蔣宜峰，楊世利，魏 威，王 萍，張 利，余 江,4

1)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川雅安 625014；2)四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，四川成都 610065；3)四川大學(xué)新能源與低碳技術(shù)研究院，四川成都 610065；4)四川大學(xué)宜賓產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川宜賓 644000

目前，人類正面臨水資源短缺、能源匱乏的雙重危機與挑戰(zhàn)，基于微藻培養(yǎng)的污水深度處理和生物質(zhì)能源生產(chǎn)耦合系統(tǒng)由此應(yīng)運而生，并日益成為眾多研究者關(guān)注的熱點[1-2].微藻生產(chǎn)生物能源過程中，利用污水培養(yǎng)富油微藻，不僅可以利用微藻使污水再生循環(huán)利用，還可以為能源微藻生產(chǎn)生物柴油提供資源[3-6].張波等[7]研究表明，以廢水作為培養(yǎng)基培養(yǎng)高附加值微藻的關(guān)鍵在于優(yōu)良藻種的篩選.

氮是構(gòu)成微藻蛋白質(zhì)的重要元素，是微藻細胞生長的必要元素之一.不同氮濃度會影響微藻細胞的生長速度，在氮限制狀態(tài)下，藻體中蛋白質(zhì)的合成會受到影響，如細胞中蛋白質(zhì)濃度降低和蛋白質(zhì)合成停止[8].而在氮濃度異常高的情況下，微藻細胞生長培養(yǎng)基中的氮磷質(zhì)量比會失調(diào)，此時細胞只會過度吸收氮，不利于細胞分裂，從而抑制微藻生長[9-12].只有當培養(yǎng)環(huán)境中的氮在一定的濃度范圍內(nèi)才會有利于微藻生長，且不同藻種對氮濃度的要求也存在差異.迄今，有關(guān)能源微藻在不同種類廢水中的生長特性的研究仍鮮見報道.本研究利用室內(nèi)受控實驗，通過調(diào)控酒糟廢水的總氮濃度，考察萊茵衣藻和二形柵藻兩種微藻在單一和共培養(yǎng)條件下的生長狀況、廢水中營養(yǎng)鹽的吸收去除效率以及微藻藻蛋白質(zhì)合成情況，獲得適合微藻生長的酒糟廢水的總氮濃度，對能源微藻與酒糟廢水耦合培育體系的深入研究具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

萊茵衣藻(Chlamydoomonasreinhardtii)和二形柵藻(Scenedesmusdimorphus)均屬于綠藻，取自于四川大學(xué)藻類學(xué)藻種室.

1.2 酒糟廢水培養(yǎng)基

本實驗所處理的酒糟廢水取自中國四川某酒廠.實驗前，經(jīng)多級皂土(250.00 mL液體加入10.00 g皂土)、離心處理(4 800 r/min，10 min)，并調(diào)節(jié)pH值至中性后置于120 ℃高壓滅菌30 min，以去除廢水中的懸浮物和病原微生物.處理前后廢水的pH值、有機物(即化學(xué)需氧量，chemical oxygen demand，COD)、總氮(total nitrogen, TN)和總磷(total phosphorus, TP)等物理化學(xué)指標見表1.

表1 酒糟廢水基本物理化學(xué)指標

通過預(yù)處理，采用不同稀釋倍數(shù)(原水的體積分數(shù)為100%；稀釋2倍后體積分數(shù)為50%；稀釋4倍后體積分數(shù)為25%；稀釋8倍后體積分數(shù)為12.5%)的酒糟廢水用于培養(yǎng)微藻，發(fā)現(xiàn)在未稀釋廢水的培養(yǎng)基中微藻均未能有效繁殖，而在不同稀釋倍數(shù)培養(yǎng)條件中微藻均能生長良好，可能是由于廢水在未稀釋狀態(tài)下含有其他濃度較高的有毒有害物質(zhì)，從而對微藻生長造成一定影響.

