李陽春，王昭萍，馬培振，張學(xué)開，范 超，崔玉婷

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

鹽度是影響海洋生物生長(zhǎng)存活的重要環(huán)境因子，作為具有滲透生理適應(yīng)性的生物，貝類對(duì)鹽度變化的適應(yīng)范圍很廣[1]。然而，鹽度的驟變?nèi)詴?huì)對(duì)貝類產(chǎn)生多方面的不利影響，例如，妨礙其正常的攝食、呼吸，影響心跳、鰓纖毛運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致其血淋巴鈉離子濃度降低、免疫功能受到抑制等，最終使得貝類生長(zhǎng)緩慢、死亡率升高[2-6]。

貝類增養(yǎng)殖在國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中都占有重要地位，三倍體貝類以其生長(zhǎng)快、個(gè)體大、糖原含量高、繁殖季節(jié)肥滿度高、死亡率低[7]等優(yōu)點(diǎn)，具有極高的生產(chǎn)推廣價(jià)值。近年來，低鹽誘導(dǎo)三倍體的方法由于具有誘導(dǎo)率高、操作簡(jiǎn)便、無毒無害、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)[7-8]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[9]、海灣扇貝(Argopectenirradians)[10]、皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)[11]等多種貝類中開展了研究。低鹽誘導(dǎo)已被證明會(huì)顯著降低受精卵的卵裂率和孵化率[7]，然而其對(duì)貝類胚胎發(fā)育速度及發(fā)育過程中生理生化水平的影響尚未見報(bào)道。

牡蠣作為重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類類群,其總產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量在諸多貝類類群中均居首位(1)FAO Yearbook.Fishery and Aquaculture Statistics 2016.accessed 14 October 2018.http://www.fao.org/fishery/publications/yearbooks/en。本實(shí)驗(yàn)選取長(zhǎng)牡蠣為研究對(duì)象，探究了低滲誘導(dǎo)過程對(duì)其胚胎發(fā)育和發(fā)育初期部分酶活力的影響。由于能量代謝、抗氧化、滲透調(diào)節(jié)方面的改變都可能影響受精卵染色體的正確分離與細(xì)胞的正常分裂，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也能為進(jìn)一步探究低鹽誘導(dǎo)貝類三倍體的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用2齡親貝(殼長(zhǎng)8～15 cm)采自煙臺(tái)海益苗業(yè)有限公司，挑選外殼無損傷、活力好的個(gè)體，洗刷干凈待用。

1.2 方法

1.2.1 精卵獲取及受精 實(shí)驗(yàn)用海水為過濾自然海水(鹽度32，水溫23～25℃)，器械在操作前均用淡水清洗，嚴(yán)格防止精卵污染。親貝開殼后用牙簽挑取適量性腺鏡檢，區(qū)分雌雄。擠壓雌性親貝性腺取卵，卵液用200目篩絹過濾去除殘余組織，后用500目篩絹過濾沖洗2～3遍，浸泡50 min促熟，鏡檢，選取發(fā)育程度較好的卵子(卵內(nèi)物質(zhì)致密、卵子形狀近圓)混合，調(diào)整卵子密度為7 000～8 000個(gè)/mL[12]。受精前解剖取精子，300目篩絹過濾，浸泡10 min左右，挑選精子活力高的精液，以卵子∶精子=1∶(5～6)的比例進(jìn)行受精。精卵混合5～10 min后，用1 000目篩絹洗卵，去除多余精子，鏡檢觀察極體出現(xiàn)情況。

1.2.2 低鹽誘導(dǎo)處理及胚胎發(fā)育觀察 根據(jù)之前研究的結(jié)果，本研究采用的誘導(dǎo)時(shí)間為15 min；誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為40%～50%受精卵出現(xiàn)第一極體[7-8]，處理鹽度的范圍為4～18，每2個(gè)鹽度設(shè)立一個(gè)梯度。低鹽處理后轉(zhuǎn)入過濾自然海水(20 L小桶)中繼續(xù)培養(yǎng)，期間保持充氣，定期攪桶避免沉底，孵化期間定時(shí)取樣觀察胚胎發(fā)育情況，直至發(fā)育到D形幼蟲。發(fā)育時(shí)期判斷標(biāo)準(zhǔn)：80%幼蟲到達(dá)該時(shí)期為標(biāo)志，每次觀察至少3個(gè)視野，每個(gè)視野幼蟲個(gè)數(shù)50左右。

