郟樂(lè)銘 賈小玥 楊燃 周學(xué)東 徐欣

1.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 成都 610041；

2.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院兒童口腔科 成都 610041

人體表面和體內(nèi)定植著超過(guò)100萬(wàn)億的共生微生物，它們?cè)谌祟?lèi)健康和疾病中發(fā)揮著重要的作用?？谇蛔鳛槿梭w五大菌庫(kù)（口腔、腸道、皮膚、鼻腔和陰道）之一，是一個(gè)完整復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)[1]。定植于人口腔中的微生物包含需氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧菌，以及螺旋體、真菌、古細(xì)菌、支原體、病毒和原蟲(chóng)等其他微生物[2]，在口腔不同位置共棲、競(jìng)爭(zhēng)和拮抗，與口腔固有環(huán)境共同組成了口腔微生態(tài)系統(tǒng)。正常生理狀態(tài)下，口腔微生物之間、微生物與宿主之間存在著動(dòng)態(tài)平衡，共同參與宿主代謝、免疫和營(yíng)養(yǎng)過(guò)程，維護(hù)口腔健康。在外環(huán)境與宿主因素的影響下，口腔微生態(tài)平衡被破壞，口腔常駐菌條件致病進(jìn)而導(dǎo)致多種口腔疾?。ㄈ琮x病、牙周病、牙髓根尖周病、口臭、口腔念珠菌病等）的發(fā)生[3]。

牙周病是發(fā)生于牙齒支持組織的細(xì)菌感染性疾病，主要表現(xiàn)為牙齦的炎癥和出血、牙周附著喪失、牙槽骨吸收，導(dǎo)致牙松動(dòng)、移位、脫落。牙周病的發(fā)生發(fā)展與牙周微生態(tài)失衡及宿主的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)息息相關(guān)。牙周病的基礎(chǔ)治療方法主要是依靠機(jī)械方法去除菌斑生物膜，并常常輔以局部或全身用藥，但牙周致病菌的頻繁定植和口腔耐藥菌的出現(xiàn)對(duì)常規(guī)牙周病治療方法提出了挑戰(zhàn)。

益生菌一般來(lái)源于正常微生物菌群，可調(diào)節(jié)口腔局部生態(tài)平衡，改善全身免疫狀況，常用于調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)紊亂。在牙周病治療中，益生菌可作為一種替代性、補(bǔ)充性的生物制劑，通過(guò)調(diào)節(jié)牙周菌斑代謝，控制牙周病進(jìn)展。

1 牙周病與牙周微生態(tài)

牙周病是一種與微生物相關(guān)、宿主介導(dǎo)并導(dǎo)致牙周附著喪失的炎癥。牙周病對(duì)人體危害極大，是中老年人失牙的主要原因。早在1986年，Theilade[4]就提出了牙周病菌群失調(diào)學(xué)說(shuō)，1994年Marsh[5]提出了生態(tài)菌斑假說(shuō)，認(rèn)為牙周病并非某種特定的微生物感染導(dǎo)致，而是與口腔微生態(tài)失衡有關(guān)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與微生態(tài)學(xué)研究的深入，在牙周炎發(fā)生部位已檢出超過(guò)400種細(xì)菌[1]。目前學(xué)者們普遍認(rèn)為，與牙周病發(fā)生發(fā)展關(guān)系最為密切的細(xì)菌群落為紅色復(fù)合體，包括牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體；除紅色復(fù)合體之外，橙色復(fù)合體（包括普雷沃菌屬、具核梭桿菌屬、彎曲菌屬、直桿菌屬）在疾病和活動(dòng)性牙周病灶部位的檢出量較健康部位更高，與牙周袋深度和探診出血緊密相關(guān)[6]。不同類(lèi)型的牙周病患者檢出的微生物種類(lèi)有所差異。難治性牙周炎患者可以特異性檢出缺陷短波單胞菌、毗鄰顆粒鏈菌、非典型韋榮菌和鮑曼不動(dòng)桿菌，后者具有耐藥性，是難治性牙周炎的危險(xiǎn)因素[7]。在侵襲性牙周炎患者，溶桿菌、微小微單胞菌、二氧化碳嗜纖維菌的檢出豐度顯著高于其他類(lèi)型牙周炎[8-9]。嚴(yán)重牙周炎患者（牙周袋深超過(guò)6 mm）中，氨基酸球菌科的硒單胞球菌屬及巨型球菌屬是主要優(yōu)勢(shì)菌[10]，產(chǎn)線菌屬、毛螺菌屬、消化鏈球菌屬、丹毒絲菌屬、溶桿菌屬的檢出率也相應(yīng)上升。牙周微生態(tài)還可為牙周病治療的評(píng)估提供相關(guān)參考，Lu等[11]通過(guò)比較牙周基礎(chǔ)治療后3個(gè)月內(nèi)齦下微生物的變化情況，對(duì)采用超聲和甘氨酸噴砂兩種基礎(chǔ)治療方法治療牙周病的有效性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后齦下微生物的豐度和多樣性明顯降低，一些牙周致病微生物（包括密螺旋體屬和擬桿菌屬）明顯下降，而一些牙周共生菌如鏈球菌屬則明顯上升。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，在治療后3個(gè)月，牙周微生物的相對(duì)豐度基本恢復(fù)到了治療前的基線水平，由此可知，在3個(gè)月的維護(hù)期內(nèi)，牙周微生態(tài)可維持相對(duì)平衡。以上研究均提示，微生態(tài)失衡是導(dǎo)致牙周病發(fā)生發(fā)展的重要原因?？谇晃⑸锟赏ㄟ^(guò)直接黏附、定植、入侵牙周組織，抑制或逃避宿主的防御功能，對(duì)牙周組織造成破壞，最終導(dǎo)致牙周病的發(fā)生發(fā)展[12-13]。

