白紅娟，孫慧敏，張 晴

（中北大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，山西 太原 030051）

1 引言

對硝基酚（p?nitrophenol，PNP）作為重要的工業(yè)原料廣泛應(yīng)用于制造炸藥、染料、殺蟲劑、藥物和合成材料等領(lǐng)域［1］。研究報(bào)到了有關(guān)PNP 對人、動(dòng)物和真菌會(huì)產(chǎn)生毒性，使人和動(dòng)物血液中的高鐵血紅蛋白含量升高，導(dǎo)致血液攜帶氧氣能力下降［2］；在釀酒發(fā)酵過程中酵母受PNP 誘導(dǎo)，會(huì)引起基因重組或進(jìn)行有絲分裂［3］。美國環(huán)保署已將PNP 歸為優(yōu)先控制有毒污染物［4］。

目前研究報(bào)道的微生物降解PNP 的代謝途徑主要有兩條，一條途徑是將PNP轉(zhuǎn)化為4?硝基兒茶酚再進(jìn)行開環(huán)，該降解途徑為偏苯三酚代謝途徑（1，2，4?Benzene?triol，BT）；另一條途徑是將PNP 轉(zhuǎn)化為對苯二醌，再通過對苯二酚（Hydroquinone，HQ）開環(huán)，該降解途徑為對苯二酚代謝途徑。已報(bào)道的Moraxella sp.［5］、Pseu?domonas sp.1?7［6］和Pseudomonas sp.WBC?3［7］菌 屬均利用HQ 途徑代謝，而Pseudomonas putida.［8］和Ar?throbacter sp.JS443［9］菌 株 利 用BT 途 徑 代 謝。不 同 的微生物降解PNP 時(shí)所生成的代謝產(chǎn)物不同，因此，其降解途徑也不同。研究具有較好環(huán)境適應(yīng)性的降解菌能夠?yàn)樯锝到饧碍h(huán)境修復(fù)等相關(guān)生物技術(shù)提供重要的菌種資源。

光合細(xì)菌能在厭氧光照條件下進(jìn)行不放氧光合作用，特別是紫色非硫細(xì)菌如球形紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）不僅能在厭氧光照的條件下進(jìn)行光能異養(yǎng)生長，而且能在好氧黑暗條件下進(jìn)行好氧異養(yǎng)生長。光合細(xì)菌這種隨著生存環(huán)境而靈活地改變代謝類型的特性，使其較其它微生物材料具有優(yōu)越性。本課題 組 前 期 研 究 表 明［10］，球 形 紅 細(xì) 菌（Rhodobacter sphaeroides）H 菌 株 能 在168 h 降 解PNP 達(dá) 到91.1%，具有高效降解PNP 的作用，由于尚未系統(tǒng)開展該菌株對PNP 降解特性的研究，不能完全揭示其對PNP 的降解途徑，同時(shí)，不同菌株降解酚類的能力與碳源［11］、金屬離 子［12］和NaCl 濃度［13］等營養(yǎng)因素有很大關(guān)系，為此，本研究對影響球形紅細(xì)菌H 菌株降解PNP 的營養(yǎng)因素及降解PNP 的中間產(chǎn)物進(jìn)行研究，為完善PNP 的降解途徑及其在環(huán)境中對PNP 的降解應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

2 材料與實(shí)驗(yàn)

2.1 試劑及儀器

試 劑：對 硝 基 苯 酚（p?nitrophenol，PNP，純 度98%），購自天津市凱通化學(xué)試劑公司；蘋果酸、酵母膏、（NH4）2SO4均為分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

主要儀器：人工氣候箱（KRQ?300 型，上海德州市昊誠實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；可見分光光度計(jì)（UV2100型，上海龍尼柯儀器有限公司）；超聲波細(xì)胞破碎儀（JY92?II 型，寧波新芝科學(xué)器材研究所）；Heal Force 高速冷凍離心機(jī)（Neofuge 15R 型，上海力申科學(xué)設(shè)備有限公司）；電泳儀（DYCZ?24A 型，北京六一生物科技有限公司）；紫外分光光度計(jì)（UV2902PC 型，上海亞津電子科技有限公司）；島津高效液相質(zhì)譜儀（HPLC/MS?QP5050A 型，上海澤百機(jī)電設(shè)備有限公司）。