1.3 實驗方法與指標測定

1.3.1 實驗方法

本研究以稀釋2倍的酒糟廢水作為培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)總氮初始濃度，設(shè)置5.00、14.00、40.25、120.00、360.00和1 100.00 mg/L等6個質(zhì)量濃度梯度組，分別獨立培養(yǎng)萊茵衣藻和二形柵藻，同時設(shè)置兩種微藻的共培養(yǎng)實驗組.其中，每組設(shè)3個平行對照組，對照組總氮的初始質(zhì)量濃度為40.25 mg/L，而培養(yǎng)基中總磷質(zhì)量濃度(16.4 mg/L)及其他介質(zhì)條件保持不變.設(shè)置培養(yǎng)條件為：溫度為(25±1)℃，光照強度為2 000 lux，每天人工搖動培養(yǎng)瓶使微藻始終均勻懸浮于培養(yǎng)液中，定期取一定量培養(yǎng)液，測定微藻生物量(恒質(zhì)量法)，以及培養(yǎng)液總氮、總磷和有機物質(zhì)量濃度和pH值等指標.實驗周期為17 d.

1.3.2 指標測定方法

1)微藻生物量、比生長速率測定.把藻細胞沉淀置于60～80 ℃箱烘干至恒質(zhì)量，取出后于干燥器中自然冷卻并稱其質(zhì)量.微藻比生長速率μm為衡量微藻細胞生長的指標之一，計算公式[12]為

(1)

其中，X1是起始取樣時間t1的生物量；X2是結(jié)束取樣時間t2的生物量.

2)蛋白質(zhì)產(chǎn)量測定.采用改良考馬斯亮藍G-250 染色法測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度，即微藻的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(按鮮質(zhì)量計)[13].

3)氮、磷和有機物的吸收速率和去除率測定.氮、磷和有機物的吸收速率v計算公式[12]為

(2)

其中，ρ0為起始時培養(yǎng)液中TN、TP和COD的質(zhì)量濃度；ρt為結(jié)束時培養(yǎng)液中TN、TP和COD的質(zhì)量濃度；V為培養(yǎng)液體積；t為培養(yǎng)時間.

TN、TP和COD的去除率r為

(3)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并用OriginPro 9.1軟件制圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 氮調(diào)控對微藻生長特性的影響

不同N質(zhì)量濃度條件下，各組微藻生長趨勢如圖1和圖2.由圖1和圖2可見，不同的總氮質(zhì)量濃度對微藻生長的影響比較明顯.實驗周期內(nèi)，當初始TN質(zhì)量濃度為5 mg/L時，萊茵衣藻、二形柵藻和共培養(yǎng)下的μm分別為0.258、0.160和0.175 d-1，均為實驗組最低.隨著TN質(zhì)量濃度升高,μm先升后降，萊茵衣藻的μm在TN質(zhì)量濃度為120 mg/L時達到最大值0.390 d-1，與初始TN質(zhì)量濃度分別為40.25 mg/L(0.380 d-1)和360.00 mg/L(0.386 d-1)時相比，μm分別上升了2.67%和1.06%；二形柵藻和共培養(yǎng)微藻均在初始TN質(zhì)量濃度為40.25 mg/L時達到最大值，分別為0.32 d-1和0.35 d-1.

圖1 氮調(diào)控下微藻的生長曲線

圖2 氮調(diào)控下微藻比生長速率的比較

初始TN質(zhì)量濃度較低組(5.00 mg/L和14.00 mg/L)，前7 d內(nèi)，微藻生長速度隨著培養(yǎng)時間延長，呈增長趨勢，但總體滯后于其他實驗組，到第 7 天開始生長進入平緩期.實驗結(jié)束時，初始TN質(zhì)量濃度為5.00 mg/L 的萊茵衣藻和二形柵藻的生物量均處于較低水平，分別為110.0 mg/L和37.5 mg/L，同樣，共培養(yǎng)條件下的最終生物量也僅約37.5 mg/L；而初始TN質(zhì)量濃度為14.00 mg/L的萊茵衣藻和二形柵藻，生物量最終達388.00 mg/L和175.00 mg/L，共培養(yǎng)條件下生物量達到223.75 mg/L，也明顯低于其他組.

初始TN質(zhì)量濃度40.25 mg/L和360.00 mg/L兩組的萊茵衣藻呈現(xiàn)出良好的生長趨勢，直到第11天其生長速率才均有所降低，最終生物量分別達到879.5 mg/L和974.5 mg/L.對于單一培養(yǎng)條件下的二形柵藻，初始TN質(zhì)量濃度為40.25 mg/L和360.00 mg/L時，在培養(yǎng)前9 d內(nèi)生長趨勢同步，到第11天時TN質(zhì)量濃度為40.25 mg/L組的生物量達到最大，為775 mg/L，TN濃度為360 mg/L組在第13天生物量達到562.5 mg/L.萊茵衣藻和二形柵藻共培養(yǎng)條件下，同樣的初始TN質(zhì)量濃度，最終生物量分別達到762.50 mg/L和356.25 mg/L.

