孫毅 劉雅琳 劉曉莉 丁美玲 張斌

耳聾是影響人類(lèi)健康和造成人類(lèi)殘疾的常見(jiàn)原因，研究發(fā)現(xiàn)65%的耳聾是由遺傳引起的[1]；其可以由單一基因突變或多基因突變引起，也可以由環(huán)境因素或基因和環(huán)境因素共同導(dǎo)致。隨著新生兒聽(tīng)力篩查工作的開(kāi)展，發(fā)現(xiàn)常規(guī)聽(tīng)力篩查存在一定的局限性，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性耳聾。北京市新生兒遺傳性耳聾基因篩查研究發(fā)現(xiàn)25%的遺傳性耳聾被單純的聽(tīng)力學(xué)篩查遺漏；耳聾基因篩查聯(lián)合聽(tīng)力篩查有助于預(yù)知遲發(fā)性耳聾和藥物性耳聾，同時(shí)做到有目的性的隨訪(fǎng)和臨床干預(yù)[2～5]。本研究擬通過(guò)分析近年來(lái)山東地區(qū)新生兒聽(tīng)力及耳聾基因聯(lián)合篩查結(jié)果，探討該地區(qū)新生兒耳聾基因聯(lián)合聽(tīng)力篩查的臨床意義，為該方法的推廣應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 以2017年6月至2018年11月在山東省內(nèi)各地分娩的新生兒9 147例為研究對(duì)象(不含重癥監(jiān)護(hù)室新生兒)，篩查前明確告知聽(tīng)力篩查和耳聾基因篩查相關(guān)知識(shí)，監(jiān)護(hù)人或家屬簽訂知情同意書(shū)。

1.2新生兒聽(tīng)力篩查及診斷方法

1.2.1聽(tīng)力篩查和診斷流程 新生兒在出生48小時(shí)后，在自然睡眠狀態(tài)下，于環(huán)境噪聲小于40 dB A的房間使用畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)進(jìn)行聽(tīng)力初篩，初篩未通過(guò)者要求在30～42天內(nèi)使用自動(dòng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)(AABR)進(jìn)行聽(tīng)力復(fù)篩。復(fù)篩未通過(guò)者將檢測(cè)結(jié)果告知家長(zhǎng)，并要求3月齡時(shí)應(yīng)用聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)進(jìn)行聽(tīng)力診斷。

1.2.2聽(tīng)力篩查方法 使用德國(guó)MAICO公司生產(chǎn)的Ero scan型耳聲發(fā)射儀進(jìn)行初篩，①DPOAE檢測(cè)，測(cè)試時(shí)間5～7秒，刺激強(qiáng)度40～70 dB SPL,測(cè)試頻率2～5 kHz，設(shè)備自動(dòng)顯示“通過(guò)”或“未通過(guò)”“轉(zhuǎn)診”。②AABR檢測(cè)：采用德國(guó)MAICO的MB11篩查AABR模塊進(jìn)行復(fù)篩，刺激強(qiáng)度35 dB nHL，測(cè)試頻率0.75～5 kHz，刺激信號(hào)為CE-Chirp聲，儀器自動(dòng)顯示 “通過(guò)”或“未通過(guò)”“轉(zhuǎn)診”。

1.2.3聽(tīng)力診斷方法 復(fù)篩未通過(guò)者清除外耳道耵聹后，進(jìn)行聽(tīng)力學(xué)診斷。ABR檢測(cè)：采用德國(guó)MAICO生產(chǎn)的MB11型檢測(cè)儀標(biāo)準(zhǔn)ABR模塊。以反應(yīng)閾<30 dB nHL為正常，31～50 dB nHL為輕度聽(tīng)力損失，51～70 dB nHL為中度聽(tīng)力損失，71～90 dB nHL為重度聽(tīng)力損失，>91 dB nHL為極重度聽(tīng)力損失。

1.3耳聾基因檢測(cè)方法 新生兒出生3天后，由各助產(chǎn)機(jī)構(gòu)用采血卡濾紙采集新生兒足跟末梢血2個(gè)血斑，每個(gè)血斑直徑不小于8 mm，室溫下自然晾干后裝入帶速封條的塑料袋內(nèi)，每周派專(zhuān)人送至山東省康復(fù)研究中心耳聾基因篩查實(shí)驗(yàn)室對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)4個(gè)常見(jiàn)的耳聾基因(GJB2、GJB3、SLC26A4和mtDNA12SrRNA)，包括15個(gè)耳聾突變位點(diǎn)，GJB2(35delG、 176del16、235delC、299_300delAT)、SLC26A4 (1174A>T、1226 G>A、1229 C>T、1975 G >C、2027T>A、 IVS15+5G>A、IVS7-2A>G、2168A>G)、mtDNA12SrRNA(1494C>T、1555A>G)、GJB3(538C>T)，并在30天內(nèi)將檢測(cè)結(jié)果反饋至新生兒出生分娩機(jī)構(gòu)。

