲基化均會導致miRNA功能失調(diào)，進而使細胞增殖、分化及凋亡等過程發(fā)生紊亂，增加正常細胞演變?yōu)槟[瘤細胞的概率[13]。miR-92b屬于miR-25家族，由miR-92b-3p和miR-92b-5p兩條miRNA分子組成，其中miR-92b-3p能夠進入mRISC中進而促進miRNA成熟[14]。既往研究[15]表明，miR-92b-3p能夠通過抑制其靶基因p57，從而導致許多抑癌基因甲基化，使癌細胞異常增殖。本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p的相對表達量較癌旁正常組織高，其原因可能為癌組織中的原癌基因c-myc表達上調(diào)，通過結(jié)合miR-92b-3p啟動子區(qū)域的E-box位點誘導miR-92b-3p表達，使miR-92b-3p表達提高[16]。本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p的表達與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，且惡性度越高，其表達量越高。其機制可能為miR-92b-3p通過抑制抑癌基因NLK和DKK3，進而調(diào)節(jié)Wnt/Beta-catenin信號通路，增強癌細胞的增殖及侵襲能力[17]。當抑制miR-92b-3p時，癌細胞的細胞周期受阻，癌細胞的克隆和增殖能力減弱[17]，表明miR-92b-3p對癌癥的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移起促進作用。

FBXW7屬于F-box蛋白家族，由F-box結(jié)構(gòu)域、D結(jié)構(gòu)域以及WD40重復序列組成，可以通過連接SKP1并結(jié)合SCF復合物，使多種靶蛋白泛素化及降解。既往研究[18]表明，c-myc、Notch、細胞周期蛋白E(cyclin E)以及Presenilin等基因均是SCF FBXW7 E3連接酶的底物，通過調(diào)控其表達使FBXW7在細胞分裂、分化及維持細胞干性等途徑中起關(guān)鍵作用，降低細胞癌變的風險。本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中FBXW7的相對表達量較癌旁正常組織低，其原因可能為癌細胞的基因缺失、基因突變以及啟動子甲基化相互作用，共同導致癌組織中的FBXW7表達下調(diào)[19]。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)BXW7的表達與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，且惡性度越高，其表達越低，表明FBXW7能夠抑制惡性腫瘤進展，且可能作為判斷病情程度的依據(jù)。其原因可能為FBXW7的外顯子能夠直接結(jié)合p53，使蛋白酶通過泛素化靶向降解多種原癌基因產(chǎn)物，抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡，最終阻斷或延緩癌細胞侵襲或轉(zhuǎn)移[18]。此外，F(xiàn)BXW7還可以抑制cyclin E，維持染色體相對穩(wěn)定，避免染色體損傷或發(fā)生基因突變，而在癌組織中，F(xiàn)BXW7表達下降，對cyclin E的負性調(diào)控能力減弱，進而使癌細胞易于分化及侵襲[20]。

本研究結(jié)果顯示，癌組織中的miR-92b-3p和FBXW7表達呈負相關(guān)，表明miR-92b-3p可能靶向調(diào)控FBXW7，使其表達下調(diào)從而促進腫瘤形成和進展。其機制可能為miR-92b能夠結(jié)合FBXW7的3′非編碼區(qū)，進而抑制其表達，加速癌細胞侵襲。c-myc與FBXW7呈負反饋調(diào)節(jié)，而c-myc則可以誘導miR-92b-3p表達，間接表明miR-92b-3p與FBXW7呈負相關(guān)[21]。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中miR-92b-3p表達增加，而FBXW7表達降低，二者均與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分化程度有關(guān)，未來可能作為臨床評估患者病情進展程度及藥物治療的靶點。