從圖1可看出，初始TN質(zhì)量濃度為120 mg/L組的萊茵衣藻生長最佳，從第3天開始生長速度明顯增大，到第9天開始其生物量已高于其他組，實驗結(jié)束時生物量高達1 045 mg/L.二形柵藻單一培養(yǎng)條件下，前7天內(nèi)，微藻生物量隨培養(yǎng)時間呈快速上升趨勢，并在第7 d達到最大值(743.75 mg/L).實驗發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)條件下的微藻生長曲線低于單一培養(yǎng)條件，實驗結(jié)束時微藻生物量達到500 mg/L，這與控氮變磷條件下共培養(yǎng)的微藻生長曲線略高于單一培養(yǎng)下的二形柵藻有一定差異[6]，表明共培養(yǎng)體系的影響因素更為復(fù)雜.從圖1還可見，組萊茵衣藻明顯受到了環(huán)境中高濃度氮的脅迫，且隨著培養(yǎng)時間的增長，培養(yǎng)基中僅有的磷被消耗殆盡，出現(xiàn)了氮磷質(zhì)量比極度失調(diào)的情況，而細胞對氮營養(yǎng)的過量吸收，不利于細胞分裂，從而生長受到明顯的抑制[9]，也導(dǎo)致該組萊茵衣藻的最終生物量比其他組低很多.

2.2 氮調(diào)控對微藻蛋白質(zhì)濃度的影響

氮調(diào)控下微藻蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的變化見圖3.由圖3可見，不同培養(yǎng)條件下的微藻蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度整體上均隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸增多，但TN質(zhì)量濃度為5.00 mg/L和14.00 mg/L組的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度均明顯處于較低水平，尤其是5.00 mg/L組的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度始終處于最低，培養(yǎng)到第17天時萊茵衣藻和二形柵藻的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度最終分別為5.64 mg/L和8.25 mg/L，共培養(yǎng)條件下的微藻蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為5.10 mg/L.相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，低氮水平改變了微藻與脂肪酸生物合成相關(guān)的碳代謝，使光合作用形成的糖類由于氮的缺乏，不能有效合成氨基酸，轉(zhuǎn)而形成脂肪酸積累在細胞內(nèi)[14-15].在氮缺乏時，隨著培養(yǎng)時間的增加，微藻在營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基中生長，生理活動不能正常進行，藻體蛋白質(zhì)等內(nèi)含物合成減弱，細胞分裂減緩或受阻，細胞生長遲緩[8].TN質(zhì)量濃度為1 100 mg/L組的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度也始終保持較低水平，其中，萊茵衣藻最終蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度僅有48.08 mg/L，這可能是因為該組的氮磷質(zhì)量比嚴重失調(diào)，氮質(zhì)量濃度超高(意味著嚴重的磷限制)，處于這樣的培養(yǎng)環(huán)境中，藻細胞分裂受到強烈抑制，生物量低，導(dǎo)致萊茵衣藻蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度比其他組都低.

圖3 氮調(diào)控下微藻蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的變化

當初始TN質(zhì)量濃度為120 mg/L時，微藻蛋白質(zhì)合成情況最好，最終萊茵衣藻蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為81.48 mg/L，二形柵藻蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為160.62 mg/L，共培養(yǎng)微藻蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為88.96 mg/L.此外，總氮質(zhì)量濃度在40.25～360.00 mg/L時，微藻蛋白質(zhì)合成情況較好，這可能是因為在氮充足等環(huán)境良好的情況下，藻體細胞代謝正常，生長良好，蛋白質(zhì)等細胞內(nèi)初級代謝產(chǎn)物能正常合成[16].