2 牙周病的生態(tài)治療

2.1 牙周病的生態(tài)治療概述

牙周病的治療重點(diǎn)是清除和控制牙菌斑。目前主要的基礎(chǔ)治療方法包括齦上潔治術(shù)、齦下刮治術(shù)、根面平整術(shù)等，均是通過(guò)機(jī)械清除的方法去除牙菌斑；可以同時(shí)輔助使用藥物，以清除入侵組織深處的細(xì)菌，調(diào)節(jié)局部及全身的免疫防御功能[2]。牙周致病菌的頻繁定植和口腔耐藥菌的出現(xiàn)，對(duì)常規(guī)牙周病基礎(chǔ)治療來(lái)說(shuō)是非常不利的因素。為了克服這些不利因素，近年來(lái)微生態(tài)調(diào)節(jié)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)通過(guò)應(yīng)用靶向性多肽、靶向小分子、中藥提取物和多酚、噬菌體、益生菌等手段調(diào)節(jié)口腔局部生態(tài)平衡，并通過(guò)藥物改善全身情況，從而逆轉(zhuǎn)微生態(tài)失衡的狀況[14]。益生菌作為一種替代性、補(bǔ)充性的生物制劑，可通過(guò)調(diào)節(jié)牙周菌斑代謝以控制牙周病進(jìn)展，在牙周病防治中展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景。

2.2 益生菌在牙周病防治中的應(yīng)用

益生菌制劑種類(lèi)繁多，其菌種主要來(lái)源于宿主正常菌群中的生理性優(yōu)勢(shì)細(xì)菌、非常駐的共生菌和生理性真菌三大類(lèi)[15]。中國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)應(yīng)用于保健食品的主要益生菌種類(lèi)見(jiàn)表1[15]。

表1 中國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)應(yīng)用于人體的益生菌分類(lèi)Tab 1 Classification of probiotics for use in humans approved by National Health Commission of the People's Republic of China

目前用于輔助治療口腔疾病的益生菌主要分為兩大類(lèi)。一類(lèi)是首次分離自人體其他部位，后來(lái)發(fā)現(xiàn)也可從健康人群口腔中分離得到的益生菌菌種，如發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于消化道疾病的治療，其抗菌和抗炎效果已被證實(shí)。另一類(lèi)是從口腔中分離出的特異性益生菌菌種，如唾液鏈球菌K12（Streptococcus salivariusK12）、唾液鏈球菌M18等[16]。以上兩類(lèi)益生菌均在口腔感染性疾?。ㄈ琮x病、牙周病）的防治中有所應(yīng)用，并取得了較好的臨床療效。但目前對(duì)食品微生物菌種（microbial food cultures，MFC）的申報(bào)要求不一，管理方式各異，暫無(wú)統(tǒng)一且相互認(rèn)可的益生菌安全性評(píng)價(jià)方法體系[17]。因國(guó)內(nèi)目前暫無(wú)口腔益生菌的詳細(xì)管理指導(dǎo)，本文參考了聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）與世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的評(píng)估導(dǎo)則[18]，總結(jié)了目前已被完全或部分證實(shí)可應(yīng)用于口腔感染性疾病防治的益生菌種類(lèi)，見(jiàn)表2[19-26]。