1.2.3 酶活測(cè)定 由于鹽度8為低鹽誘導(dǎo)長(zhǎng)牡蠣三倍體的最佳鹽度[7-8]，因此本研究也選擇鹽度8作為處理鹽度。測(cè)定的四種指標(biāo)分別為：丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)、Na+-K+-ATP酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic oxalacetic transaminase,GOT)和總抗氧化能力(Total- antioxidant capacity，T-AOC)。受精卵在經(jīng)低鹽誘導(dǎo)15 min后，處理組及對(duì)照組均平均分為兩份，一份立即離心取樣，另一份轉(zhuǎn)入自然海水中恢復(fù)1.5 h，再過濾離心取樣。實(shí)驗(yàn)所用測(cè)定試劑盒分別為：Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(去垢劑兼容型，碧云天，P0006C)，丙酮酸激酶(微量法，索萊寶，BC0545)，Na+-K+-ATP酶活性檢測(cè)試劑盒(微量法，索萊寶，BC0065)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性檢測(cè)試劑盒(微量法，索萊寶，BC1565)。具體測(cè)定方法參照說明書進(jìn)行，測(cè)定原理及酶活單位U的定義(按蛋白濃度計(jì)算)為：

(1)PK:可以催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化 NADH和丙酮酸生成乳酸和 NAD+，在340 nm下測(cè)定NADH下降速率，即可反映PK活性；定義每10 mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

(2)Na+-K+-ATPase:該酶能夠分解ATP生成ADP及無機(jī)磷，因此可以通過測(cè)定無機(jī)磷的量來確定ATP酶活性。定義每小時(shí)每毫克組織蛋白中Na+-K+-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

(3)T-AOC:酸性條件下，物質(zhì)還原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ的能力反映了其總抗氧化能力。樣品的抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度變化值(△A)所需的標(biāo)準(zhǔn)離子濃度表示。

(4)GOT:該酶可以催化天門冬氨酸和α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成草酰乙酸和谷氨酸，草酰乙酸脫羧生成丙酮酸，丙酮酸可與 2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成 2,4-二硝基苯腙，在堿性環(huán)境顯棕紅色，可以間接地代表GOT的活性。定義每小時(shí)每毫克組織蛋白催化產(chǎn)生1 μmol丙酮酸的量為一個(gè)GOT活力單位。

蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

Abs = 0.032 2+0.587 8×Conc(濃度單位為mg/mL，R2=0.992 7)。

測(cè)定儀器：酶標(biāo)儀(MultiskanTMFC,Thermo ScientificTM,USA)。

1.2.2與1.2.3中的實(shí)驗(yàn)均包含三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含三個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，配對(duì)樣本T檢驗(yàn)常用來推斷同一受試對(duì)象接受兩種不同的處理或某一指標(biāo)在兩種不同情況下總體的均值是否存在顯著差異[13]，因此本研究采用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)作為分析方法，差異顯著性閾值為0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 低鹽誘導(dǎo)對(duì)長(zhǎng)牡蠣胚胎發(fā)育的影響

受精卵經(jīng)低鹽誘導(dǎo)之后培育1 d，發(fā)育情況見表1。由表1中結(jié)果可得，本實(shí)驗(yàn)中牡蠣的發(fā)育較快，對(duì)照組19 h左右即到達(dá)D形幼蟲期，而一般情況下(水溫20～23 ℃)到達(dá)D形的時(shí)間普遍為23～24 h[14]，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)的孵化水溫較高(24～25 ℃)所致。同時(shí)，不同低鹽處理對(duì)受精卵胚胎發(fā)育不同時(shí)期的影響也不同：(1)二細(xì)胞期，所有組別的發(fā)育速度無顯著差異；(2)四細(xì)胞和囊胚期，不同處理鹽度發(fā)育速度出現(xiàn)明顯斷層：32、18、16>14、12、10、8 >6、4，說明鹽度18和16處理對(duì)受精卵發(fā)育沒有顯著抑制作用，鹽度8～14對(duì)受精卵發(fā)育的阻礙作用效果類似，且并未造成發(fā)育嚴(yán)重滯后(僅延緩0.5 h左右)，而鹽度4和6對(duì)受精卵發(fā)育的阻礙作用較為嚴(yán)重，滯后時(shí)間達(dá)到1 h左右；(3)原腸胚和D形幼蟲期，發(fā)育速度的大小為:32、18、16>14、12 >10、8>6>4，這與之前研究所得出的孵化率趨勢(shì)相吻合[7-8]，4組D形幼蟲期比對(duì)照組延緩了4 h以上，且孵化率極低(<10%)，說明較低鹽度的處理會(huì)對(duì)受精卵的孵化造成嚴(yán)重的阻礙。