檢測(cè)流程：采用天根干血斑核酸提取試劑盒(DP334-03)對(duì)干血斑進(jìn)行基因組DNA提取，使用Nano DRrop2000對(duì)提取的DNA進(jìn)行濃度檢測(cè)，濃度合格后使用PCR擴(kuò)增儀對(duì)目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增(杭州博日科技有限公司TC-96/G/H(b))，后使用晶芯BioMixer TM 芯片雜交儀、晶芯SlideWasher TM洗干儀和LuxScan TM 10K-A微陣列芯片掃描儀和遺傳性耳聾基因芯片判別系統(tǒng)(博奧晶典生物技術(shù)有限公司)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀。每批樣本包含陰性、陽(yáng)性對(duì)照組，以驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性，同時(shí)隨機(jī)抽取5%的樣本以及檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣本進(jìn)行DNA測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1聽(tīng)力篩查及診斷結(jié)果 9 147例新生兒中，初篩未通過(guò)172例(1.88%，172/9 147)，復(fù)篩未通過(guò)者94例(54.65%，94/172)，經(jīng)聽(tīng)力學(xué)診斷確診聽(tīng)力損失患兒17例(表1)，占初篩未通過(guò)的9.88%(17/172)；其中，雙耳聽(tīng)力損失10例，包括極重度2例，重度2例，中度1例，輕度4例，左耳輕度、右耳中度1例。單耳聽(tīng)力損失極重度1例，中度2例，輕度1例。先天性小耳畸形2例，面部發(fā)育畸形、眼距異常伴雙耳極重度聽(tīng)力損失1例。

表1 17例診斷聽(tīng)力損失新生兒基因篩查突變類(lèi)型、聽(tīng)力損失程度及ABR反應(yīng)閾

2.2基因篩查結(jié)果 9 147例新生兒全部進(jìn)行十五個(gè)位點(diǎn)的耳聾基因篩查，發(fā)現(xiàn)耳聾基因突變461例(表2)。致聾基因攜帶率5.04%(461/9 147)。篩查出GJB2基因雜合突變224例，攜帶率為2.45%，GJB3基因雜合突變27例，攜帶率0.30%；SLC26A4基因雜合突變186例，攜帶率2.03%；mtDNA12SrRNA均質(zhì)和異質(zhì)突變19例，攜帶率0.21%。GJB2純合突變2例，復(fù)合雜合突變1例，SLC26A4基因復(fù)合雜合突變1例。雙基因雜合突變5例。對(duì)耳聾基因檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性患兒家長(zhǎng)進(jìn)行電話(huà)回訪(fǎng)，在461例陽(yáng)性患兒中有103位家長(zhǎng)未取得聯(lián)系，剩余358例耳聾基因檢測(cè)陽(yáng)性患兒中19例未通過(guò)聽(tīng)力初篩，進(jìn)行了聽(tīng)力學(xué)診斷，結(jié)果顯示有11例耳聾基因檢測(cè)陽(yáng)性患兒聽(tīng)力診斷異常。

表2 山東省9 147例新生兒耳聾基因篩查各基因突變類(lèi)型、位點(diǎn)及攜帶率

2.3確診聽(tīng)力損失患兒的基因篩查結(jié)果 在17例聽(tīng)力損失患兒中耳聾基因檢測(cè)陰性6例，陽(yáng)性11例，11例耳聾基因篩查陽(yáng)性者中，攜帶GJB2基因突變者，包括：2例235delC純合突變，1例235delC/299_300delAT復(fù)合雜合突變，2例235delC雜合突變，1例299_300delAT雜合突變；攜帶SLC26A4基因突變者，包括1例IVS7-2A>G/2168A>G復(fù)合雜合突變，4例IVS7-2A>G雜合突變(表1)。在6例基因檢測(cè)陰性患兒中，1例面部發(fā)育異常提示綜合征型耳聾。根據(jù)家長(zhǎng)要求，對(duì)1例GJB2基因299_300delAT雜合突變且聽(tīng)力診斷為雙耳輕度聽(tīng)力損失患者進(jìn)行基因組測(cè)序檢查發(fā)現(xiàn), 其攜帶257C>G突變，為復(fù)合雜合突變，明確了遺傳學(xué)病因。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)65%的耳聾是由遺傳引起的[1]。新生兒聽(tīng)力篩查經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，已經(jīng)比較成熟，但是，新生兒聽(tīng)力篩查有一定局限性，遲發(fā)性耳聾及藥物性耳聾患者均可通過(guò)新生兒聽(tīng)力篩查。70%的遺傳性耳聾是以耳聾為唯一癥狀而不伴有其他臨床表現(xiàn)[6],耳聾基因診斷則有助于判別是否為遺傳導(dǎo)致的耳聾[7]。