2.3 氮調(diào)控下微藻對氮磷及有機物去除效果的影響

2.3.1 不同N質(zhì)量濃度下微藻對TN去除效果的影響

從圖4和圖5可知，萊茵衣藻對TN的吸收速率隨TN質(zhì)量濃度的升高逐漸上升，單一培養(yǎng)下的二形柵藻和共培養(yǎng)下的兩種微藻對TN的吸收速率隨著TN質(zhì)量濃度的升高先降后升.當初始TN質(zhì)量濃度為40.25 mg/L時，二形柵藻和共培養(yǎng)下微藻對TN的吸收速率最終分別為0.090 1 d-1和0.066 8 d-1.當初始TN質(zhì)量濃度為1 100 mg/L時，3種培養(yǎng)條件微藻TN吸收速率分別為1.776 6、2.628 8 和4.254 9 d-1.萊茵衣藻對TN的去除率隨著初始TN質(zhì)量濃度的增加先升后降.TN質(zhì)量濃度為14 mg/L的萊茵衣藻，TN去除量達到13.32 mg/L，去除率最高達95.15%，基本達到了地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB 3838—2002)的III類水總氮要求(≤1.5 mg/L)[2].初始TN質(zhì)量濃度低于40.25 mg/L時，二形柵藻和共培養(yǎng)的微藻對TN的去除效率幾乎保持一致，均高于同等培養(yǎng)條件下萊茵衣藻對TN的去除效率，但無明顯差異(P>0.05).隨著初始TN質(zhì)量濃度升高，二形柵藻對TN的去除優(yōu)勢在3種微藻中顯得更加明顯.初始TN質(zhì)量濃度為1 100 mg/L時，微藻的TN去除量急劇增加，達到所有實驗組中的最大值，分別為788.55 mg/L(萊茵衣藻)、801.27 mg/L(二形柵藻)和777.33 mg/L(共培養(yǎng))，但去除率均在70%左右.

圖4 氮調(diào)控下微藻對TN吸收速率的比較

圖5 不同N質(zhì)量濃度下微藻對TN去除率及去除量的比較

根據(jù)式(3)可知，當微藻對TN的吸收量一定時，微藻質(zhì)量越低，單位質(zhì)量的微藻對TN的吸收速率越高.由于TN質(zhì)量濃度為1 100 mg/L時，微藻生長均受到不同程度的抑制，藻細胞對TN過量吸收，不利于藻細胞的分裂[9]，從而出現(xiàn)TN去除量高而藻體生物量低的情況，致使該實驗組微藻的TN吸收速率比其他組明顯增大.

綜合比較各實驗組中微藻對TN的吸收速率、去除率和去除量可知, 初始TN質(zhì)量濃度為40.25 mg/L時，微藻對TN的去除效果最優(yōu)，萊茵衣藻、二形柵藻和共培養(yǎng)下的微藻對TN的去除率分別達到93.68%、96.85%和97.37%，基本達到了地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB 3838—2002)的IV類水總氮的要求(≤1.5 mg/L)[2].

2.3.2 氮調(diào)控下微藻對磷去除效率的影響

實驗周期內(nèi)，各組微藻對TP的吸收速率、去除率及去除量見圖6和圖7.總磷的去除路徑主要包括藻體的吸收作用和磷酸鹽的吸附沉淀作用.對比廢水中3種微藻培養(yǎng)下的TP濃度變化(圖6)與微藻的生長曲線(圖1)可知，TP去除與微藻的生長趨勢基本吻合.

圖6 氮調(diào)控下培養(yǎng)液中TP質(zhì)量濃度的變化

圖7 不同N濃度下微藻對TP去除率和去除量的比較

對萊茵衣藻來說，當初始總氮質(zhì)量濃度大于14 mg/L 時，TP的去除率均超過80%，尤其當?shù)踪|(zhì)量比為2.45、初始總氮質(zhì)量濃度為40.25 mg/L時，對TP的最終去除量達14.89 mg/L，去除率達90.81%；當初始總氮質(zhì)量濃度為5 mg/L時，藻體對TP的去除率最終只有9.81%.此外，萊茵衣藻對TP的去除效率明顯高于二形柵藻.當初始總氮質(zhì)量濃度為40.25 mg/L時，二形柵藻和共培養(yǎng)下的微藻對TP的去除率只有70.80%和74.74%.共培養(yǎng)下微藻對TP的去除效果與二形柵藻較為一致，這也說明在共培養(yǎng)條件下二形柵藻對廢水的資源化利用起主導(dǎo)作用，并可能對萊茵衣藻吸收TP起到一定程度的抑制，這與本課題組就控磷對二形柵藻吸收磷營養(yǎng)鹽的研究結(jié)果基本一致[6].