表1 不同誘導(dǎo)鹽度下長(zhǎng)牡蠣的胚胎發(fā)育Table 1 Embryonic development under different inducing salinities

2.2 低鹽處理對(duì)長(zhǎng)牡蠣胚胎發(fā)育初期能量代謝、抗氧化及滲透調(diào)節(jié)的影響

2.2.1 低鹽處理15 min及恢復(fù)1.5 h后各種酶活性的改變 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)低鹽誘導(dǎo)15 min后處理組和對(duì)照組之間的酶活水平進(jìn)行比較，反映了低鹽處理對(duì)受精卵的即時(shí)影響；同時(shí)，由發(fā)育數(shù)據(jù)可看出，四細(xì)胞期(大約為處理完轉(zhuǎn)入自然海水恢復(fù)1.5 h左右)，各組發(fā)育速度雖無顯著差異，但鹽度4～12的處理組已經(jīng)開始表現(xiàn)出一定的發(fā)育遲緩，因此，本實(shí)驗(yàn)還選擇通過檢測(cè)此時(shí)期組間的酶活水平，來探究是否由于酶活變化導(dǎo)致此時(shí)期發(fā)育的遲緩，結(jié)果如圖1所示。

圖1中可看出，處理15 min后，PK和Na+-K+-ATP酶活性顯著降低，而T-AOC顯著增加(且達(dá)到極顯著水平)，GOT 無明顯改變；恢復(fù)1.5 h之后，除T-AOC外，所有酶的酶活水平在處理組和對(duì)照組之間皆無顯著差異，說明經(jīng)過一段時(shí)間的恢復(fù)，酶活水平也已基本恢復(fù)到正常的水平。對(duì)于T-AOC，處理組與對(duì)照組間雖存在差異，但并未到達(dá)極顯著水平，且兩組間T-AOC水平均值較為相近(S和CK組分別為：0.863±0.049、0.976±0.037)，這說明處理組T-AOC水平在1.5 h的恢復(fù)過程中發(fā)生了回落，逐漸接近對(duì)照組水平。

2.2.2 同種酶在處理組、對(duì)照組中不同發(fā)育時(shí)期的活性 為探究受精卵能量代謝、滲透調(diào)節(jié)及抗氧化能力與胚胎發(fā)育時(shí)期的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)分別比較了處理組和對(duì)照組中，上述4種酶的活性在處理15 min及恢復(fù)1.5 h后是否有顯著差異，結(jié)果見表2。從表2中可看出，所有指標(biāo)在CK-15 min組和CK-1.5 h組間均無顯著差異(P>0.05)，說明在對(duì)照組中這4種酶的酶活水平一直保持穩(wěn)定；而S-15 min組和S-1.5 h組中，Na+-K+-ATP酶水平顯著上升(P=0.032)，PK與T-AOC水平改變雖未達(dá)到顯著水平，但十分接近顯著性水平閾值(P值分別為0.057,0.055)說明在受精2h后，這3種酶的活性與處理15 min時(shí)相比發(fā)生了顯著的改變，且都基本恢復(fù)到與對(duì)照組類似的水平，說明在自然海水中恢復(fù)1.5 h后，上述4種酶的活性與對(duì)照組間水平基本相當(dāng)，這與2.2.1中得到的結(jié)果是一致的。從而說明，恢復(fù)1.5 h之后，酶活水平并不是造成受精卵發(fā)育遲緩的主要原因。

(S代表低鹽處理組，CK代表對(duì)照組；15 min代表處理后立即測(cè)定，1.5 h代表恢復(fù)后測(cè)定；S與CK同一時(shí)期的同種酶之間具有相同字母的差異不顯著(P>0.05)，具有不同字母者差異顯著(P>0.05),*表示差異極顯著(P<0.01)。S refers to the treatment group,CK refers to the control group.15 min means to measure the enzyme activities right after hypotonic treatment;1.5 h means to measure after recovering in normal sea water.Different letters indicate significant differences in certain enzyme activities between S and CK groups at 15 min and 1.5h respectively (P>0.05),* indicates the very significant difference (P<0.01).)圖1 處理15 min及恢復(fù)1.5 h酶活水平的比較Fig.1 Enzyme activities after hypotonic treatment for 15 min and recovery for 1.5 h