從文中結(jié)果看，山東省9 147例新生兒耳聾基因攜帶率為5.04%，以GJB2和SLC26A4基因突變?yōu)橹?，攜帶率分別為2.45%和2.03%,GJB3和線(xiàn)粒體DNA12SrRNA基因突變攜帶率分別為0.30%和0.21%，其中GJB2、GJB3和線(xiàn)粒體DNA12SrRNA基因突變攜帶率與王秋菊等[2]的研究結(jié)果基本一致，只有SLC26A4結(jié)果略有不同?？偨Y(jié)可能有兩方面原因，一是本研究使用芯片在SLC26A4位點(diǎn)上比之前的研究多了6個(gè)位點(diǎn)，有利于發(fā)現(xiàn)更多突變個(gè)體；二是我國(guó)地域廣闊，各個(gè)地區(qū)之間耳聾基因突變的分布頻率可能存在一定差異。

在我國(guó)人群中，GJB2基因是引起遺傳性耳聾最常見(jiàn)的耳聾基因[1]。GJB2基因編碼的連接蛋白，主要參與細(xì)胞間信號(hào)介導(dǎo)和離子的傳遞[8]，其表達(dá)或者功能的異常會(huì)影響細(xì)胞間隙的連接功能，影響內(nèi)耳鉀離子的正?；厥斩旅@；其遺傳方式表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，235delC突變?cè)诼?tīng)力正常人群中攜帶率為1%～2%[9]。本組新生兒GJB2基因突變發(fā)生率最高，攜帶率為2.45%，其中有164例為235delC雜合突變，攜帶率達(dá)1.79%，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。本次篩查中發(fā)現(xiàn)2例GJB2純合突變和1例GJB2復(fù)合雜合突變的新生兒，這3例聽(tīng)力初篩及復(fù)篩均顯示為“未通過(guò)”或“轉(zhuǎn)診”，聽(tīng)力診斷2例為極重度聽(tīng)力損失，1例為重度聽(tīng)力損失。另外，還發(fā)現(xiàn)1例299_300delAT雜合突變者，雙耳為輕度聽(tīng)力損失，對(duì)該例新生兒進(jìn)行GJB2全序列測(cè)序，發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶257C>G突變，是復(fù)合雜合突變，明確了遺傳學(xué)病因[10]，故建議其盡早進(jìn)行聽(tīng)力干預(yù)并長(zhǎng)期隨診。研究報(bào)道，有50%以上的極重度耳聾患者在3月齡時(shí)具有正常的聽(tīng)覺(jué)行為，至少20%在6個(gè)月時(shí)仍具有聽(tīng)覺(jué)行為[11]。因此，上述病例需進(jìn)行隨訪(fǎng)，追蹤其聽(tīng)力變化情況，以免延誤治療和干預(yù)。

SLC26A4基因又稱(chēng)PDS基因，位于人類(lèi)染色體7q31，含21個(gè)外顯子，是大前庭水管綜合征的主要致病基因，其編碼的Pendred蛋白為離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要由疏水性氨基酸組成，其功能主要參與碘/氯離子等陰離子的轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。SLC26A4基因是僅次于GJB2突變而引起感音神經(jīng)性聾的遺傳學(xué)病因，遺傳方式為常染色體隱性遺傳[13]。本組9 147例新生兒中SLC26A4基因攜帶者186例，其中發(fā)現(xiàn)1例IVS7-2A>G/2168A>G復(fù)合雜合突變患者，雙耳均通過(guò)聽(tīng)力篩查，召回其父母采血行耳聾基因檢測(cè)，結(jié)果顯示父母分別為IVS7-2A>G雜合突變攜帶者和2168A>G雜合突變攜帶者；該患兒于出生后6月齡時(shí)行聽(tīng)力診斷，CT結(jié)果示其右耳前庭水管擴(kuò)張，左耳正常，聽(tīng)力診斷結(jié)果示左耳輕度聽(tīng)力損失，右耳中度聽(tīng)力損失，建議患兒及時(shí)佩戴助聽(tīng)器，該夫婦再次生育時(shí)應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)前診斷。研究發(fā)現(xiàn)單純IVS7-2A>G雜合突變也有導(dǎo)致中度語(yǔ)后聾和重度語(yǔ)前聾的報(bào)道，很可能是SLC26A4基因上的第二個(gè)突變位點(diǎn)沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)4例SLC26A4雜合突變個(gè)體同樣存在雙側(cè)或單側(cè)的聽(tīng)力損失，后期通過(guò)影像學(xué)診斷發(fā)現(xiàn)全部為大前庭水管綜合征，將在后續(xù)的研究中對(duì)這些患兒進(jìn)行SLC26A4基因全基因測(cè)序分析，找到第二個(gè)可能的突變位點(diǎn)。