2.2 菌種及培養(yǎng)

菌 株：球 形 紅 細(xì) 菌（Rhodobacter sphaeroides）H 菌株系紫色非硫菌群紅細(xì)菌屬光合細(xì)菌，由山西大學(xué)光合細(xì)菌研究室分離、鑒定并保存［10］。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蘋果酸2.5 g、酵母膏1.0 g、（NH4）2SO41.25 g、MgSO40.2 g、CaCl20.07 g、K2HPO40.9 g、KH2PO40.6 g、蒸餾水1000 mL。

H 菌株馴化培養(yǎng)：將15%原始菌液接入PNP 含量為80 mg·L-1的馴化培養(yǎng)基，在30 ℃、2500 lx 人工氣候箱中厭氧馴化培養(yǎng)10 d 作為馴化菌種。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 H 菌株生長及PNP 降解特性實(shí)驗(yàn)

（1）H 菌株降解PNP 生長動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

在 含 不 同 濃 度PNP（50、80、100 mg·L-1和130 mg·L-1）的液體培養(yǎng)基［14］，接種一定量的指數(shù)生長期的菌體培養(yǎng)液（OD590nm為0.182），置于光照強(qiáng)度為2500 lx，溫度為30 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)，每隔24 h取樣，離心10 min（8000 rpm），棄上清液，將細(xì)胞沉淀重懸于5 mL 去離子水中，在OD590nm測定生物量。

（2）不同營養(yǎng)因素對H 菌株降解PNP 的影響實(shí)驗(yàn)

a. 不同種類碳源、金屬離子和NaCl 濃度對PNP降解的影響實(shí)驗(yàn)

在PNP 濃度為80 mg·L-1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種H 菌株（OD590nm為0.182），分別考察不同碳源（蔗糖、乳糖、葡萄糖和麥芽糖）、NaCl 濃度（0、10、20、30、40 g·L-1和50 g·L-1）和 金 屬 離 子（CaCl2、CuSO4、FeSO4、MnSO4、ZnSO4和KCl）對PNP 的去除及菌株生長的影響。規(guī)定條件為：碳源為蘋果酸、不加NaCl 和金屬離子CaCl2，實(shí)驗(yàn)過程中，改變1 個(gè)影響因素，固定其它2 個(gè)條件，進(jìn)而確定最適的生長與降解條件。在30 ℃人工氣候箱培養(yǎng)，7 d 后取樣5 mL，在8000 rpm下離心10 min，用可見分光光度計(jì)（UV2100 型）測定上清液中殘留的PNP 含量OD400nm，將細(xì)胞沉淀重懸于5 mL 蒸餾水，測H 菌株生物量OD590nm［15］。

b. 不同因素對H 菌株產(chǎn)生酶蛋白的影響實(shí)驗(yàn)

依據(jù)上節(jié)中所得結(jié)果，選取對PNP 降解率影響較大的因素，將培養(yǎng)好的H 菌株制備成粗酶液進(jìn)行SDS?PAGE 實(shí)驗(yàn)。分別在以下8 種不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)H 菌 株：不 添 加PNP、添 加80 mg·L?1PNP、添 加0.07 g·L-1的FeSO4、MnSO4、ZnSO4和KCl、添 加20 mg·L?1的NaCl、添 加2.5 g·L-1的 蔗 糖，生 物 量OD590nm約2.0 時(shí)取樣。參照文獻(xiàn)［16］的方法，制備粗酶液。將樣品在8000 rpm 下離心10 min 收集H 菌株細(xì) 胞，用0.1 mol·L-1pH 7.5 的Tris?HCl 緩 沖 液 洗 滌2 次，將其重懸于1 mL 緩沖液，在冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞，時(shí)間20 min（每次間隔3 s 破碎1 s），之后在高速冷凍離心機(jī)中10000 rpm 離心10 min，棄沉淀，上清液即為細(xì)胞粗酶液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻(xiàn)［17］的方法，對粗酶液中酶蛋白含量進(jìn)行研究。其中實(shí)驗(yàn)條件為在垂直電泳裝置中，加入質(zhì)量濃度為12%的分離膠和質(zhì)量濃度為4%的濃縮膠，在點(diǎn)樣孔加入樣品30 μL（15 μL 的樣品，15 μL 的SDS上樣緩沖液，煮沸2 min）。先恒壓100 V 樣品通過濃縮膠后再恒壓120 V，電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)G?250 染色，染色1 h 后，進(jìn)行脫色，直到背景變清晰后進(jìn)行拍照。

