曾芳俐 張 磊* 李 敏 馮 華 李寶忠

1.貴州省遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴州 遵義 563002; 2.貴州省遵義市播州區(qū)中醫(yī)院藥學(xué)部，貴州 遵義 563100

祛毒膠囊處方由葛根、梔子、桃仁、赤小豆、山楂、紅花、牡蠣、薏苡仁、大黃九味中藥材組成[1]，具有清熱解毒、活血祛瘀、通便瀉火的功效，用于血瘀熱結(jié)證所致濕瘡、膚癢、潮紅、皰疹、滲出等癥。作為中藥復(fù)方制劑,具有藥味較多，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)只對山楂藥材做熊果酸對照定性鑒別。因此，筆者對祛毒膠囊中梔子藥材進行定性與定量分析，建立定性與定量檢驗方法，可作為祛毒膠囊中梔子藥材內(nèi)控制指標(biāo)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津 LC-20AD高效液相色譜議(包括二元泵，紫外檢測器，柱溫箱，自動進樣器，Shimadzu 分析儀器工作站和處理軟件)，Diamosil?C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱；AB265-S型梅特勒電子天平(北京中恒日鑫科技有限公司)，KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 梔子對照藥材、梔子苷對照品(購于中國食品藥品檢定研究院，批號分別：120986-201610、110749-200714)，乙腈為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20180400)，水為娃娃哈純凈水，其他試劑均為分析純，3批祛毒膠囊(批號分別為：161201、171101、180901)遵義市中醫(yī)院購買，陰性樣品自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別[2-3]取樣品約2.0 g，加50%甲醇10 mL,超聲處理40 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取梔子對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液，再取梔子苷對照品，加甲醇制成每1 mL含4 mg的溶液，作為對照品溶液。同樣品制法制成陰性樣品溶液。吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠H板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在日光下檢視，于對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的黃色斑點；再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點清晰，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)果表明，分離度好，斑點顯色清晰，而陰性無干擾。如圖1所示。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件[2,4-6]Diamosil?C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱，乙腈-0.1%磷酸(12∶88)為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長為238 nm，柱溫30 ℃。進樣量10 μL，相連兩峰分離度應(yīng)符合規(guī)定，理論塔板數(shù)按梔子苷峰計，應(yīng)不低于1500。

未顯色 日光下檢視 顯色后1～3 樣品 4.對照藥材 5.陰性樣品 S.梔子苷對照圖1 TLC薄層色譜圖

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取梔子苷照品適量，加甲醇溶解制成含梔子苷0.170m g/mL的對照品溶液，搖勻，用0.45 μm 的微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取內(nèi)容物約1.6g(批號：180901),精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，超聲處理40 min，取出，放冷，用甲醇補足重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性溶液制備 取缺梔子藥材處方下自制陰性樣品，按“2.2.3”項下供試品溶液制備方法制備成陰性對照溶液。精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按照色譜條件下測定，結(jié)果表明陰性對照的色譜圖在葛根素相應(yīng)的保留時間無干擾峰。如色譜圖2、圖3、圖4所示。

圖2 對照HPLC圖譜

圖3 供試品HPLC圖譜

圖4 陰性樣品HPLC圖譜

2.2.5 線性關(guān)系的考察 精密吸取對照品混合溶液2 μL、6 μL、10 μL、14 μL、18 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，分別以梔子苷濃度(mg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，回歸方程分別為：Y=320744X-16664，R=0.9999；在0.340～ 3.060 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，連續(xù)測定6次，記錄峰面積，結(jié)果梔子苷峰面積的RSD為0.81%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 分別吸取(批號180901)同一供試品溶液于0、4、8、12、16、20、24 h，精密吸(批號180901)樣品制備的供試品溶液10 μL進樣，測得峰面積，RSD均值為0.14%，表明在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(批號180901)6份，精密稱定，按照“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液。測定峰面積，計算梔子苷平均含量為2.05 mg/g，RSD為0.23%，結(jié)果表明重復(fù)性好。

2.2.9 加樣回收試驗 取(已知含量含梔子苷2.05 mg/g)的樣品6份，每份約0.8 g，精密稱定，精密稱取梔子苷對照品適量，按“2.2.3”項下的方法操作，計算回收率,梔子苷平均回收率為100.66%、RSD為0.34%。見表1。

2.2.10 3批樣品含量測定結(jié)果 詳見表2。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

表2 祛毒膠囊3批樣品含量測定結(jié)果

3 討論

通過祛毒膠囊中梔子苷的研究。筆者增加梔子藥材中梔子苷作為對照，進行定性與定量分析。在TLC中以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開劑[2]，展開效果好，與各斑點均能有效分離，斑點顯色清晰，且陰性無干擾；采用HPLC法測定處方中梔子藥材有效成分梔子苷[4-6]，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)保留時間陰性無干擾。

對甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、乙睛-水、乙睛-磷酸溶液4個系統(tǒng)的流動相考察結(jié)果表明，乙睛-0.1%磷酸溶液效果最好。同時采用DAD檢測器進行紫外區(qū)全波長掃描，在250 nm、238 nm波長下有最大吸收，根據(jù)所測目標(biāo)峰在238 nm波長下檢測，分離好，峰面積較大，因此選擇238 nm為本實驗的檢測波長。

綜上所述，所建立TLC法和HPLC法，樣品處理簡單，分析速度快，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為祛毒膠囊中梔子藥材控制打下基礎(chǔ)。