王海英等[17]利用城市污水培養(yǎng)蛋白核小球藻，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)第6 天時，培養(yǎng)基中TP的去除率已達到80%以上，但隨培養(yǎng)時間延長，去除效果逐漸變低，與本實驗結(jié)果較為接近.經(jīng)處理后，廢水中總磷質(zhì)量濃度基本達到發(fā)酵酒精與白酒工業(yè)水污染物排放標準(GB 27631—2011)間接排放小于3.0 mg/L 的要求.

2.3.3 氮調(diào)控下微藻對COD去除效果的影響

實驗周期內(nèi)，各組微藻對酒糟廢水中COD的吸收速率、去除率及去除量見圖8和圖9.隨著培養(yǎng)時間的延長，酒糟廢物水培養(yǎng)基中COD的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)明顯下降趨勢，實驗結(jié)束時，萊茵衣藻實驗組COD的質(zhì)量濃度均達到最低值，各實驗組中COD的質(zhì)量濃度分別為87.5、182.0、512.5、502.0、547.5和570.0 mg/L，COD去除率最大分別達到62.28%、72.00%、72.57%、73.12%、70.68%和69.48%.從圖9可見，總體上萊茵衣藻對COD的去除效果低于二形柵藻，但不存在顯著性差異.而二形柵藻各實驗組COD的質(zhì)量濃度在實驗初期隨著微藻的生長呈明顯降低趨勢，到第13天實驗組培養(yǎng)基內(nèi)COD的質(zhì)量濃度達到最小值，分別為37.0、82.0、259.5、317.0、510.0和820.0 mg/L，COD最大去除率分別達84.05%、87.38%、86.10%、83.03%、72.69%和56.09%.隨著培養(yǎng)時間延長，第13天后培養(yǎng)基內(nèi)COD的質(zhì)量濃度逐步增大，可能是因為藻體在生長一段時間后，由于培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的減少及光照不足等原因，藻體自身分泌產(chǎn)生一些有機物，降低微藻自身對COD的去除效果.共培養(yǎng)條件下微藻對培養(yǎng)基內(nèi)的COD去除規(guī)律與二形柵藻類似，在第15天左右實驗組培養(yǎng)基內(nèi)的COD質(zhì)量濃度達到最小值，分別為32.0、87.0、272.5、385.0、660.0和795.0 mg/L，COD的最大去除率分別達86.21%、86.62%、85.41%、79.38%、64.66%和57.43%.經(jīng)處理后，廢水中COD的質(zhì)量濃度基本達到發(fā)酵酒精與白酒工業(yè)水污染物排放標準(GB 27631—2011)間接排放小于400 mg/L的要求.

圖8 氮調(diào)控下培養(yǎng)液中COD質(zhì)量濃度的變化

圖9 不同N質(zhì)量濃度下微藻對COD去除率和去除量的比較

3 結(jié) 論

1)單一培養(yǎng)條件下，萊茵衣藻對磷的需求總體上大于二形柵藻對氮的需求，當初始TN質(zhì)量濃度為40.25 mg/L、初始氮磷質(zhì)量比為2.45時，萊茵衣藻最終生物量達879.5 mg/L，藻蛋白質(zhì)量濃度達69.00 mg/L，對TN、TP和COD的最終去除率分別達到93.68%、90.81%和72.57%；二形柵藻的生物量最高達775 mg/L，藻蛋白質(zhì)量濃度達154.53 mg/L，對TN、TP和COD的最終去除率分別達到96.85%、70.80%和82.06%.

2)共培養(yǎng)條件下，萊茵衣藻在生長方面和對氮磷等資源化利用方面受二形柵藻抑制影響較明顯，當初始TN質(zhì)量濃度為40.25 mg/L、初始氮磷質(zhì)量比為2.45時，對TN和TP的去除率分別為97.37%和74.74%；共培養(yǎng)條件下微藻對酒糟廢水COD的去除規(guī)律與二形柵藻類似.

3)利用酒糟廢水-微藻培育耦合體系，單一培養(yǎng)體系和共培養(yǎng)體系，酒糟廢水水質(zhì)總體均能達到地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB 3838—2002)和發(fā)酵酒精與白酒工業(yè)水污染物排放標準(GB 27631—2011)的要求.