Teughels等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，中至重度牙周炎患者通過(guò)服用含有羅伊氏乳桿菌的含片輔助牙周基礎(chǔ)治療（齦下刮治及根面平整）12周后，與接受牙周基礎(chǔ)治療和安慰劑的對(duì)照組相比，探診深度（probing depth，PD）和附著喪失（attachment loss，AL）程度明顯好轉(zhuǎn)。Shah等[28]比較牙周基礎(chǔ)治療與益生菌及抗生素輔助治療牙周基礎(chǔ)治療的差異，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用含有短乳桿菌的片劑，單獨(dú)使用抗生素或組合使用抗生素與短乳桿菌片劑輔助治療的效果均優(yōu)于只進(jìn)行牙周基礎(chǔ)治療組，PD、牙齦指數(shù)（gingival index，GI）、菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）、AL在治療2個(gè)月后都有明顯下降，且抗生素與益生菌制劑輔助治療相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Riccia等[29]直接應(yīng)用含有短乳桿菌的益生菌制劑治療未經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)治療的牙周病患者，發(fā)現(xiàn)使用該益生菌制劑后，牙周病患者的牙齦炎癥程度和牙結(jié)石沉積程度明顯降低；若初次就診時(shí)牙齦炎癥程度評(píng)估為輕或中度炎癥，在服用含有羅伊氏乳桿菌的益生菌制劑后，牙齦炎癥可以得到明顯緩解[30]。Shimauchi等[31]發(fā)現(xiàn)，使用含有唾液乳桿菌WB21片劑輔助治療有吸煙習(xí)慣的牙周病患者，其PD、PLI等評(píng)估指標(biāo)優(yōu)于安慰劑組，提示益生菌制劑對(duì)有吸煙習(xí)慣的牙周病患者可能有更好的治療效果。Lauritano等[32]研究了含有多種乳酸菌的益生菌制劑Reuterinos輔助治療種植體周?chē)椎呐R床療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用益生菌制劑4周后患者的GI明顯好轉(zhuǎn)，牙周致病菌數(shù)量顯著下降。

表2 完全或部分證實(shí)可應(yīng)用于口腔感染性疾病防治的益生菌種類(lèi)Tab 2 Totally or partially proven probiotic activity and mode of action on oral infectious diseases

3 益生菌防治牙周病的相關(guān)機(jī)制

3.1 益生菌調(diào)控口腔微生態(tài)

進(jìn)入口腔的益生菌可降低口腔中牙周病原菌數(shù)量，維持口腔微生態(tài)平衡。Mayanagi等[33]發(fā)現(xiàn)，唾液鏈球菌WB21可降低唾液中牙齦卟啉單胞菌和福賽斯坦納菌的檢出水平。K?ll-Klais等[34]發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌對(duì)牙周致病菌，包括中間普氏菌和牙齦卟啉單胞菌，表現(xiàn)出較高的抗菌活性。益生菌還可通過(guò)其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如乳酸、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素等，影響菌斑生物膜的形成，而菌斑生物膜是多種疾病發(fā)生的始動(dòng)因子。Krasse等[35]發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌表面存在黏附素，可增強(qiáng)其對(duì)口腔黏膜上皮的黏附作用，與牙周致病菌特異性競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)，阻止菌斑生物膜的形成。羅伊氏乳桿菌還可分泌一種稱為羅伊氏菌素（Reuterin）的非蛋白類(lèi)細(xì)菌素，具有廣譜抗菌特性，可有效抑制革蘭陽(yáng)性菌及陰性菌的生長(zhǎng)。還有學(xué)者[19,21]發(fā)現(xiàn)，唾液鏈球菌M18及唾液鏈球菌K12可阻斷病原菌的結(jié)合位點(diǎn)，阻礙病原菌黏附于口腔上皮。但體外研究[36]顯示不同益生菌對(duì)牙齦卟啉單胞菌、伴放線聚集桿菌等牙周致病菌的抗菌活性并不一致，Hallstr?m等[37]也發(fā)現(xiàn)，牙周病患者在服用羅伊氏乳桿菌含片后，其菌斑組成與對(duì)照組相比并無(wú)差異，故益生菌調(diào)控口腔微生態(tài)的詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2 益生菌調(diào)控口腔局部免疫