（3）不同酚類混合物對PNP 降解的影響實(shí)驗(yàn)

為研究不同酚類混合物對H 菌株降解PNP 的影響，實(shí)驗(yàn)選用鄰苯二酚（A）、甲苯酚（B）、苯酚（C）、對苯二酚（D）進(jìn)行研究，設(shè)置四個(gè)水平0、10、25和50 mg·L-1，使用SPSS 軟件［18］設(shè)計(jì)L16（44）正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案如表1 所示，在含PNP 濃度為80 mg·L-1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中依次添加不同酚類物質(zhì)，接種一定量的指數(shù)生長期的菌體培養(yǎng)液（OD590nm為0.182）測定PNP 降解率。

表1 不同酚類混合物對H 菌株降解PNP 影響的L16（44）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 L16（44）orthogonal experimental design and results of different phenolic mixtures on degradation of PNP by H Strain

2.3.2 H 菌株降解PNP 中間產(chǎn)物及酶活性測定實(shí)驗(yàn)

（1）H 菌株降解PNP 中間產(chǎn)物分離

在PNP 濃度為80 mg·L?1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種H菌株（OD590nm為0.182），在30 ℃、2500 Lx 人工氣候箱中培養(yǎng)。H 菌株生長到對數(shù)期（OD590nm約為0.6）后，每隔24 h 取樣，離心10 min（8000 rpm），取上清液倒入分液漏斗，用等體積乙酸乙酯進(jìn)行多次萃取，待分層后取上層有機(jī)相，將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至5 mL，過0.22 μm 濾膜，利用高效液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC?MS）檢測。

（2）酶活性測定實(shí)驗(yàn)

在PNP 濃度為80 mg·L-1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種H 菌株（OD590nm為0.182），培養(yǎng)至生物量OD590nm約2.0 時(shí)取樣，按照2.3.1（2）b 中的方法制備粗酶液。

a. 粗酶液活性分析

反應(yīng)體系中含有110 μM PNP，1.5 mM 還原性輔酶（NADH），50 mM Tris?HCl 緩沖液（pH 值為7.0），200 μL 粗 酶 液，終 體 積 為2 mL［19］。反 應(yīng) 從 加 入NADH 后開始，在30℃下反應(yīng)30 min，之后在90 ℃下加熱10 min 終止反應(yīng)。將樣品在10000 rpm 下離心10 min，利用UV2902PC 型紫外分光光度計(jì)掃描320～500 nm。

b. 對苯二酚1，2?雙加氧酶活性分析

反應(yīng)體系中含有10 μL HQ 二甲基甲酰胺（DMF）溶液（50 mM），100 μL 粗酶液（預(yù)先在10 mM 的FeSO4溶液中培養(yǎng)1 min），50 mM 的磷酸鹽緩沖溶液（pH 為7.0），終體積為1 mL［20］。反應(yīng)從加入粗酶液開始，在30 ℃下反應(yīng)60 min，之后在90 ℃下加熱10 min 終止反應(yīng)。將樣品在10000 rpm 下離心10 min，利用UV2902PC 型紫外分光光度計(jì)掃描260～350 nm。