SLC26A4基因又稱(chēng)為“一巴掌打聾基因”。在患兒成長(zhǎng)過(guò)程中，頭部運(yùn)動(dòng)、外力作用、巨大的聲響及感冒、擤鼻涕等因素都可能導(dǎo)致聽(tīng)力障礙的發(fā)生。本次篩查中檢出的SLC26A4基因突變186例，攜帶率為2.03%，僅次于GJB2的突變攜帶率；其中SLC26A4基因IVS7-2A>G突變116人，占SLC26A4基因突變62.7%。除上述1例IVS7-2A>G/2168A>G復(fù)合雜合突變患者及4例攜帶SLC26A4致聾基因聽(tīng)力篩查未通過(guò)者外，剩余181例SLC26A4基因攜帶者均建議其進(jìn)行聽(tīng)力診斷檢查或該基因全系列分析。通過(guò)基因檢測(cè)，對(duì)于已經(jīng)確診的患兒不僅可以早期明確病因診斷，還可以針對(duì)性地給予聽(tīng)力保健指導(dǎo)。同時(shí)有利于提醒聽(tīng)力檢測(cè)通過(guò)而基因檢測(cè)未通過(guò)的新生兒家長(zhǎng)關(guān)注小兒聽(tīng)力變化，如果發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力損失應(yīng)及早保護(hù)患兒的殘余聽(tīng)力并給予早期干預(yù)。

mtDNA12SrRNA突變?yōu)槟赶颠z傳，mtDNA12SrRNA基因1494C>T、1555A>G與藥物性聾有關(guān)[15],1555A>G、1494C>T兩個(gè)突變可以導(dǎo)致12SrRNA的構(gòu)象改變，形成與氨基糖苷類(lèi)抗生素作用的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致聽(tīng)毛細(xì)胞逐漸凋亡引起永久性不可逆的耳聾。本研究在山東地區(qū)9 147例新生兒標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)mtDNA12SrRNA突變患者19例，均通過(guò)聽(tīng)力診斷，在檢出結(jié)果后及時(shí)對(duì)該基因突變患者及其母系家庭成員的臨床用藥進(jìn)行宣教，要求在后續(xù)的生活中禁止使用耳毒性藥物以防“一針致聾”。通過(guò)本次篩查可避免19位聽(tīng)障患兒的產(chǎn)生，同時(shí)對(duì)家系成員進(jìn)行用藥指導(dǎo)，避免后代產(chǎn)生聽(tīng)力殘疾患者。

GJB3基因最初被發(fā)現(xiàn)在中國(guó)患者中導(dǎo)致常染色體顯性遺傳非綜合征型聾。2013年我國(guó)學(xué)者首次報(bào)道了新生兒中該基因的篩查結(jié)果[16]，目前認(rèn)為該基因突變攜帶者可能為遲發(fā)性耳聾患者，雖然在新生兒期無(wú)耳聾癥狀，但應(yīng)密切關(guān)注其聽(tīng)力狀況。本研究發(fā)現(xiàn)27例為GJB3基因538C>T雜合突變，其聽(tīng)力篩查結(jié)果正常，建議定期隨訪(fǎng)。

本研究結(jié)果表明，新生兒聽(tīng)力篩查聯(lián)合耳聾基因篩查是大勢(shì)所趨，通過(guò)基因篩查可以早期發(fā)現(xiàn)部分聽(tīng)力篩查不能發(fā)現(xiàn)的遲發(fā)性耳聾個(gè)體和藥物性耳聾個(gè)體及家系，擴(kuò)大干預(yù)范圍，同時(shí)能夠依據(jù)發(fā)現(xiàn)的遺傳信息進(jìn)行婚育指導(dǎo)，使防聾時(shí)間關(guān)口前移。目前，對(duì)新生兒耳聾基因篩查和聽(tīng)力篩查的宣傳教育還是集中于醫(yī)療機(jī)構(gòu)[17],經(jīng)由醫(yī)務(wù)人員對(duì)家長(zhǎng)進(jìn)行宣教，尚不夠普及，效果受限。因此，殘疾人服務(wù)機(jī)構(gòu)更應(yīng)該加入到殘疾預(yù)防的行列中，積極通過(guò)多渠道提高本地區(qū)家長(zhǎng)對(duì)遺傳性耳聾的認(rèn)識(shí)，科學(xué)的理解遺傳性聾的發(fā)病原因，避免因?yàn)檎J(rèn)識(shí)不足造成的延誤診斷，科學(xué)的面對(duì)聽(tīng)力殘疾預(yù)防及殘疾康復(fù)。