除了作用于牙周病原菌之外，益生菌也可抑制宿主對(duì)于牙周感染的免疫應(yīng)答，具有局部抗炎的功效。Twetman等[38]發(fā)現(xiàn)，使用含有羅伊氏乳桿菌的口香糖輔助治療牙周炎患者，其齦溝液中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8的水平較對(duì)照組明顯下降。?nce等[39]研究了益生菌輔助治療牙周炎患者齦溝液中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-8和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）-1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組齦溝液中的MMP-8含量顯著上升，而益生菌制劑處理組齦溝液中TIMP-1的含量顯著上升。Riccia等[29]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)益生菌制劑輔助治療后的慢性牙周炎患者，唾液中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的含量明顯降低。還有研究[40]發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者服用羅伊氏乳桿菌后，齦溝液中的促炎細(xì)胞因子（TNF-α和IL-17）的表達(dá)水平明顯降低。IL-6、TNF-α、IL-17是宿主單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有強(qiáng)致炎作用；MMP-8可水解蛋白質(zhì)，破壞膠原纖維，使結(jié)締組織破壞和牙周附著喪失；TIMP-1則是重要的炎癥因子抑制劑，可負(fù)向調(diào)控TNF-α的分泌；PGE2可刺激破骨細(xì)胞，造成破骨性骨吸收，導(dǎo)致骨喪失。由此可以發(fā)現(xiàn)，益生菌可通過(guò)抑制TNF-α、IL-6、IL-17、MMP-8、PGE2分泌，上調(diào)TIMP-1表達(dá)水平，從而抑制牙槽骨的炎性骨吸收，達(dá)到防治牙周炎發(fā)生發(fā)展的目的。

益生菌作用于口腔時(shí)，其局部抗炎效應(yīng)與直接抗菌作用可相互影響。當(dāng)前關(guān)于益生菌影響口腔內(nèi)的局部炎癥反應(yīng)的表型研究較多，但具體抗炎機(jī)制尚不清楚。Riccia等[29]利用人類(lèi)髓系白血病單核細(xì)胞（human myeloid leukemia mononuclear cell，THP-1）作為模式細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)體外研究，以直接觀察益生菌的抗炎效果。該研究使用牙齦卟啉單胞菌來(lái)源的細(xì)菌內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）刺激THP-1細(xì)胞，在培養(yǎng)上清液中檢出了較高水平的炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α；使用短乳桿菌CD2處理活化的THP-1細(xì)胞后，炎癥因子的產(chǎn)生被顯著抑制；進(jìn)一步使用短乳桿菌CD2提取物中精氨酸脫氫酶及該酶特異性抑制劑甲脒處理后，發(fā)現(xiàn)甲脒的存在使得該酶的作用完全或接近完全逆轉(zhuǎn)，該結(jié)果提示短乳桿菌CD2中含有的精氨酸脫氫酶是主要的抗炎物質(zhì)。該研究還發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌CD2提取物中的精氨酸脫亞胺酶可抑制由Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）-2及TLR-4激活引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)。體外研究[35]也證實(shí)，使用LPS刺激人單核細(xì)胞及成纖維細(xì)胞后，副干酪乳桿菌LPc-G110和植物乳桿菌GOS42的使用可在一定程度上抑制其分泌炎癥因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和PGE2。