2.4 分析方法

PNP 濃度的測定：

用UV2100 型可見分光光度計(jì)測定PNP 的殘留量［13］。PNP 降解率的計(jì)算公式如下：

式中，η為降解率，%；C0為初始濃度，mg·L-1；C為剩余濃度，mg·L-1。

PNP 降解中間產(chǎn)物檢測：利用HPLC?MS 對樣品進(jìn)行檢測，質(zhì)譜配置電噴霧電離源（ESI），以100%甲醇作為流動(dòng)相，流速0.2 mL·min-1，采用直接注射進(jìn)樣1 μL，負(fù)離子模式進(jìn)行電擊，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，載氣（325 ℃）為高純氮?dú)猓?9.999%），流速為8 L·min-1，產(chǎn)生的負(fù)離子通過掃描模式進(jìn)行檢測，通過Mass hunter（vA.02.00）對數(shù)據(jù)進(jìn)行收集及分析［8］。

3 結(jié)果與分析

3.1 H 菌株生長及PNP 降解特性研究

3.1.1 H 菌株降解PNP 生長動(dòng)力學(xué)

在不同PNP濃度（50、80、100 mg·L-1和130 mg·L-1）下，測得H 菌株生長量隨時(shí)間變化如圖1 所示。由圖1 可知，隨著底物PNP 濃度的增加，H 菌株的生長趨勢逐漸變緩。

圖1 不同PNP 濃度下H 菌株的生長曲線Fig.1 Growth curve of H strain under the different PNP con?centration

建立生長動(dòng)力學(xué)模型對H 菌株的理論研究和實(shí)際應(yīng)用都有重要意義。參照文獻(xiàn)［15］的方法采用Haldane 模型［21］，分析PNP 濃度對H 菌株生長量的抑制作用。首先利用式（2）計(jì)算出不同濃度下對應(yīng)的比生長速率，然后通過Haldane 生長抑制模型式（3），模擬H 菌株在不同初始PNP 濃度下的生長動(dòng)力學(xué)過程。方程如下所示：

式 中，μ為 比 生 長 速 率，h-1；μmax為 最 大 比 生 長 速 率，h-1；S為底物飽和濃度，mg·L-1；Ks為飽和常數(shù)；Ki為抑制常數(shù)。

通過origin 8.0 軟件［22］利用非線性最小二乘法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可以看出，隨著PNP 濃度的升高，比生長速率先上升后下降，H 菌株為典型的抑制生長模式。PNP 濃度為80 mg·L-1時(shí)，比生長速率達(dá)到最大0.043 h-1；PNP 濃度大于100 mg·L-1后，比生長速率開始下降。分析原因，由于培養(yǎng)基中PNP 濃度過高以及代謝過程中產(chǎn)生有毒物質(zhì)的積累，導(dǎo)致H 菌株的生長量遞減，底物PNP 的抑制作用遞增。結(jié)果表明，PNP 濃度高于100 mg·L-1，對H 菌株生長產(chǎn)生明顯抑制作用［23］。

圖2 PNP 為底物H 菌株比生長速率與Haldane 模型擬合曲線Fig.2 Fitting curve between specific growth rate of H strain with PNP as substrate and Haldane model

H 菌株降解PNP 過程中的細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：最 大 比 生 長 速 率μmax為0.189，抑 制 常 數(shù)Ki為125.09 mg·L-1，半 飽 和 常 數(shù)Ks為41.56 mg·L-1，擬 合參數(shù)R2為0.999 表明Haldane 動(dòng)力學(xué)模型的擬合度良好。因此，生長動(dòng)力學(xué)方程為：

3.1.2 不同營養(yǎng)因素對H 菌株生長量及PNP 降解的影響

（1）不同種類碳源的影響

PNP 有毒性且苯環(huán)上存在硝基而不易被微生物降解，需要補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)H 菌株生長和PNP 降解。為此，選用蘋果酸、乳糖、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖5種營養(yǎng)物質(zhì)作為碳源，研究不同種類碳源對H 菌株生長和PNP 降解的影響，見圖3。由圖3 可以看出，添加蘋果酸H 菌株降解率為91.0%，生長量OD590nm為2.151。添加不同種類碳源對PNP 降解的影響依次是：蘋果酸＞乳糖＞葡萄糖＞麥芽糖＞蔗糖，降解率分別為91.0%、60.0%、31.8%、24.4%和10.6%，H 菌株生長量OD590nm分別為1.255、0.932、1.074 和1.059。表明，碳源對H 菌株生長和PNP 降解影響較大，其中蔗糖對H 菌株降解PNP 的抑制作用最強(qiáng)，添加蘋果酸效果最佳能提高H 菌株對PNP 降解能力，提供H 菌株生長所需碳源和能源［24］。