表2 處理組和對(duì)照組組內(nèi)的配對(duì)樣本T檢驗(yàn)Table 2 Pared-sample T test between the control and treatment group

3 討論

3.1 低鹽誘導(dǎo)對(duì)牡蠣胚胎發(fā)育的影響

鹽度是影響貝類生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素之一。本研究證明，對(duì)釋放了第一極體的長(zhǎng)牡蠣受精卵用鹽度8處理15 min，在誘導(dǎo)其產(chǎn)生多倍體的同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致其胚胎發(fā)育明顯受阻。孟乾等[15]認(rèn)為長(zhǎng)牡蠣“海大1號(hào)”胚胎發(fā)育的最適環(huán)境鹽度為30，二者的研究都表明，鹽度偏離最適值時(shí)，孵化速度都會(huì)明顯減慢，伴隨著孵化率的降低和畸形率的升高。同時(shí)，孟乾等[15]的研究還顯示環(huán)境鹽度10以下牡蠣受精卵即無法孵化，而本研究中鹽度為4仍有極少量幼蟲孵化，這可能是因?yàn)榉趸陂g高、低鹽的刺激對(duì)牡蠣胚胎發(fā)育的阻礙是持續(xù)性的，而本實(shí)驗(yàn)僅在減數(shù)第二次分裂時(shí)期對(duì)幼蟲進(jìn)行了短暫時(shí)間(15 min)的低鹽處理，并未進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間脅迫，因此對(duì)受精卵孵化產(chǎn)生的影響有限。此外，陳洪發(fā)等[8]的研究表明，親貝的培育鹽度，以及誘導(dǎo)完成后至孵化出D形幼蟲這一階段的環(huán)境鹽度對(duì)于三倍體的誘導(dǎo)效果也有顯著影響：培育鹽度為26、30、34和38時(shí)，誘導(dǎo)最佳鹽度為8；而環(huán)境鹽度為22時(shí)，最適誘導(dǎo)鹽度為6；同時(shí)，環(huán)境鹽度過高(鹽度為38)時(shí)，卵裂率和孵化率均顯著下降，提示在不同鹽度的養(yǎng)殖海區(qū)開展低鹽誘導(dǎo)牡蠣三倍體工作時(shí)，應(yīng)充分考慮海區(qū)鹽度對(duì)三倍體誘導(dǎo)效果的影響。

3.2 低鹽誘導(dǎo)對(duì)胚胎發(fā)育初期能量供應(yīng)、氧化應(yīng)激和滲透調(diào)節(jié)的影響

低鹽條件下，為滿足個(gè)體的滲透調(diào)節(jié)需要及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持，貝類的能量需求通常會(huì)增加[1，16]；滲透壓的急劇下降還會(huì)誘發(fā)活性氧的瞬間增加，引起抗氧化酶活性的改變[17]。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK) 可以催化糖酵解過程中的最后一步反應(yīng)，是糖酵解過程中的主要限速酶之一[18]；谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic oxalacetic transaminase,GOT)可以催化可逆轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，是氨基酸代謝的重要酶[19]；Na+-K+-ATP酶(又稱鈉鉀泵，Sodium potassium pump)能夠利用ATP水解供能調(diào)控Na+和K+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，維持胞漿離子濃度，在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[20]；而總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒則是測(cè)定細(xì)胞中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成的總抗氧化水平，可以反映出受精卵的氧化應(yīng)激情況。

本實(shí)驗(yàn)中，低鹽誘導(dǎo)15 min后，處理組中丙酮酸激酶的活性有顯著降低，說明低滲條件下貝類的能量供應(yīng)(尤其是糖酵解產(chǎn)生ATP的過程)受到了一定抑制；而GOT 無顯著變化則說明此時(shí)段GOT相關(guān)的氨基酸代謝沒有受到顯著影響，并未由于葡萄糖代謝供能受阻轉(zhuǎn)而提高氨基酸代謝供能水平。同時(shí)，總抗氧化能力(T-AOC)水平有顯著增加，間接反映了低鹽環(huán)境對(duì)貝類產(chǎn)生的氧化脅迫。減數(shù)分裂期間紡錘體的組裝、染色體的分離及收縮環(huán)的形成都很容易受到外界環(huán)境改變(如ATP合成受阻等)的影響，導(dǎo)致分裂異常從而產(chǎn)生多倍體[21-24]，因此，受精卵能量代謝的不足及氧化損傷可能是低鹽處理產(chǎn)生三倍體的原因之一。