3.3 益生菌調(diào)控宿主全身骨代謝

接受益生菌輔助治療的牙周病患者，服用的益生菌制劑不僅作用于口腔微生態(tài)，部分益生菌還可進(jìn)入胃腸道組織，參與維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)及機(jī)體的全身免疫功能，進(jìn)而參與調(diào)控骨重建等生理過(guò)程，抑制頜面部骨炎性吸收。研究[41]顯示，益生菌制劑可通過(guò)影響腸道菌群，增加腸道菌群代謝產(chǎn)物丁酸，促進(jìn)腸道內(nèi)和骨髓中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，激活T細(xì)胞介導(dǎo)調(diào)控的WNT10B信號(hào)通路，刺激骨生成。對(duì)于系統(tǒng)性疾病合并牙周病患者，如糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肥胖癥、骨質(zhì)疏松患者，以及絕經(jīng)后婦女，由于全身的免疫狀態(tài)已經(jīng)改變，牙周病引起的骨吸收情況往往較單純牙周病患者更為嚴(yán)重，牙周治療效果差，后期維護(hù)較為困難[42-43]。使用益生菌制劑輔助治療牙周炎時(shí)，從口腔進(jìn)入胃腸道的益生菌，可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)參與宿主全身的免疫功能及代謝，影響骨重建過(guò)程，延緩牙周的炎癥骨吸收。

4 益生菌制劑的安全性評(píng)價(jià)

益生菌制劑輔助牙周炎治療的研究是建立在多數(shù)情況下益生菌對(duì)人體是安全的，其致病可能性非常低這一基礎(chǔ)上。雖然近年來(lái)關(guān)于益生菌不良作用也有報(bào)道，包括由益生菌引起的菌血癥、感染性心內(nèi)膜炎和耐藥性問(wèn)題，但多為散發(fā)病例，缺乏大規(guī)模的流行病學(xué)資料，且感染病例多發(fā)于免疫力低下（器官移植和癌癥）患者[44]。在益生菌制劑輔助牙周炎治療的相關(guān)臨床研究中，受試者的選擇標(biāo)準(zhǔn)都明確排除了免疫力異常的情況。研究[44]發(fā)現(xiàn)，志愿者服用唾液鏈球菌K12，與安慰劑組的血液指標(biāo)無(wú)明顯不同，其主觀感受也無(wú)明顯差別。迄今為止，暫無(wú)由益生菌制劑輔助治療牙周炎引起不良反應(yīng)的報(bào)道，接受治療的牙周炎患者對(duì)相應(yīng)的治療結(jié)果基本表示滿意[27,33,40]。

5 研究展望

作為現(xiàn)有牙周疾病基礎(chǔ)治療的有效補(bǔ)充，益生菌制劑可輔助治療牙周病，盡管其具體治療機(jī)制尚未完全明確，但可以肯定的是，益生菌可抑制牙周病原菌生長(zhǎng)， 維持口腔及牙周微生態(tài)平衡，抑制宿主對(duì)牙周病原菌感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)，輔助牙周病的防治。同樣，進(jìn)入胃腸道組織的益生菌也參與了宿主全身的免疫功能調(diào)控。筆者所在課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，益生菌制劑灌胃飼養(yǎng)可抑制切除卵巢大鼠的牙槽骨吸收。深入研究益生菌通過(guò)影響腸道微生態(tài)進(jìn)而調(diào)控牙槽骨代謝的相關(guān)分子機(jī)制，有望為牙周病的防治提供新的臨床方法。

益生菌制劑在胃腸道疾病防治中的應(yīng)用已經(jīng)得到了數(shù)十年的發(fā)展，其治療指征、適用范圍、應(yīng)用種類(lèi)、具體劑量和益生菌的研發(fā)都有了詳盡的規(guī)范和指南?？谇蛔鳛槿梭w五大菌庫(kù)之一，現(xiàn)有益生菌的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)益生菌的研發(fā)相對(duì)滯后?，F(xiàn)有的關(guān)于益生菌輔助治療牙周病的基礎(chǔ)與臨床研究仍然參照了1999年由美國(guó)牙周病學(xué)會(huì)（American Academy of Periodontology，AAP）制定的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，包括慢性牙周炎、侵襲性牙周炎等內(nèi)容。2018年歐洲牙周病聯(lián)合會(huì)（European Federation of Periodontology，EFP）與AAP制定了新的牙周疾病分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[45]。新分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)根據(jù)牙周炎的嚴(yán)重程度以及復(fù)雜程度進(jìn)行分期和分級(jí)。在新分類(lèi)的指導(dǎo)下，益生菌制劑輔助治療牙周病的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)更為詳盡，其適用情況、應(yīng)用種類(lèi)、具體劑量、使用周期等都有待進(jìn)一步的研究證實(shí)，并亟需建立更為精準(zhǔn)的臨床應(yīng)用規(guī)范。