圖3 5 種碳源對H 菌株生長和PNP 降解的影響Fig.3 Effects of five nutrition factors on the degradation rate of PNP

（2）不同濃度NaCl 的影響

圖4 為不同濃度的NaCl 對H 菌株生長和PNP 降解的影響，由圖4 可以看出，培養(yǎng)基中不添加NaCl 菌株生長和降解率最好；當(dāng)NaCl 濃度為10 mg·L-1和20 mg·L-1時(shí)，PNP 降解率為88.2%和60.0%，生長量OD590nm為 2.142 和 0.704；NaCl 濃 度 升 高 到20 mg·L-1后，隨著濃度升高PNP 降解率逐漸下降，而生長量基本保持不變。結(jié)果表明，NaCl 濃度在10 mg·L-1以 內(nèi) 對H 菌 株 影 響 較 小，NaCl 濃 度 達(dá) 到20 mg·L-1以后，降解率與NaCl 濃度呈負(fù)相關(guān)，而生長量能夠維持在一定水平。因此，NaCl 濃度升至20 mg·L-1后，由于NaCl 濃度升高導(dǎo)致H 菌株的細(xì)胞脫水，引起蛋白質(zhì)變性失活、酶蛋白減少［25］，進(jìn)而降低PNP 降解率。

圖4 不同濃度的NaCl 對H 菌株生長和PNP 降解的影響Fig.4 Effects of different concentrations of NaCl on the growth of H strain and PNP degradation

（3）不同金屬離子對H 菌株降解PNP 的影響

圖5 為不同金屬離子對H 菌株生長和降解PNP 的影響，由圖5 可以看出，不添加金屬離子的空白對照實(shí)驗(yàn)中，PNP 降解率為82.3%，生長量OD590nm為2.195；添加Ca2+、K+和Fe2+時(shí)，降解率分別為91.0%、88.0%和87.6%，生長量OD590nm為2.201、2.170 和2.082；與對照實(shí)驗(yàn)相比這幾種離子不同程度促進(jìn)H 菌株生長代謝。添加Mn2+時(shí)，PNP 降解率為77.4%，生長量OD590nm為1.960，比對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果略低。添加Zn2+和Cu2+時(shí)，PNP 降解率分別為60.3%和15.9%，生長量OD590nm為1.422 和0.410，與對照實(shí)驗(yàn)相比均抑制H菌株生長代謝，并且Cu2+抑制作用更強(qiáng)。結(jié)果表明，不同種類金屬離子對PNP 降解和H 菌株生長影響程度不同，其中Ca2+、Fe2+離子促進(jìn)作用明顯，與Young Gyun Cho 等人［26］研究結(jié)論一致，由于Ca2+可以提高脫氫酶活性，促進(jìn)了降解中4?HS 轉(zhuǎn)變?yōu)镸A，F(xiàn)e2+可以提高雙加氧酶活性，促進(jìn)降解中HQ 轉(zhuǎn)變成4?HS，從而提高H 菌株生長和PNP 降解；Cu2+對菌株產(chǎn)生抑制作用明顯，這與文獻(xiàn)［27］的結(jié)果相同。

3.1.3 不同因素對H 菌株產(chǎn)生酶蛋白的影響

依據(jù)以上實(shí)驗(yàn)分別選?。禾荚粗袑到饴室种菩宰顝?qiáng)的蔗糖，NaCl 濃度上升為20 mg·L-1降解率明顯開始受到抑制，除Cu2+外的不同種類金屬離子（Cu2+抑制H 菌株生長無法制備粗酶液），研究這些因素對H菌株產(chǎn)生酶蛋白含量的影響。圖6 為不同因素下H 菌株全細(xì)胞蛋白電泳，其中M 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量條帶。由圖6 可以看出，各個(gè)泳道的蛋白分子量主要分布在26～120 KD，并且條帶之間存在一定差異。泳道1、5、6、7 和8 蛋白條帶清晰且顏色較深，說明酶蛋白含量較高，此處與圖5 中PNP 降解結(jié)果一致；泳道2、3、4 和9 蛋白條帶顏色較淺，說明蛋白含量相對較少，此處與圖3、4 和5 中PNP 降解結(jié)果一致。因此，不同因素會(huì)影響H 菌 株酶蛋白產(chǎn)量［28］，進(jìn)而 影響PNP 降解率。