低滲環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)的Na+會(huì)發(fā)生外流，為維持細(xì)胞滲透平衡，通常需要Na+-K+-ATP酶的作用以促進(jìn)Na+的主動(dòng)吸收，因此該酶活性往往會(huì)升高[25-27]；然而前人研究也報(bào)道了其活性在低滲條件下的多種變化趨勢(shì)，與物種及其所處的溫、鹽環(huán)境都密切相關(guān)。田相利等的研究表明，半滑舌鰨鰓絲Na+-K+-ATP酶活性隨鹽度的升高而升高[28]；在華貴櫛孔扇貝幼貝中開展的研究結(jié)果顯示，Na+-K+-ATP酶的活性隨著鹽度的升高先升后降[29]；而在黑鯛和褐牙鲆幼魚中開展的研究則表明，鹽度變化對(duì)其Na+-K+-ATP酶活性的影響并不顯著[30-31]。對(duì)于牡蠣受精卵來說，其細(xì)胞膜在低滲條件下會(huì)受到直接的破壞，可能導(dǎo)致膜上Na+-K+-ATP酶活性的降低[29]；同時(shí)，牡蠣在胚胎發(fā)育初期缺乏復(fù)雜的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)，這也可能是其Na+-K+-ATP酶活性在滲透脅迫條件下不升反降的原因之一。

轉(zhuǎn)入自然海水恢復(fù)1.5 h后，這3種酶的水平基本恢復(fù)了正常，說明短暫的低滲處理對(duì)受精卵能量代謝、氧化應(yīng)激和滲透調(diào)節(jié)的影響是暫時(shí)性的，它可能是誘導(dǎo)三倍體產(chǎn)生的原因，但不一定是后期胚胎發(fā)育受阻的主要因素。本課題組近期的研究顯示(未發(fā)表)，低鹽處理會(huì)對(duì)受精卵DNA造成難以修復(fù)的損傷，使其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生嚴(yán)重的錯(cuò)誤，這可能是導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形和速度減慢的原因之一。

此外，當(dāng)滲透壓降低時(shí)，僅依靠糖代謝往往難以滿足急劇增加的能量需求，海洋生物傾向于提高蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的分解以提供額外的能量[32-33]。同時(shí)，通過脫氨基作用可以減少細(xì)胞內(nèi)游離氨基酸的含量，降低體內(nèi)的滲透壓，從而應(yīng)對(duì)外界的低鹽環(huán)境[34]。谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)可以催化脫氨基作用，是促進(jìn)氨基酸分解和蛋白質(zhì)的供能的關(guān)鍵酶之一。本實(shí)驗(yàn)中，GOT的含量一直都未發(fā)生顯著改變，說明此時(shí)段氨基酸的代謝水平并沒有受到葡萄糖代謝供能受阻的影響，細(xì)胞也并未通過增加氨基酸代謝來降低胞內(nèi)滲透壓，以維持與外界的滲透平衡。考慮到受精卵作為一個(gè)單細(xì)胞個(gè)體，并不具備多細(xì)胞貝類成體復(fù)雜的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)，同時(shí)短時(shí)間的低鹽處理(15 min)可能也不足以給受精卵提供足夠的時(shí)間對(duì)外界環(huán)境改變做出相應(yīng)的響應(yīng)[35]，因此在氨基酸代謝方面并沒有顯著的應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)然，僅檢測(cè)GOT一個(gè)酶的水平并不能說明氨基酸代謝一定沒有發(fā)生改變，更全面的分析還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)語

本研究觀察了低鹽誘導(dǎo)對(duì)長(zhǎng)牡蠣三倍體胚胎發(fā)育的影響，及其抗氧化和能量代謝相關(guān)酶活性的改變。結(jié)果表明，低鹽誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致牡蠣胚胎發(fā)育嚴(yán)重遲緩，到達(dá)D形幼蟲的時(shí)間最多延緩了4 h以上；同時(shí)，低鹽處理可能會(huì)導(dǎo)致牡蠣受精卵受到嚴(yán)重的氧化脅迫、糖代謝供能被抑制、滲透調(diào)節(jié)受阻，這可能是導(dǎo)致牡蠣受精卵染色體異常分離從而產(chǎn)生三倍體的原因之一。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究低滲誘導(dǎo)貝類三倍體的機(jī)理提供了重要的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。