圖5 不同金屬離子對H 菌株生長和降解PNP 的影響Fig.5 Growth of H strain by different metal ions effect of PNP degradation

圖6 不同因素下H 菌株全細(xì)胞蛋白電泳Fig.6 Whole cell protein electrophoresis of H strain underdifferent factors

應(yīng) 用Image J 軟 件［19］分 析 泳 道 中 分 子 質(zhì) 量 為90 KD 蛋白條帶的灰度值，結(jié)果如下表2 所示，泳道3和4 中灰度值（gray value）分別為6620 和2952，蛋白含量明顯較少；結(jié)果表明，添加20 mg·L-1的NaCl 和蔗糖均會(huì)抑制90 KD 酶蛋白產(chǎn)生。

表2 不同因素下H 菌株蛋白條帶灰度值比較Table 2 Comparison of gray value of protein bands of strain H under different factors

3.1.4 不同酚類混合物對H 菌株降解PNP 的影響

分析不同酚類物質(zhì)對H 菌株降解PNP 的影響，選取四種酚類物質(zhì)進(jìn)行研究，并參考文獻(xiàn)［29］中細(xì)菌能降解這四種物質(zhì)。利用SPSS 軟件［18］對正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，表3 中R2為0.993 調(diào)整后為0.982，表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型的擬合程度良好。概率P值（sig.）小于0.05 時(shí)說明影響顯著，P值大于0.05 時(shí)說明無顯著影響。因 素A、B、C和D的 概 率P值 分 別 為：0.025、0.197、0.153 和0.058，說明只有A對降解率造成了顯著影響，B、C和D對降解率無顯著影響。四種酚類物質(zhì)對PNP 降解效率影響強(qiáng)弱：A>D>C>B，即鄰苯二酚對PNP 降解影響顯著。

表3 不同酚類混合物對H 菌株降解PNP 影響的L16（44）正交實(shí)驗(yàn)的方差分析Table 3 Variance analysis of L16（44） orthogonal experi?ment on effect of nitrophenol mixture on degradation of PNP by H strain

3.2 H 菌株降解PNP 酶活性分析及代謝途徑推測

3.2.1 HPLC?MS 檢測中間產(chǎn)物

對H 菌株降解PNP 的樣品進(jìn)行HPLC?MS 檢測，得到H 菌株降解PNP 過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物種類，結(jié)果見圖7a。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)［30-31］和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（Chemistry Database），根據(jù)質(zhì)荷比確定中間產(chǎn)物種類。由圖7a 可以看出，中間產(chǎn)物包含：對硝基苯酚（PNP）吸收峰（m/z=138.0）、對苯二酚（HQ）吸收峰（m/z=111.2）、4?羥基粘糠酸半醛（4?HS）吸收峰（m/z=143.0）和馬來酰胺乙酸（MA）吸收峰（m/z=157.8）。圖7b 為H 菌株降解PNP 的可能代謝途徑（括號中的物質(zhì)未檢測出），由圖7b 可以看出，PNP 在酶催化作用下先脫硝基生成對苯二醌，然后在還原酶的作用下對苯二醌生成HQ，HQ 在雙加氧酶的作用下生成4?HS，最后，在脫氫酶的作用下4?HS 生成MA，最終進(jìn)入TCA循環(huán)，即對苯二酚代謝途徑［6］。

圖7 H 菌株降解PNP 中間產(chǎn)物檢測和可能的代謝途徑分析Fig.7 Detection and metabolic pathway analysis of PNP in?termediate degradation by H strain

3.2.2 酶活性分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)H 菌株利用對苯二酚代謝途徑，在以上中間產(chǎn)物檢測分析的基礎(chǔ)上，測定代謝過程中產(chǎn)生酶的活性，即：粗酶液和對苯二酚1，2?雙加氧酶活性。

（1）粗酶液酶活性分析

圖8a為對照實(shí)驗(yàn)H 菌株未經(jīng)PNP 誘導(dǎo)產(chǎn)生的粗酶液活性，由圖8a可以看出，反應(yīng)30 min后在400 nm 處，吸收峰值下降0.0572。圖8b 為經(jīng)過PNP 誘導(dǎo)H 菌株產(chǎn)生粗酶液活性測定，由圖8b 可以看出，在400 nm 處吸收峰值下降0.5859。結(jié)果表明，經(jīng)過PNP 誘導(dǎo)H 菌株產(chǎn)生的粗酶液可以降解PNP，粗酶液具有活性。

圖8 H 菌株粗酶液活性測定Fig.8 Determination of crude enzyme activity of strain H

（2）對苯二酚1，2?雙加氧酶活性分析

進(jìn)一步研究粗酶液中HQ 1，2?雙加氧酶的活性。參考文獻(xiàn)［32］分別在0、30、60 min 檢測得到如圖9 結(jié)果，HQ 的最大特征吸收峰在289 nm 處，4?HS 的最大特征吸收峰為320 nm。圖9a 為對照實(shí)驗(yàn)未經(jīng)過PNP誘導(dǎo)H 菌株產(chǎn)生的粗酶液降解HQ，由圖9a 可以看出，吸收峰基本沒有變化（圖9a 中檢測的三條曲線基本重合）。圖9b 為H 菌株經(jīng)PNP 誘導(dǎo)后產(chǎn)生的粗酶液降解HQ，由圖9b 可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行HQ 在289 nm 處的吸收峰逐漸向320 nm 偏移，由于反應(yīng)中4?HS 積累引起320 nm 處曲線上移，表明在對苯二酚1，2?雙加氧酶作用下HQ 轉(zhuǎn)化為4?HS。

圖9 H 菌株粗酶液中HQ1，2?雙加氧酶活性Fig.9 Hydroquinone 1，2?dioxygenase activity in crude en?zyme solution of strain H

根據(jù)以上HPLC?MS 測定中間產(chǎn)物和酶活性分析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［8］：細(xì)菌降解PNP 代謝途徑可以按照革蘭氏陽性菌和陰性菌進(jìn)行劃分，革蘭氏陰性菌中多存在對苯二酚代謝途徑，本研究選用的H 菌株屬于革蘭氏陰性菌。因此，推測H 菌株降解PNP 利用對苯二酚代謝途徑。

4 結(jié)論

（1）PNP 抑制H 菌株的生長動(dòng)力學(xué)符合Haldane方程（R2為0.9990），最大比生長速率μmax為0.189，抑制常數(shù)Ki為125.09 mg·L-1。

（2）不同營養(yǎng)因素（碳源、金屬離子和NaCl 濃度）對H 菌株降解PNP 影響實(shí)驗(yàn)表明，蘋果酸為最適碳源，Ca2+促進(jìn)作用明顯，NaCl 濃度高于20 mg·L-1降解率開始下降；通過SDS?PAGE 分析酶蛋白含量，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加20 mg·L-1NaCl 及碳源蔗糖時(shí)，均抑制H 菌株產(chǎn)生90 KD 的酶蛋白。此外，四種酚類物質(zhì)對PNP 降解效率影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋亨彵蕉?對苯二酚>苯酚>甲苯酚，即：鄰苯二酚對PNP 降解影響較顯著。

（3）通過HPLC?MS 檢測出的主要代謝中間產(chǎn)物為：對苯二酚（HQ）、4?羥基粘糠酸半醛（4?HS）和馬來酰胺乙酸（MA），同時(shí)，酶活性分析表明HQ 在對苯二酚1，2?雙加氧酶作用下生成4?HS，由此推測H 菌株按照革蘭氏陰性菌途徑降解PNP，即：對苯二酚代謝途徑。